李慧，李曉琳*，李金龍，李保玲，劉文君，史新芮

（1.哈爾濱體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

（2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

近年來，人們生活水平不斷提高，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，膽固醇過量引起的心腦血管疾病已經(jīng)嚴(yán)重危害到人體健康[1]。目前國內(nèi)外降低人體膽固醇的主要方式是藥物治療，但其存在副作用多及費(fèi)用高的弊端[2]。因此，需要探尋更加安全、高效的方法來減輕膽固醇過高導(dǎo)致的心腦血管疾病對(duì)人類的危害。

乳酸菌作為人體腸道中的正常菌群，具有抑制病原菌、調(diào)節(jié)腸道菌群、免疫和抗腫瘤等活性，對(duì)機(jī)體有著重要的益生作用[3-5]。19世紀(jì)70年代，研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)常飲用由乳桿菌發(fā)酵的乳制品的美國人及非洲馬賽人體內(nèi)血清膽固醇水平普遍較低[6]，這為探索降低膽固醇水平的新策略提供了方向?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，乳酸菌及其發(fā)酵制品具有降低血清膽固醇的能力[7,8]。因此，篩選能夠降膽固醇的乳酸菌，進(jìn)一步應(yīng)用于研發(fā)具有降膽固醇功能的益生菌產(chǎn)品具有重要意義。

乳酸菌作為天然菌群廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵，其應(yīng)用于面團(tuán)發(fā)酵能夠增強(qiáng)面團(tuán)的流變特性，改善面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)特性，更重要的是增加面團(tuán)中淀粉和蛋白質(zhì)的利用率，提高面團(tuán)的營養(yǎng)價(jià)值[9,10]。盡管自然發(fā)酵面團(tuán)用于發(fā)酵傳統(tǒng)面食可以追溯到13世紀(jì)，但其中作為影響發(fā)酵面食品質(zhì)最主要因素的乳酸菌的具體功能并沒有得到很好的研究。本研究以自然發(fā)酵面團(tuán)中分離出的乳酸菌為研究對(duì)象，篩選出了一株體外降膽固醇效果最佳的發(fā)酵乳桿菌，該菌株同時(shí)具有耐酸耐膽鹽和抑制致病菌的特性，進(jìn)一步采用高脂模型小鼠研究該菌株在體內(nèi)的降血脂功能，以期為將來降膽固醇益生菌制品的研制和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

20個(gè)自然發(fā)酵面團(tuán)分別收集自黑龍江省哈爾濱市周邊不同農(nóng)戶家庭。大腸桿菌O157（882364株）、金黃色葡萄球菌CGMCC 1.291及鼠傷寒沙門氏菌S50333均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。MRS培養(yǎng)基和乳酸菌生化鑒定試劑盒，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；膽固醇和牛膽鹽均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；血清總膽固醇（TC）、肝臟TC、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料：8周齡雄性C57BL/6J小鼠購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，普通飼料和高膽固醇飼料購自北京科澳協(xié)力有限責(zé)任公司，高膽固醇飼料組成如下（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：基礎(chǔ)飼料83.7%、豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1%和膽鹽0.3%。

1.2 主要儀器

PCR儀，TaKaRa公司；小型離心機(jī)，Eppendorf公司；pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡，日本奧林巴斯公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；超微量紫外分光光度計(jì)，德國Implen公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 乳酸菌的分離鑒定

采用平板涂布法，將20 g自然發(fā)酵面團(tuán)用生理鹽水溶解后取500 μL加入4.5 mL MRS培養(yǎng)基中，進(jìn)行10倍體積梯度稀釋，各取100 μL 105～107的稀釋液涂布于MRS平板，分別于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取不同形態(tài)的單菌落，連續(xù)劃線分離純化，直至獲得大小、形態(tài)一致的菌落。參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)、并利用過氧化氫酶接觸試驗(yàn)、乳酸菌生化鑒定試劑盒鑒定生化特性[11]。然后，利用試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，設(shè)計(jì)合成引物序列如下：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’）[12]，利用PCR擴(kuò)增16S rRNA序列，將擴(kuò)增結(jié)果使用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 乳酸菌益生特性分析

