高習清，盧光照，魯 瑩，鄒 豪

（海軍軍醫(yī)大學藥學系藥劑學教研室, 上海 200433）

近紅外光響應的腫瘤光熱治療因具有組織穿透性強、生物安全性好等優(yōu)點，已引起廣泛關(guān)注。作為新興的光敏劑，八丁氧基酞菁鈀具有成本低、易合成、毒性低等優(yōu)點，在腫瘤光動力治療(PDT)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力。由于高滲透強滯留效應(EPR)，脂質(zhì)體作為藥物載體可靶向集中于腫瘤組織，同時ROS 可氧化破壞脂質(zhì)雙層膜，促進包載藥物在腫瘤組織的精準釋放。本實驗以雷帕霉素為模型藥物，采用課題組合成的八丁氧基酞菁鈀為光敏劑，制備近紅外光觸發(fā)的ROS 響應型雷帕霉素脂質(zhì)體，并對其理化性質(zhì)及體外釋放特性進行考察。

1 材料與方法

1.1 儀器

R206D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；730 nm/1 500 mW 激光器(長春市亮麗光電有限公司)；U3000 高效液相色譜儀(Thermo Fisher 公司)；JY92.IIDN 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；馬爾文激光粒度儀(英國Malvern公司)。

1.2 試劑

二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC，Avanti 公司)；1,2-二亞油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DLPC，Avanti公司）；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000，Lipoid 公司)；膽固醇、雷帕霉素（MCE 公司）、八丁氧基酞菁鈀[PdPC(OBu)8，實驗室自制]；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone 公司）。

1.3 脂質(zhì)體的制備[1]

采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體。精密稱取DSPC、DLPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000、雷帕霉素、八丁氧基酞菁鈀置于250 ml 圓底燒瓶中，加入適量氯仿溶解。65 ℃水浴，65 r/min 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻薄膜，取PBS 溶液4 ml 水化。吸出脂質(zhì)體，用PBS 稀釋至5 ml，200 W 探頭超聲5 min，即得近紅外光觸發(fā)ROS 響應型雷帕霉素脂質(zhì)體。空白脂質(zhì)體除不加雷帕霉素、八丁氧基酞菁鈀外，制備方法相同。

1.4 脂質(zhì)體處方篩選

以脂質(zhì)體成膜及水化效果、藥物包封率及載藥量、包載藥物光敏釋放效率為指標，從DLPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000處方量及PdPC(OBu)8投藥量對光敏ROS 脂質(zhì)體處方進行單因素考察。

1.5 粒徑、PDI 及Zeta 電位

取少量脂質(zhì)體溶液，用去離子水稀釋，使用馬爾文激光粒度儀測量脂質(zhì)體粒徑、PDI 及Zeta電位。

1.6 雷帕霉素含量測定[2]

1.6.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（84∶16）；流速1.0 ml/min；檢測波長：278 nm；柱溫：50 ℃；進樣量：20 μl。

1.6.2 標準曲線繪制

精密稱取雷帕霉素2.50 mg 置于10 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為250 μg/ml 儲備液。精密吸取儲備液800、400、200、100、40、20、10、4 μl，分別于5 ml 容量瓶中用甲醇定容。制成濃度為40、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/ml 的對照品溶液。HPLC 儀檢測并記錄峰面積A，繪制出峰面積A與對照品質(zhì)量濃度C的標準曲線并進行線性回歸分析。

1.6.3 專屬性考察

吸取雷帕霉素脂質(zhì)體溶液500 μl 加入5 ml 容量瓶中，甲醇定容至刻度。超聲20 min 破乳后，以10 000 r/min 進行超速離心10 min。取適量上清液過0.45 μm 有機膜，制得供試品溶液。吸取空白脂質(zhì)體按同法制備陰性對照品溶液。分別取對照品、陰性對照品、供試品按照“1.6.1”項下方法進樣，記錄HPLC 圖。

1.6.4 精密度

選取低、中、高3 個濃度的對照品溶液，1 d 內(nèi)重復進樣考察日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d 每天測定一次，考察日間精密度。

1.6.5 提取回收率

吸取用于制備選定的低、中、高3 個濃度對照品溶液的儲備液于不同的5 ml 容量瓶中，同一濃度共制備3 個樣品。向每個容量瓶中加入100 μl空白脂質(zhì)體溶液，再用甲醇定容至刻度。超聲20 min 破乳后，進行超速離心，10 000 r/min，10 min。取適量上清液過0.45 μm 有機膜，進行HPLC 檢測。

1.7 包封率及載藥量

包封率與載藥量是評價脂質(zhì)體的重要指標。包封率是脂質(zhì)體中包封藥物量與脂質(zhì)體中藥物總量的百分比。載藥量是脂質(zhì)體中藥物量與脂質(zhì)體總量的百分比。

精密吸取脂質(zhì)體500 μl 置于5 ml 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度。超聲20 min 破乳后，再進行超速離心，10 000 r/min，10 min。取適量上清液過0.45 μm 有機膜，進行HPLC 檢測，計算得出脂質(zhì)體中藥物總量。

精密吸取適量脂質(zhì)體溶液，先進行低速離心[3]，3 000 r/min，15 min。取上層液體500 μl 置于5 ml容量瓶中用甲醇稀釋至刻度。超聲20 min 破乳后，再進行超速離心，10 000 r/min，10 min。取適量上清液過0.45 μm 有機膜，進行HPLC 檢測，計算出脂質(zhì)體中包封藥物量。

1.8 體外釋放實驗[2]

