石志群，高迎春，張冬梅，陳克明，景臨林，馬慧萍

（1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四O醫(yī)院：a. 全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, b. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730050; 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及居民生活水平的提高，越來越多的人來到高原生活、工作和旅游，但由于高原地區(qū)氧分壓較低，高原病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。高原腦水腫（HACE）是高原病發(fā)生發(fā)展過程中最為嚴(yán)重的階段，其臨床表現(xiàn)為頭痛、協(xié)調(diào)喪失、虛弱、意識水平降低[2]，并對機(jī)體造成不可逆的損傷。7-羥乙基白楊素（7-hydroxyethyl chrysin，7-HEC）是課題組前期篩選發(fā)現(xiàn)并合成的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗高原缺氧化合物[3]，研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，其對腦缺血再灌注大鼠和模擬高原低壓性缺氧致腦組織損傷大鼠均具有明顯的保護(hù)作用，并能夠減輕低壓低氧誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷[6]，在抗高原缺氧方面表現(xiàn)出優(yōu)異的活性與前景。因此，本文主要從7-HEC 對高原腦水腫的可能作用機(jī)制出發(fā)，探究其與自噬、周期、凋亡等通路之間的關(guān)系，為防治高原腦水腫的可能作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

27 只SPF 級雄性Wistar 大鼠（體重180～200 g），購自聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科，合格證號：SCXX（軍）2012-0029，動物倫理委員會編號：2021KYLL173。

7-HEC 由實(shí)驗(yàn)室景林臨副教授自行合成；MDA、SOD 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CDK2、CDK6、CyclinD1、CyclinE2、PARP、Bax、Bcl-2、P62、LC3B 抗體（英國Abcom 公司）；BCA蛋白試劑盒（Solarbio 公司）；脫脂奶粉（美國BD 公司）；Western Bright TM ECL（美國Advansta）。

IEC-Micromax 高速離心機(jī)（美國ThermoElectron公司）；Tissuelyser 快速研磨儀（上海凈信科技公司）；BP210S 電子天平（賽多利斯有限公司）；HP-8 453紫外分光光度計(jì)（美國惠普公司）；SpectraMax i3 全自動熒光酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；FLYDWC20-ⅡA 大型低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙（中航貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司）。

1.2 動物分組及高原腦水腫模型的建立[7]

將27 只SPF 級雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性飼喂3 d 后，隨機(jī)分為3 組，正常對照組、缺氧模型組、7-HEC 給藥組。給藥組連續(xù)灌胃7-HEC（350 mg/kg）7 d，對照組和模型組給予等量滅菌注射用水。第四天，模型組和給藥組放入大型低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙中，以10 m/s 速度減壓上升至相當(dāng)于海拔6 000 m處，缺氧處理3 d 后處死，取腦組織。缺氧處理期間，氧艙溫度：8:00～20:00，12 ℃，20:00～次日8:00，2 ℃；動物自由攝食及飲水；給藥組繼續(xù)灌胃給藥。

1.3 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

每組分別取6 只大鼠腦組織標(biāo)本，準(zhǔn)確稱重后，按質(zhì)量（g）∶體積（ml）=1∶9 加入生理鹽水制成10 %組織勻漿，采用WST-1 法檢測SOD 活性、采用硫代巴比妥酸法檢測MDA 含量，以上操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法測定凋亡、周期、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

每組選取3 只大鼠腦組織，稱重后加入9 倍量高效裂解液，使用組織研磨儀進(jìn)行組織勻漿，于冰上裂解30 min，低溫離心后吸取上清勻漿液10 μl，BCA 法測蛋白含量，剩余上清與4×上樣緩沖液按體積3∶1 比例混勻，封口膜封口，95 ℃煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性，取等量蛋白樣品上樣，采用 SDSPAGE 進(jìn)行分離，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，含5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。用TBST 緩沖液漂洗4 次，每次10 min。加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌PVDF 膜4 次，每次10 min。配制ECL 發(fā)光液，按照A 液和B 液1∶1 進(jìn)行配制，涂抹發(fā)光液，放入ChemiDoc MP Imaging System 全能型成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

大鼠腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA 與SOD 的測定結(jié)果如圖1 所示，與對照組相比，缺氧組大鼠腦組織中MDA 含量顯著性升高，SOD 活力顯著性下調(diào)（P＜0.05），當(dāng)給予7-HEC 時(shí)，缺氧組大鼠腦組織中MDA 含量下調(diào)，SOD 活力上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示，7-HEC 可能參與機(jī)體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，起到防護(hù)高原腦水腫的效果。

圖1 各組腦組織中MDA 含量及SOD 活力比較(±s，n=6)

2.2 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖2 所示，大鼠腦組織中PARP 與Bcl-2 的蛋白表達(dá)在缺氧組下調(diào)，給藥后顯著上調(diào)（P＜0.01），大鼠腦組織中Bax 的蛋白表達(dá)在缺氧組上調(diào)，給藥組顯著下調(diào)（P＜0.01），為進(jìn)一步探討B(tài)cl-2 與Bax對凋亡的易感性，對Bax/Bcl-2 的比例進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組顯著下降，與缺氧組相比，給藥組極顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果提示，7-HEC 可能參與細(xì)胞凋亡從而防治高原腦水腫。

2.3 周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖3 所示，與對照組相比，大鼠腦組織中周期相關(guān)蛋白CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2 的表達(dá)在缺氧組均下調(diào)（P＜0.05）；與缺氧組相比，在給藥組中，CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果提示，7-HEC 可能參與細(xì)胞周期調(diào)控從而防治高原腦水腫。