1.4.1 乳酸菌耐酸耐膽鹽評(píng)價(jià)

用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH值至3.0和6.5，將100 μL過夜培養(yǎng)的乳酸菌加入5 mL不同pH的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃孵育4 h，測定OD600nm值[13]。配置含0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基，以不含膽鹽的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，兩種培養(yǎng)基各接種1%的乳酸菌，37 ℃孵育4 h，測定OD600nm值。生長速率計(jì)算方法見公式（1）[14]。

式中：

G——生長率，%；

A1——無膽鹽培養(yǎng)基OD600nm值；

A2——對(duì)照培養(yǎng)基OD600nm值。

上述試驗(yàn)對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 乳酸菌抑菌能力分析

利用牛津杯試驗(yàn)分析乳酸菌對(duì)致病菌的抑菌能力[15]。將15 mL 1.5%（m/V）瓊脂培養(yǎng)基倒在平板上并凝固，放置好6 mm牛津杯。在45～50 ℃條件下，將每株病原菌按照1%比例接種于15 mL 0.8%（m/V）的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻。傾倒上層瓊脂培養(yǎng)基并凝固，取出牛津杯后將100 μL乳酸菌培養(yǎng)物加入空孔中。將平板在室溫下靜置，然后在37 ℃下孵育18～24 h后用游標(biāo)卡尺測量平板上的抑菌環(huán)直徑。

1.5 乳酸菌安全性評(píng)估

1.5.1 溶血性試驗(yàn)

將活化兩次后的乳酸菌菌株于哥倫比亞綿陽血瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，拍照記錄菌落周圍形態(tài)，以金黃色葡萄球菌做為陽性對(duì)照。

1.5.2 抗生素敏感試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)所有分離的乳酸菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[16]。分別選擇如下抗生素：紅霉素（15 μg）、鏈霉素（10 μg）、氯霉素（30 μg）、慶大霉素（10 μg）、克林霉素（2 μg）和氨芐青霉素（10 μg），在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后測量抑菌圈的直徑，使用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的指導(dǎo)原則（CLSI 2014）對(duì)乳酸菌的抗性進(jìn)行分析。

1.6 乳酸菌體外降膽固醇能力測定

參照Liu等[17]的方法繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定乳酸菌的OD值，對(duì)乳酸菌的體外降膽固醇能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用無水乙醇溶解膽固醇配置成0.1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液。按照膽固醇終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL取適量標(biāo)準(zhǔn)液用無水乙醇補(bǔ)齊總體積至2 mL，再緩慢加入等體積的顯色劑（硫酸鐵銨），充分振蕩混勻后室溫靜置30 min，測定OD560nm值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 乳酸菌OD值的測定

將乳酸菌菌株活化兩次后6 000 r/min離心10 min，用無菌PBS洗滌菌體后制成菌懸液，按照2%的接種量接種至新鮮配制的降膽固醇篩選培養(yǎng)基（MRS-CHOL培養(yǎng)基）中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，取0.2 mL培養(yǎng)液加入到4.8 mL無水乙醇中振蕩混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液測定OD560nm值，以鄰苯二甲醛比色法測定膽固醇含量，同時(shí)以未接菌的MRS-CHOL培養(yǎng)基作為對(duì)照。

式中：

D——膽固醇去除率，%；

A3——未接菌上清液OD560nm值；

A4——接菌后上清液OD560nm值。

1.7 乳酸菌對(duì)高脂飲食小鼠的影響

1.7.1 小鼠分組和灌喂方法

選取8周齡雄性C57BL/6J小鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按表1飼喂方式分為5組，連續(xù)喂食5 w。將活化后的乳酸菌菌株FD-8，用生理鹽水洗滌2次并將菌體濃度分別調(diào)整至1010、108和106CFU/mL，用于小鼠灌喂試驗(yàn)，每天現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 小鼠分組及飼喂方式Table 1 Grouping of the mice and feeding method

