張朋朋，李 琳，石志群，何 蕾，馬慧萍

（1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四O醫(yī)院藥劑科全軍高原醫(yī)學實驗室，甘肅 蘭州 730050；2. 甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000）

環(huán)境條件是維持機體正常生理功能的重要因素，長期生活于低海拔地區(qū)的人，當快速進入海拔3 000 m 以上高原時，通常會出現(xiàn)頭痛、全身乏力等急性高原反應[1]。高原低壓性缺氧能夠誘導活性氧自由基（ROS）的快速積累，導致機體氧化應激水平升高，從而造成機體損傷。心臟是機體最重要的器官之一，對高原急性低壓缺氧條件十分敏感[2]。當機體長期處于缺氧狀態(tài)下，心率、血壓發(fā)生改變，心臟負荷增加，心臟能量供應不足，最終導致機體損傷。高原低壓性缺氧嚴重地限制了初到高海拔地區(qū)人們的生活和工作，甚至危及生命。

雪蓮是我國高山地區(qū)常用的名貴中草藥，近年來，國內對雪蓮藥理作用的研究主要集中于提高機體免疫力、抗氧化及抗輻射等作用[3]，而關于抗高原缺氧作用的研究較少。本課題組前期對20 多種青藏高原植物進行篩選，發(fā)現(xiàn)大苞雪蓮具有顯著的抗缺氧活性，并通過最佳提取工藝研究[4]、質量標準研究[5]，研制出用于高原缺氧防治的醫(yī)院制劑——雪蓮黃酮膠囊。在本課題組前期研究中確定了最佳給藥劑量為500 mg/kg[6]。本實驗使用低壓低氧動物實驗艙模擬海拔8 000 m 高原缺氧環(huán)境，通過檢測急性高原缺氧小鼠心臟的組織學、缺氧相關生化指標和基因蛋白的變化情況，研究雪蓮黃酮膠囊對于缺氧小鼠心臟的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Balb/c 小鼠64 只，體重18～22 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜）2019-001，倫理審批編號：2021KYLL170。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科。

1.2 藥物與試劑

乙酰唑胺（武漢遠城科技發(fā)展有限公司, 59-66-5）；雪蓮黃酮膠囊（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院制劑）； 乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）、總抗氧化能力（T-AOC）、BCA 蛋白試劑盒（南京建成生物工程研究所，A003-1-2）；RNAiso試劑、TakaRa Prime ScriptTM 試劑盒、PCR 擴增試劑盒（大連寶生物公司，引物委托寶生物工程公司合成）；缺氧誘導因子1α（HIF-1α）抗體、血管內皮生長因子（VEGF）抗體、超氧化物歧化酶（SOD）抗體（Abcom，英國）；抗體(BD，美國)；Western BrightTM ECL（Advansta，美國）。

1.3 儀器

Delta 320 電子pH 計（梅特勒托利多公司）；IEC-Micromax 高速離心機（美國ThermoElectron公司）；Tissuelyser 快速研磨儀（上海凈信科技公司）；BP210S 電子天平（賽多利斯有限公司）；HP-8453 紫外分光光度計（美國惠普公司）；SpectraMax i3 全自動熒光酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；FLYDWC20-ⅡA 大型低壓低氧動物實驗艙（中航貴州風雷航空軍械有限責任公司）。

1.4 動物分組及處理

取SPF 級健康雄性Balb/c 小鼠64 只，飼養(yǎng)適應3 d 后隨機分為正常組（N）、模型組（M）、乙酰唑胺陽性對照組（ACZ，250 mg/kg）、雪蓮黃酮膠囊組（XLJN，500 mg/kg）4 組，每組16 只，單次灌胃給藥，除正常組小鼠外，其余各組小鼠給藥50 min 后放入低壓低氧動物實驗艙，模擬8 000 m 海拔缺氧環(huán)境。以10 m/s 的速度升至8 000 m 海拔，維持缺氧9 h，完成減壓缺氧后以20 m/s 的速度降至海拔1 450 m。小鼠完成減壓后立即脫臼處死，取心肌組織，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

實驗過程嚴格按照“3R”原則進行，實驗廢棄物及動物尸體等按照《醫(yī)療廢物管理條例》要求進行無害化處理，嚴格遵守國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》，盡可能減少對動物的傷害。

1.5 組織學觀察

1.5.1 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心臟顯微結構的影響

每組隨機取3 只小鼠心臟組織標本，置于甲醛中固定。標本送至聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院病理科進行石蠟包埋、組織切片、染色以及觀察。

1.5.2 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心臟超顯微結構的影響

每組隨機取3 只小鼠心臟標本，切成1 mm×1 mm×3 mm 的小塊，置于2.5%戊二醛中固定，之后對標本進行浸透包埋以及電鏡觀察。

1.6 生化指標測定

取各組剩余10 只小鼠的心肌組織50 mg，加入9 倍質量的0 ℃生理鹽水，勻漿并離心，取上清，-20 ℃冷凍，用于LD、LDH、T-AOC 指標測定。以上操作均按試劑盒說明書要求進行。

