陳 勇， 何冬雷， 周江浩， 梁月祥， 楊 丞

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院， 海南 ?？?570102)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加。目前手術是根治胃癌的最佳方法，但患者治療后的存活率仍然很低[1]。大多數(shù)患者在診斷時已處于中晚期，錯過了最佳的治療時機，因此探索新的胃癌治療靶點對于胃癌的治療至關重要。Numb1蛋白是一種能夠抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的銜接蛋白，在細胞分化過程中起關鍵作用。Numb1基因在多種腫瘤細胞中表達上調(diào)，并可能與癌細胞轉(zhuǎn)移及耐藥的形成相關。ITGB1是介導細胞粘附、收縮性和運動性的細胞表面粘附分子，可促進上皮細胞的擴散和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1的高表達介導了非小細胞肺癌的發(fā)展[2]。也有研究已經(jīng)證實，ITGB1在胃癌患者中表達量增加[3]。目前發(fā)現(xiàn)銜接蛋白 Numb1可能參與調(diào)節(jié) ITGB1影響細胞骨架的形成，但是具體的分子機制尚不清楚。綜上所述，Numb1與ITGB1在腫瘤增殖、遷移以及耐藥過程中有不可忽視的作用，二者之間是否存在相互作用共同促進胃癌的發(fā)展有待進一步研究，其可能存在的結合位點也尚未得到驗證。本研究擬通過胃癌臨床標本及胃癌細胞株，分析Numb1對ITGB1的調(diào)節(jié)作用，研究Numb1與ITGB1的相互作用對胃癌細胞遷移及侵襲力和耐藥性的影響，明確Numb1是否通過ITGB1實現(xiàn)對胃癌細胞轉(zhuǎn)移及耐藥的調(diào)節(jié)，為胃癌患者的提供可能的治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料：選取2019年2月至2021年6月手術切除的胃癌及其癌旁組織21例。手術取材后立即置于液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。所有患者均已簽署知情同意書。人胃癌細胞BGC-823購自中科院上海細胞庫；奧沙利鉑(國藥準字H20093541)購自江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶消化液、胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；免疫沉淀試劑盒購自賽默飛公司；過表達Numb1、ITGB1的重組慢病毒液和陰性對照重組慢病毒購自上海吉滿生物科技有限公司；si-NC、si-ITGB1、si-Numb1購自蘇州貝信公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑及BCA蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；2×SYBR Green qPCR MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司；Numb1、ITGB1和GAPDH抗體購自英國Abcam；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自中國Corning公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細胞株BGC-823，置于37℃、5%CO2恒溫的細胞培養(yǎng)箱中，根據(jù)細胞生長密度更換新鮮的培養(yǎng)基，待細胞生長融合度到達80%～90%時進行消化和傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行下一步的實驗。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染實驗：將對數(shù)期生長的BGC-823細胞接種于6孔板(5×105個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，將細胞隨機分為flag-NC組(轉(zhuǎn)染flag-NC)、flag-Numb1組(轉(zhuǎn)染flag-Numb1)、flag-ITGB1組(轉(zhuǎn)染flag-ITGB1)。根據(jù)MOI值計算每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細胞數(shù))/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入無血清培養(yǎng)基補充體積至1mL/孔。24h后，更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選。72h后，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染實驗：將BGC-823細胞分為si-NC組、si-ITGB1組、si-Numb1組。按照LipofectamineTM2000說明書步驟進行轉(zhuǎn)染。調(diào)整BGC-823數(shù)量并接種于6孔板，使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細胞達70%左右生長密度。制備si-Notch1、si-Numb1與脂質(zhì)體的復合物，同時制備無干擾作用的si-RNA(si-NC)與脂質(zhì)體復合物，將復合物加入6孔板相應si-NC組、si-ITGB1組、si-Numb1組的孔內(nèi)，搖動混合，5～6h將細胞培養(yǎng)基倒掉，PBS洗滌細胞2次，更換為RPMI 1640培養(yǎng)基，24h后更換培養(yǎng)液。

1.2.4qRT-PCR法檢測細胞中Numb1、ITGB1的表達：TRIzol試劑提取各組細胞中的總RNA，酶標儀檢測總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5μL，ddH2O補充至10 μL。qRT-PCR反應條件：95℃(30s)預變性后，變性95℃(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40個循環(huán)周期。擴增結果根據(jù)2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列：GAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，GAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；Numb1-F，5-AGGCTTCTTTGGAAAAACTGGA-3,Numb1-R，5-CGGGTGCTAGAGCAGTATGG-3；ITGB1-F，5-CGCCGCGCGGAAAAGATG-3，ITGB1-R，5-AAACACCAGCAGCCGTGTAA-3。