1.7.2 小鼠體質(zhì)量增加量、攝食量及飼料利用率測定

灌喂開始后每天固定時(shí)間記錄小鼠攝食量，每周同一時(shí)間稱量小鼠體質(zhì)量，計(jì)算小鼠的飼料利用率，見公式（3）。

式中：

S——飼料利用率，%；

M增——小鼠質(zhì)量增加量，g；

M食——攝食量，g。

1.7.3 小鼠臟器指數(shù)的測定

小鼠灌喂5 w后禁食12 h，處死后立即摘除心臟、肝臟、脾臟和腎臟，生理鹽水清洗后用濾紙吸凈水分，將分離到的各器官進(jìn)行稱重，按公式（4）計(jì)算臟器指數(shù)。

式中：

F——臟器指數(shù)，mg/g；

M臟——各臟器質(zhì)量，mg；

M——小鼠處死前質(zhì)量，g。

1.7.4 小鼠血液樣品的采集與測定

小鼠飼養(yǎng)5 w后，眼眶靜脈叢采血，常規(guī)方法分離血清，用試劑盒檢測小鼠血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

1.7.5 肝臟TC、TG含量的測定

精確稱量0.1 g肝臟組織，添加到9倍體積的生理鹽水中，將肝臟組織充分勻漿后，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液測定肝臟的TC和TG水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過Graph Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05，差異顯著；p＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離及鑒定結(jié)果

表2 乳酸菌分離株的種屬及耐酸耐膽鹽情況Table 2 The acid and bile salt tolerance of the lactic acid bacteria isolates of various species

自然發(fā)酵面團(tuán)中含有多個(gè)菌種[18]。但研究顯示，其中的細(xì)菌組成相對(duì)簡單，主要以乳酸菌和酵母菌為主[19]。本研究將自然發(fā)酵面團(tuán)稀釋液涂布平板，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)革蘭氏染色和生化鑒定篩選出16株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、有典型形態(tài)和生化特性的乳酸菌，經(jīng)16S rRNA測序比對(duì)，這16株菌株中有植物乳桿菌5株、發(fā)酵乳桿菌5株、戊糖片球菌3株、乳酸片球菌2株和短乳桿菌1株，說明乳桿菌是自然發(fā)酵面團(tuán)在自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種。乳酸菌進(jìn)入人體發(fā)揮益生作用的必須條件之一是能耐受胃酸環(huán)境以及腸道的高濃度膽鹽環(huán)境，這也是乳酸菌菌株應(yīng)用于醫(yī)藥或者商業(yè)用途的重要限制性因素之一[20]。對(duì)分離得到的16株乳酸菌進(jìn)一步進(jìn)行耐酸耐膽鹽分析，結(jié)果如表2所示，以30%存活率為界限，其中6株乳酸菌對(duì)酸性及膽鹽環(huán)境均有良好的耐受能力，且不同菌株之間有一定的差異，在酸性條件下的存活率在42.98%～81.75%之間，而在膽鹽條件下的存活率在55.24%～77.26%之間，進(jìn)一步選取這6株符合條件的候選菌株開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 乳酸菌分離株的益生特性

隨著對(duì)抗生素耐藥性的普遍關(guān)注，乳酸菌對(duì)病原菌的抑菌活性也受到了廣泛的關(guān)注，成為評(píng)價(jià)其益生特性的重要指標(biāo)之一[21]。從表3乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株乳酸菌均對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，其中發(fā)酵乳桿菌FD-13對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，F(xiàn)D-8對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，二者的抑菌圈直徑均大于15 mm。除FD-4以外的5株菌株對(duì)鼠傷寒沙門氏菌均有抑制作用，F(xiàn)D-8對(duì)其抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑約14.69 mm。以上結(jié)果表明，本研究篩選得到的6株乳酸菌對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原菌均具備不同程度的抗菌活性，其中菌株FD-8和FD-13的抑菌活性最強(qiáng)。

表3 乳酸菌對(duì)致病菌的抑制作用Table 3 The inhibitory effects of selected lactic acid bacteria strains against pathogenic microorganisms