1.7 RT-PCR 測定mRNA 表達水平

取各組剩余10 只小鼠心肌組織標本30 mg，向低壓低氧處理的小鼠心肌組織中加入1 ml RNAiso Plus 試劑進行研磨，加入200 μl 氯仿，混勻后離心，棄上清液，取75%乙醇溶液純化總RNA沉淀，再次離心棄上清液，將所得RNA 于-80 ℃保存。紫外分光光度計檢測總RNA 的濃度及純度，并使用1 %甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。將提取的總RNA 進行逆轉錄，具體步驟參考PrimeScriptTM RT 試劑盒說明書。實時PCR 檢測：步驟參考Applied Biosystems公司7300 儀器說明。反應條件如下：兩步法PCR 擴增，95 ℃預變性30 s；95 ℃反應5 s，60 ℃退火31 s，40 個循環(huán)。引物及序列見表1。

1.8 蛋白質印跡法測定HIF-1α、VEGF、SOD 蛋白的表達

取各組剩余10 只小鼠心肌組織標本50 mg，加入高效裂解液，勻漿，于冰上裂解30 min，低溫離心后吸取部分上清液，用于BCA 法對總蛋白濃度進行定量。向剩余上清液中加入3 倍量上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，取等量蛋白樣品上樣，采用SDS-PAGE 進行分離，電泳完成后將蛋白轉至PVDF 膜，將PVDF 膜浸泡于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入小鼠抗β-actin 單抗抗體（1∶1 000）、HIF-1α 兔多克隆抗體（1∶500）、VEGF 兔多克隆抗體（1∶1 000）、SOD 兔多克隆抗體（1∶1 500），4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液漂洗。加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液漂洗。配制ECL 發(fā)光液，按照A 液和B 液1∶1 進行配制，加入發(fā)光液，使用ChemiDoc MP Imaging System 全能型成像系統(tǒng)進行曝光。使用ImageJ 軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

表1 Real Time RT- PCR 引物序列

1.9 統(tǒng)計學處理

圖1 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織顯微結構的影響(200×)

2 實驗結果

2.1 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織顯微結構的影響

結果如圖1 所示，N 組心肌組織結構正常，細胞形態(tài)結構完好；M 組心肌細胞腫脹，心肌纖維增粗，排列不整齊，胞核增大淡染；ACZ 組與XLJN 組的肌纖維腫脹、排列不齊現(xiàn)象，其程度有所減輕；心肌收縮舒張功能損傷減輕。

2.2 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織超顯微結構的影響

如圖2 所示，N 組心肌組織肌纖維排列整齊且緊密。肌節(jié)分明，肌線清晰，線粒體形狀規(guī)則，膜光滑，內嵴清晰可見。M 組肌絲溶解、破裂，肌絲排列疏松，基膜下腫脹、變形。線粒體腫脹，產生空泡，雙層膜結構溶解。ACZ 組肌絲排列疏松，線粒體基本正常，肌絲連接處部分溶解，連接不整齊。XLJN 組，肌纖維與線粒體形態(tài)良好，遠優(yōu)于模型組。綜上所述，雪蓮黃酮膠囊對心肌的超顯微結構具有明顯的保護作用。

2.3 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織生化指標的影響

如表2 所示，缺氧后，M 組LD 含量升高（P＜0.01），T-AOC 活性顯著降低（P＜0.01），LDH 活性無顯著變化（P＞0.05）。與M 組相比，ACZ 組與XLJN 組的小鼠心肌組織LD 活性降低（P＜0.01），LDH 活性無明顯變化（P＞0.05），T-AOC 活性升高（P＜0.01）。

2.4 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織缺氧相關mRNA 的影響

如表3 所示，與N 組相比，M 組小鼠心肌組織HIF-1α 和VEGF 的mRNA 水平顯著提高，SOD、過氧化氫酶（CAT）mRNA 水平顯著降低（P＜0.01）；與M 組相比，ACZ 組、XLJN 組心肌組織HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平均有所下降（P＜0.05），SOD、CAT 的mRNA 表達水平顯著提高（P＜0.01）。

2.5 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織缺氧相關蛋白含量的影響

圖2 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織顯微結構的影響

表2 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織生化指標的影響(±s，n=10)

表2 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織生化指標的影響(±s，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01，與M組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與N組比較。

組別 例數(shù)（n） 劑量（mg/kg） LD含量（mmol/g蛋白） LDH活性（U/g蛋白） T-AOC活性（U/mg蛋白）N組 10 — 0.405±0.050 1 919.8±143.1 1.58±0.23 M組 10 — 0.579±0.032## 1 871.0±95.9 1.11±0.10##ACZ組 10 300 0.513±0.059* 1 925.9±141.4 1.30±0.21**XLJN組 10 500 0.524±0.057** 1 916.8±129.1 1.34±0.19**