1.2.5WB法檢測細胞中Numb1、ITGB1的表達：收集各組胃癌細胞，向細胞中加入RIPA裂解液裂解細胞。收集細胞上清液并測定其蛋白濃度。取30μg樣品進行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作。使用5%脫脂奶粉室溫孵育2h以去除非特異性結合位點。加入Numb1抗體(1∶1000)、ITGB抗體(1∶2000)，于4℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗(1∶5000)，室溫條件下孵育1h后，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.6免疫共沉淀實驗檢測胃癌細胞中Numb1和ITGB1結合情況：將flag-NC、flag-ITGB1、flag-Numb1三組BGC-823細胞擴增至100mm細胞培養(yǎng)皿中。待細胞密度至70%以上時，細胞刮刀收集細胞并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，裂解20min。12000g離心10min后取收集上清。在flag抗體與Protein G磁珠中加入上清液共孵育過夜。隔天依次將flag結合蛋白洗脫至新的EP管。加入SDS上樣緩沖液，100℃煮10min。上述樣品用12%的SDS-PAGE電泳，并進行WB分析。

1.2.7CCK8細胞毒性試驗：用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期的細胞后離心，用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成單細胞懸液，接種到96孔板中，調(diào)整細胞濃度至8000個/孔，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)至24h、48h時每孔加入20μL CCK8溶液，2h后用酶標儀測定在450nm吸光度(A)值。

1.2.8細胞劃痕實驗：各組細胞培養(yǎng)24h，使用胰蛋白酶消化，將密度調(diào)整為1×105個細胞/孔平鋪于6孔板上。每組設置3個平行孔。使用200μL無菌槍頭輕輕劃過6孔板，每次平行劃5次左右。將處理后的6孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下觀察劃痕閉合度。通過Image J系統(tǒng)檢測細胞遷移面積。

1.2.9Transwell細胞侵襲實驗：取50μL基質(zhì)膠鋪于8μm Transwell小室內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱靜置1h。取各組細胞，胰酶消化后離心，后用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至2×104/mL，接種于Transwell小孔上室，每孔200μL。下室加入500μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，用4%的多聚甲醛固定15min，0.1%結晶紫染色20min，PBS清洗后在倒置顯微鏡下隨機選取10個視野的細胞進行計數(shù)。

2 結 果

2.1胃癌腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達水平比較：采用qRT-PCR檢測胃癌腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達水平，結果顯示與癌旁組織比較，腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。此外，相關性分析結果顯示，Numb1和ITGB1的表達水平成正相關(r=0.6270)見圖1B。

圖1 胃癌組織Numb1和ITGB1表達水平比較

2.2Numb1與ITGB1蛋白在胃癌細胞中相互結合：通過免疫共沉淀實驗檢測胃癌細胞中Numb1和ITGB1結合情況，結果顯示，全細胞裂解液中，與flag-NC比較，過表達flag-ITGB1組Numb1蛋白表達水平增加；過表達flag-Numb1組Numb1蛋白表達水平增加，說明過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構建成功。在過表達flag-Numb1的flag免疫沉淀產(chǎn)物中可檢測到ITGB1蛋白，在過表達flag-ITGB1的flag免疫沉淀產(chǎn)物中可檢測到Numb1蛋白，而在過表達flag-NC的flag免疫沉淀產(chǎn)物中均不能檢測到Numb1和ITGB1蛋白。結果說明Numb1與ITGB1蛋白之間存在直接或間接的相互作用，見圖2。

圖2 免疫共沉淀檢測胃癌細胞Numb1和ITGB1結合情況

2.3Numb1在胃癌細胞中調(diào)控ITGB1表達：qRT-PCR和WB結果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組Numb1的mRNA和蛋白表達水平降低；與si-NC組比較，si-ITGB1組ITGB1的mRNA和蛋白表達水平降低，說明siRNA轉(zhuǎn)染成功。與si-NC組比較，si-Numb1組ITGB1的mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)，而si-ITGB1組Numb1的mRNA和蛋白表達水平無顯著性變化(P>0.05)，見圖3A和3B。

圖3 siRNA干擾實驗研究Numb1與ITGB1表達調(diào)控關系

2.4沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌細胞增殖：CCK8實驗結果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細胞增殖能力降低，在72h時表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖4。

圖4 CCK8檢測沉默Numb1和ITGB1對胃癌細胞增殖能力影響

2.5沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌細胞遷移和侵襲：細胞劃痕實驗結果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細胞24 h遷移率均降低，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖5。Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細胞侵襲數(shù)目均降低，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖6。

圖5 細胞劃痕實驗檢測沉默Numb1和ITGB1對胃癌細胞遷移能力影響

圖6 Transwell檢測沉默Numb1和ITGB1對胃癌細胞侵襲能力影響

2.6沉默Numb1和ITGB1促進奧沙利鉑對胃癌細胞的殺傷能力：CCK8實驗結果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組經(jīng)不同濃度(10、20、50、100μmoL/L)奧沙利鉑處理胃癌細胞后，細胞存活率均降低，在(150、100μmoL/L)濃度下具有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度奧沙利鉑對各組胃癌細胞存活率的影響