2.3 乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)

在應(yīng)用安全方面，傳統(tǒng)的乳酸菌菌種已有很長的歷史，由于大多數(shù)乳酸菌菌種是從食品或健康動(dòng)物腸道內(nèi)分離出來的，因此被認(rèn)為是沒有致病可能性的食品級(jí)安全微生物[22]。但對(duì)通過不同方法得到的乳酸菌菌株在應(yīng)用前做嚴(yán)格的安全性檢測仍是十分必要的。溶血試驗(yàn)的結(jié)果顯示，培養(yǎng)基上的金黃色葡萄球菌周圍出現(xiàn)了透明溶血環(huán)（圖1g），為β-溶血，6株乳酸菌菌株未產(chǎn)生溶菌環(huán)（圖1a～1f）。6株分離菌株對(duì)常見的幾種抗生素均表現(xiàn)一定的敏感性（表4）。

圖1 乳酸菌的溶血性（2×）Fig.1 The hemolytic activity of six lactic acid bacteria (2×)

表4 乳酸菌的抗生素敏感性Table 4 Antibiotic sensitivity of lactic acid bacteria

2.4 體外篩選降膽固醇的乳酸菌

圖2 乳酸菌的體外降膽固醇率測定Fig.2 Determination of cholesterol-lower in grate of lactic acid bacteria in vitro

國內(nèi)針對(duì)乳酸菌降膽固醇作用及機(jī)理研究的起步比國外同行晚，且大多局限于體外試驗(yàn)[23,24]。測定乳酸菌菌株在高膽固醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)酵液上清中膽固醇的減少量是確定乳酸菌是否具有降膽固醇特性的主要方法[25]。為了比較上述6株乳酸菌分離株的降膽固醇能力，本試驗(yàn)利用該方法測定候選乳酸菌的膽固醇降解率，首先以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中膽固醇濃度在0～1 mg/mL的范圍內(nèi)，吸光度與膽固醇濃度呈良好的線性關(guān)系。圖2表示利用領(lǐng)苯二甲醛比色法測得的6株乳酸菌的體外膽固醇降解率。結(jié)果顯示，所有乳酸菌的體外膽固醇降解率都達(dá)到45%以上，其中乳酸菌FD-8對(duì)膽固醇降解率最高（85.66%），而乳酸菌FD-4的膽固醇降解率最低（47.66%），因此選擇FD-8菌株開展下一步的體內(nèi)試驗(yàn)。

2.5 乳酸菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠的影響

2.5.1 乳酸菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響

如表5所示，在試驗(yàn)進(jìn)行5 w后，對(duì)照組小鼠的最終體質(zhì)量平均為33.26 g，而高脂模型組小鼠的平均體質(zhì)量明顯增高達(dá)到38.59 g（p＜0.05），說明成功建立了小鼠的高脂模型。不同濃度乳酸菌FD-8飼喂組小鼠的體質(zhì)量、攝食量、飼料利用率與對(duì)照組相比無顯著差異（p＞0.05）。灌喂不同濃度乳酸菌FD-8的小鼠平均體質(zhì)量分別為33.01、33.72和34.08 g，顯著低于高脂模型組小鼠（p＜0.05），說明FD-8對(duì)高脂小鼠體質(zhì)量增加具有明顯抑制作用，其中高劑量的FD-8對(duì)體質(zhì)量抑制作用更大。同時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)過程中，各組小鼠均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)和非正常死亡現(xiàn)象，表明乳酸菌FD-8飼喂對(duì)小鼠不會(huì)產(chǎn)生不良影響。

2.5.2 乳酸菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠臟器指數(shù)的影響

從表6中可以看出，飼喂高脂飼料5 w后，高脂模型組小鼠的肝臟指數(shù)為5.63 mg/g，比對(duì)照組小鼠的肝臟指數(shù)4.89 mg/g顯著升高了0.74 mg/g（p＜0.05），表明高脂飼料中的膽固醇有一部分在肝臟組織內(nèi)沉積下來而沒有得到完全代謝，導(dǎo)致肝臟的質(zhì)量增加[25]；高劑量和中劑量乳酸菌飼喂組小鼠的肝臟指數(shù)分別為4.75 mg/g和4.98 mg/g，顯著低于高脂模型組小鼠（p＜0.05），這說明灌喂一定劑量乳酸菌FD-8可以減少脂類在小鼠肝臟內(nèi)的沉積；而心臟、脾臟和腎臟的指數(shù)無顯著差異（p＞0.05）。