表3 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF、mRNA 的影響(±s ，n=10)

表3 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF、mRNA 的影響(±s ，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01，與M組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與N組比較。

組別 例數(shù)（n） 劑量 （mg/kg） HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N組 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M組 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07#ACZ組 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16**XLJN組 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**#

如圖3、圖4 所示，與N 組相比，M 組小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），SOD 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與M 組相比，XLJN 組和ACZ 小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），SOD 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

圖3 雪蓮黃酮膠囊對缺氧小鼠心肌缺氧相關蛋白表達電泳圖

圖4 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌缺氧相關蛋白表達量的比較

3 討論

低壓低氧條件能夠誘導ROS 的快速積累，導致機體氧化應激水平升高，心臟中的氧氣濃度低于臨界值，造成能量衰竭，同時伴隨組織ATP 水平下降，引發(fā)細胞內離子穩(wěn)態(tài)失衡及不可逆的膜結構損傷[7]。部分研究表明，抗氧化劑具有一定的抗缺氧作用，例如，葛根素、去甲漢黃芩素、檳榔多酚等抗氧化劑能夠通過清除ROS 緩解缺氧損傷[8-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雪蓮中黃酮成分具有優(yōu)異的抗氧化作用[12]，為此，我們對雪蓮黃酮膠囊的高原缺氧誘導小鼠心肌損傷的保護作用進行考察。結果發(fā)現(xiàn)，與M 組相比，XLJN 組小鼠肌纖維形態(tài)明顯改善，線粒體膜完好，說明雪蓮黃酮膠囊對于模擬高原缺氧小鼠心肌的形態(tài)結構具有較好的保護作用。

在缺氧環(huán)境下，組織呼吸鏈受抑制，ATP 酶活性下降，有氧呼吸產生ATP 的量減少。為彌補能量缺失，糖酵解作用加強，并成為組織供能的主要途徑[13]。LDH 可催化丙酮酸與LD 間的相互轉化，低氧條件下LDH 促進厭氧糖酵解，產生的LD 反過來又會提高其活性[14]，這就解釋了本研究中M 組的LDH 沒有升高的現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，組織中LD 含量的增加直接反映機體的缺氧程度。根據本文研究結果，雪蓮黃酮膠囊可顯著降低缺氧心肌的LD 水平、提高T-AOC 活性，由此推斷，雪蓮黃酮膠囊能夠提高乳酸的代謝轉化，促進細胞無氧酵解。

缺氧誘導因子-l（HIF-1）是近年來發(fā)現(xiàn)對缺氧環(huán)境高度特異性的轉錄因子，是專一調節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的關鍵介質[15]。HIF-1 可能作為活性氧受體，感受環(huán)境中的低氧程度，同時調控具有效應器作用的低氧反應基因的轉錄[16]。表皮生長因子（VEGF）作為HIF-1 的下游基因，可調節(jié)毛細血管通透性和血管生成。本實驗通過RT-PCR 檢測缺氧相關基因，發(fā)現(xiàn)缺氧可造成心肌組織HIF-1、VEGF 的mRNA 表達明顯升高，而雪蓮黃酮膠囊可使HIF-1α、VEGF的mRNA 表達降低，由此推斷，雪蓮黃酮膠囊通過降低小鼠心臟對于缺氧的敏感性，延緩組織水腫來抵抗缺氧造成的損傷，該結論與Xu 等[17]研究一致。SOD 與CAT 是機體清除自由基的主要酶，是抗缺氧能力的重要指標。缺氧可造成模型組SOD、CATmRNA 表達與蛋白含量降低，雪蓮黃酮膠囊給藥后，缺氧小鼠的SOD、CAT 的mRNA 表達、蛋白含量顯著提高，證明其能夠通過增加缺氧小鼠心肌SOD 與CAT 的含量，提高心肌的抗氧化能力。

綜上所述，雪蓮黃酮膠囊能顯著減輕高原缺氧對小鼠心肌組織顯微結構和超顯微結構的損傷，說明雪蓮黃酮膠囊對低壓性缺氧造成的組織損傷具有良好的保護作用。此外，雪蓮黃酮膠囊還可顯著降低缺氧小鼠心肌組織LD 累積水平，因此改善心肌組織能量代謝，這也可能是其發(fā)揮保護功能的原因之一。進一步的分子實驗結果表明，雪蓮黃酮膠囊抗高原缺氧的機制可能與影響HIF-1α、VEGFmRNA與蛋白的表達、調節(jié)小鼠組織內部氧平衡、血管通透性、提高SOD、CAT 等抗氧化酶含量有關。下一步，我們將對雪蓮黃酮膠囊的藥動學進行研究，為將其開發(fā)成為抗缺氧藥物提供了一定的理論和實驗依據。