采用反向透析法測定雷帕霉素脂質(zhì)體光敏釋放特性。以30 ml 20%乙醇為釋放介質(zhì)，加入50 ml離心管內(nèi)；另吸取1 ml 釋放介質(zhì)并加入透析袋內(nèi)，將透析袋兩端扎緊后放入離心管中；取300 μl 雷帕霉素脂質(zhì)體，用730 nm，1 W/cm2近紅外光照射5 min 后，轉(zhuǎn)移至釋放介質(zhì)；將離心管移至搖床內(nèi)，設(shè)置搖床條件為37 ℃，180 r/min。分別在1、2、4、8、12 h 從透析袋內(nèi)取樣200 μl，用于樣品測定和累積釋放率的計算。取樣后即補加新鮮釋放介質(zhì)200 μl，保持釋放介質(zhì)總量不變。以時間(t)為橫坐標，以累積釋放率(Q%)為縱坐標，繪制釋放曲線。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素的含量測定

2.1.1 標準曲線的繪制

回歸方程為A= 0.624 0C-0.173 8 （r= 0.999 5）。雷帕霉素在0.2～40 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 專屬性考察

按照“1.6.1”項下色譜條件測定，雷帕霉素出峰良好，保留時間為7.8 min。表明此方法專屬性良好（圖1）。

圖1 雷帕霉素的專屬性

2.1.3 精密度考察

由表1 可知，雷帕霉素在低、中、高3 個濃度都具有較好的準確度，日間精密度和日內(nèi)精密度值均小于5%，表明該方法可用于雷帕霉素的含量測定。

表1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度( x±s ，n=3)

2.1.4 提取回收率

由表2 可知，雷帕霉素在低、中、高3 個濃度的回收率為97.64%～98.62%，符合95%～105%的范圍，且RSD 值均小于1%，表明該提取方法穩(wěn)定可靠。

表2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率( x±s ，n=3)

2.2 脂質(zhì)體處方單因素考察

2.2.1 DLPC 用量

由表3 可知，包含不同摩爾量DLPC 的處方制得的脂質(zhì)體，成膜及水化效果較好，粒徑＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，載藥量＞1%；脂質(zhì)體體外釋放試驗，光照12 h 后，測得雷帕霉素藥物累積釋放率＞60%（圖2A）。當DLPC 含量較低時（DSPC∶DLPC=69∶1），雷帕霉素釋放速率明顯低于其他處方。隨著DLPC 含量的增加，雷帕霉素釋放速率及12 h 內(nèi)累積釋放率并無明顯增加。

表3 不同摩爾量DLPC 脂質(zhì)體的表征

2.2.2 膽固醇用量

由表4 可知，PC（DSPC+DLPC）與膽固醇之比過大（70∶10）或過?。?0∶40），脂質(zhì)體都不能成膜。當PC 與 膽 固 醇 之 比 為70∶20、70∶25、70∶30 時，所得脂質(zhì)體成膜及水化效果較好，粒徑＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，載藥量在1%左右。在進行脂質(zhì)體體外釋放實驗中，測得12 h 后雷帕霉素藥物累積釋放率＞60%（圖2B）。

2.2.3 DSPE-mPEG2000的用量

由表5 可知，當DSPE-PEG2000用量較小時，脂質(zhì)體不能成膜。當PC 與DSPE-PEG2000之比為70∶5、70∶10、70∶15 時，所得脂質(zhì)體成膜及水化效果較好，粒徑＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，載藥量＞1%。在進行的12 h 脂質(zhì)體體外釋放實驗中，摩爾比70∶5 組測得雷帕霉素藥物累積釋放率＞60%，其余兩組藥物累積釋放率在33%左右（圖2C）。

2.2.4 PdPC(OBu)8的用量

由表6 可知，當PdPC(OBu)8用量較大（質(zhì)量比1∶50），脂質(zhì)體不能成膜。當PdPC(OBu)8與PC 質(zhì)量之比為1∶100、1∶200、1∶300、1∶400，測 得 粒 徑＜200 nm，PDI＜0.2，雷 帕 霉 素 包 封 率＞90%，載藥量＞1%。在進行的12 h 脂質(zhì)體體外釋放實驗中，質(zhì)量比1∶100、1∶200 組釋放效率高于其余兩組，在60%左右（圖2D）。

表4 不同摩爾量膽固醇脂質(zhì)體的表征

圖2 雷帕霉素光敏釋放特性考察

表5 不同摩爾量DSPE-PEG2000 脂質(zhì)體的表征

表6 不同用量PdPC(OBu)8 脂質(zhì)體的表征

3 討論

DLPC 是一種人工合成的不飽和磷脂，在制成的脂質(zhì)體中，DLPC 將均勻分散在脂質(zhì)雙分子層膜上。當有ROS 存在時，DLPC 結(jié)構(gòu)中的不飽和碳碳雙鍵可被氧化，使脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，促進包載藥物的釋放。光敏劑可在特定波長光照射下產(chǎn)生ROS，在腫瘤疾病的光動力治療中得到廣泛應用。但光敏劑自身潛在的光毒性和溶解性差是其突出缺陷。本文將光敏劑包載在脂質(zhì)體中可以減少潛在的細胞毒性，同時可增加其溶解度。在研究脂質(zhì)體中雷帕霉素釋放的釋放介質(zhì)確定上，文獻[2,4-5]中提供了多種選擇。預實驗顯示，20%乙醇溶液作為釋放介質(zhì)時，不僅克服了脂溶性藥物雷帕霉素在水中溶解性差的缺點，同時也使得在進行HPLC 檢測時干擾峰較少。綜上所述，本研究成功制備了光敏ROS 響應型雷帕霉素脂質(zhì)體，表征結(jié)果較好。在短時間特定波長照射后，可實現(xiàn)脂溶性藥物的快速釋放。