表5 小鼠的體質(zhì)量增加量、攝食量和飼料利用率Table 5 Body weight, total food intake, and food efficiency of mice in different groups

表6 各組小鼠的臟器指數(shù)Table 6 Organ indices of mice in each group (mg/g)

表7 小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量Table 7 TC, TG, HDL-C, and LDL-C contents in serum of mice in different groups (mmol/L)

2.5.3 乳酸菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠血脂水平的影響

TC是衡量脂代謝的重要指標(biāo)，代表了血清中含有的膽固醇總和[26]，而TG由長鏈脂肪酸和甘油組成，主要存在于心臟和肝臟，是引起人體病變的重要因素之一[27]。LDL-C作為含膽固醇的脂蛋白是內(nèi)源性膽固醇的載體，LDL-C濃度越高，冠心病的發(fā)病率就越高[28]。本試驗(yàn)中，不同濃度乳酸菌飼喂組小鼠的TC、TG和LDL-C含量均顯著低于高脂模型組（p＜0.05），表明乳酸菌FD-8具有抑制血清中TC、TG和LDL-C含量增加的作用，其中高濃度FD-8飼喂組的效果更明顯，TG含量為1.26 mmol/L，LDL-C含量為0.60 mmol/L，均是各組中最低的（表7）。對(duì)于HDL-C含量來說，各組之間小鼠的HDL-C含量沒有顯著差異（p＞0.05），表明灌喂乳酸菌FD-8對(duì)血清HDL-C含量沒有明顯作用。已有研究表明，乳酸菌可以降低血清TC、TG 和LDL-C含量，而對(duì)HDL-C的作用較小[29]，這與我們?cè)囼?yàn)的結(jié)果相一致。

2.5.4 乳酸菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，高脂飲食會(huì)引起肝損傷。因此，為了進(jìn)一步研究發(fā)酵乳桿菌FD-8對(duì)高脂飲食小鼠肝臟的影響，測定了肝臟中TC和TG的含量。與預(yù)期的結(jié)果一致的是，試驗(yàn)進(jìn)行5 w后，高脂模型組小鼠肝臟中TC和TG含量分別達(dá)到0.13 mmol/g和2.86 mmol/g，顯著高于對(duì)照組小鼠0.08 mmol/g和1.63 mmol/g（p＜0.05）；乳酸菌灌喂后小鼠的肝臟中TC和TG含量則顯著降低（p＜0.05），高濃度乳酸菌組的小鼠TC含量降至0.07 mmol/g，TG含量降至1.15 mmol/g，說明灌喂乳酸菌FD-8可以促進(jìn)體內(nèi)膽固醇代謝，減少膽固醇在高脂小鼠肝臟中的存積（見表8）。

表8 小鼠肝臟總膽固醇和甘油三酯含量Table 8 TC and TG contents in livers of mice in different groups (mmol/g)

3 結(jié)論

自然發(fā)酵面團(tuán)是一種有著悠久應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑，而乳酸菌構(gòu)成了其主要菌種。本研究從哈爾濱周邊農(nóng)戶家的自然發(fā)酵面團(tuán)中分離得到一株發(fā)酵乳桿菌FD-8，經(jīng)分析該菌株具備良好的耐酸、耐膽鹽及抑菌活性，同時(shí)無溶血性且對(duì)某些抗生素具備一定敏感性，更重要的是能夠發(fā)揮體外降膽固醇作用和降低高脂飲食小鼠血脂的作用，為進(jìn)一步開發(fā)降膽固醇功能性乳酸菌制品及其他功能性食品提供了理論依據(jù)。