2.4 自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖4 所示，大鼠腦組織中P62 的蛋白表達(dá)在缺氧組極顯著上調(diào)，給藥后顯著下調(diào)（P＜0.01）；與對照組相比，大鼠腦組織中LC3-B 的蛋白表達(dá)在缺氧組顯著下降，與缺氧組相比，給藥組極顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果提示，7-HEC 可能參與細(xì)胞自噬過程從而防治高原腦水腫。

3 討論

氧化應(yīng)激是一種有害事件，可導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生或抗氧化防御功能不足，損害神經(jīng)血管單元的完整性，造成神經(jīng)元不可逆死亡，進(jìn)而血腦屏障破壞形成腦水腫[8]。MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量可以間接反映組織氧化應(yīng)激的水平，SODs 是一類具有催化超氧化物生成過氧化氫的抗氧化酶[9]，可以直接或間接地反映氧化應(yīng)激的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)給藥干預(yù)后，大鼠腦組織MDA 含量顯著降低，SOD 活力顯著提高，表明7-HEC 可改善腦水腫大鼠的氧化損傷，從而對腦水腫起到一定的預(yù)防作用。

研究表明，缺氧與細(xì)胞周期、凋亡、自噬密切相關(guān)，細(xì)胞周期蛋白表達(dá)異常會引發(fā)細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞周期失調(diào)的細(xì)胞有機(jī)會通過DNA 損傷反應(yīng)的各種機(jī)制來阻止DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DDR基因轉(zhuǎn)錄。目前研究認(rèn)為，自噬是另一種DDR 機(jī)制，它通過促進(jìn)或防止細(xì)胞死亡來應(yīng)對DNA 損傷，從而發(fā)揮作用[11]。細(xì)胞周期從G1 期到S 期的調(diào)節(jié)因子是CDK2 蛋白，自噬主要影響細(xì)胞周期的G1期和S 期，因此自噬與周期也存在密不可分的關(guān)系。

圖2 大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白電泳圖及蛋白表達(dá)量(±s，n=3)

圖3 大鼠腦組織中周期相關(guān)蛋白電泳圖及蛋白表達(dá)量(±s，n=3)

圖4 大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白電泳圖及蛋白表達(dá)量( x ˉ±s，n=3)

細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡方式，是一種正常的生理變化。缺氧是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子之一，細(xì)胞凋亡加劇是低氧環(huán)境誘發(fā)機(jī)體機(jī)能損傷的重要途徑[12]。其受Bax 和Bcl-2 控制。Bcl-2 蛋白的過表達(dá)在動物模型中被證明可以減輕肝和腎的損傷，而Bax 的過度表達(dá)則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，缺氧組大鼠腦組織中Bax/Bcl2 比值降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重腦水腫，7-HEC 可上調(diào)Bax/Bcl2 比值，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，起到抗高原腦水腫的作用。

細(xì)胞周期在細(xì)胞增殖和分裂中起著關(guān)鍵作用，其由兩類蛋白精確調(diào)控，CDKs、cyclin 作為關(guān)鍵的周期蛋白。這兩類蛋白決定了細(xì)胞維持在停滯狀態(tài)或繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期。細(xì)胞周期抑制已被證明可以提供神經(jīng)保護(hù)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成和微膠質(zhì)激活，并改善創(chuàng)傷性腦損傷后的運(yùn)動和認(rèn)知恢復(fù)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，缺氧環(huán)境可下調(diào)周期蛋白的表達(dá)，而7-HEC 可上調(diào)周期蛋白的表達(dá)，對高原腦水腫起到一定的預(yù)防作用。

缺氧與自噬密切相關(guān)。缺氧條件下，會誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。自噬是一種高度調(diào)控的連續(xù)過程，它是一種重要的程序性細(xì)胞死亡[15]。LC3 蛋白與P62蛋白相互作用，是自噬的標(biāo)志物。P62 蛋白通常存在于自噬體中，并在自溶酶體形成時(shí)被降解[16]。LC3蛋白是哺乳動物自噬蛋白和自噬小體標(biāo)記物，LC3B 是自噬體標(biāo)記的四種不同亞型中使用最廣泛的一種。自噬受體包括P62 等一系列連接泛素化底物和LC3 的適配器，自噬體一旦形成，就會經(jīng)歷成熟階段，然后與溶酶體融合，發(fā)生自噬。此外，P62 還可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，主要通過選擇性減少胞質(zhì)中促凋亡蛋白來減輕細(xì)胞死亡，保護(hù)機(jī)體免受傷害[17]。在本實(shí)驗(yàn)中7-HEC 可下調(diào)P62、上調(diào)LC3B的表達(dá)，從而促進(jìn)自噬，保護(hù)機(jī)體免遭高原腦水腫損害。

凋亡、自噬、周期三種生物過程相互聯(lián)系，相互影響，作用于機(jī)體，保障機(jī)體的正常運(yùn)行。凋亡、自噬、周期相關(guān)因子的變化又會影響氧化應(yīng)激通路的發(fā)生發(fā)展。在本實(shí)驗(yàn)中，7-HEC 降低大鼠腦組織中MDA 含量，上調(diào)SOD 含量，從而抑制HACE 引發(fā)的氧化應(yīng)激；其還可上調(diào)周期和自噬蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞的增殖活性，加速損傷細(xì)胞的自噬，保護(hù)機(jī)體免受HACE 的損害。綜上，7-HEC 可抑制細(xì)胞凋亡和周期，增強(qiáng)自噬，進(jìn)而抑制機(jī)體氧化應(yīng)激，從而達(dá)到防護(hù)高原腦水腫的作用。