3 討 論

據(jù)國際癌癥研究機構編制的2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率估算數(shù)據(jù)統(tǒng)計，胃癌發(fā)病率為5.7%，死亡率為8.2%，是世界范圍內(nèi)第三大癌癥相關死亡原因。胃癌細胞的復發(fā)轉(zhuǎn)移及多藥物耐藥是化療成功的主要障礙，其結果是腫瘤細胞對藥物治療的敏感性降低且極易復發(fā)。

Numb蛋白首先在果蠅中被鑒定和研究，是一種與細胞內(nèi)膜相連的磷酸酪氨酸結合域蛋白。Numb又稱細胞命運決定因子，在細胞分裂、細胞粘附和細胞遷移中發(fā)揮重要的作用[4]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了Numb家族蛋白與腫瘤進展相關，Numb可與p53、Notch等相互作用以調(diào)節(jié)它們在腫瘤過程中的活性。例如Numb6可誘導胚胎轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達，進而主動抑制E-鈣粘蛋白，促使細胞進行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致乳腺癌細胞失去其上皮表型，表現(xiàn)出促遷移和促侵襲行為[5]。Numb1是Numb的一個亞型，大多數(shù)研究已將Numb1確定為一種腫瘤抑制因子，在結直腸癌和非小細胞肺癌中經(jīng)常被下調(diào)[6]，然而也有研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細胞癌患者中，Numb的高表達與腫瘤高復發(fā)率和較差的總體術后生存率顯著相關，敲除食管鱗狀細胞系中的Numb1時，caspase-3依賴性細胞凋亡和細胞增殖抑制持續(xù)增加，癌癥干細胞標志物表達下調(diào)，這表明Numb1可能促進癌癥的發(fā)展[7]。但是Numb1在胃癌中的作用尚缺乏相關報道。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，腫瘤組織中Numb1表達水平升高。說明Numb1可能參與胃癌的發(fā)展。

整合素參與細胞-基質(zhì)間相互作用以及癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移，通過直接與上皮細胞間充質(zhì)基質(zhì)成分結合并提供細胞運動和侵襲所需的牽引力，在調(diào)節(jié)細胞增殖、運動以及遷移能力方面發(fā)揮著重要作用。ITGB1是主要的整合素β亞基，被稱為癌癥預后不良的潛在標志物[8]。Oshita等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1可通過形成各種α2β1、α3β1、α6β1和αvβ1整合素來促進細胞遷移和侵襲，從而促進小細胞肺癌的發(fā)展。在胃癌患者的腫瘤組織中，ITGB1的表達上調(diào)，能夠增強細胞遷移率和增殖能力，而沉默ITGB1可以逆轉(zhuǎn)這種作用。本實驗結果與以往所述一致，與癌旁組織比較，腫瘤組織中ITGB1表達水平升高，ITGB1可能促進胃癌的發(fā)展。

已有研究顯示，Numb通過其PTB結構域與ITGB1相互作用，調(diào)節(jié)ITGB1的內(nèi)化從而影響細胞骨架形成。Martinez-Morales[10]等研究團隊利用酵母雙雜交實驗也證明Numb的PTB結構域可以與ITGB1發(fā)生相互作用，并且能夠調(diào)節(jié)ITGB1在細胞中的內(nèi)化轉(zhuǎn)運作用。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)ITGB1與Numb1的表達量呈正相關性，通過免疫共沉淀實驗我們證實了Numb1與ITGB1蛋白之間存在直接或間接的相互作用。當沉默Numb1后ITGB1的表達下調(diào)，但是沉默ITGB1不會影響Numb1的表達，這表明Numb1可在胃癌細胞中調(diào)控ITGB1表達。癌細胞遷移和侵襲的能力使其能夠改變組織內(nèi)的位置并脫離原發(fā)性腫瘤，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此抑制癌細胞的遷移和侵襲對于癌癥的治療至關重要。我們發(fā)現(xiàn)，當沉默Numb1與ITGB1后胃癌細胞的遷移與侵襲能力均下降，說明沉默Numb1與ITGB1可能通過抑制癌細胞的遷移與轉(zhuǎn)移來抑制癌癥的發(fā)展。

多藥物耐藥(Multi-drug resistent,MDR)是導致胃癌不可治愈的重要原因,奧沙利鉑是晚期胃癌治療的一線藥物，而對其的耐藥性是導致臨床治療失敗的主要問題[11]。胃癌細胞中細胞周期改變和細胞凋亡信號通路信號活化的改變以及細胞骨架改變是胃癌耐藥發(fā)生的主要機制。ITGB1的作用可導致p27Kip1在胞內(nèi)累積，引起細胞周期異常是導致耐藥的重要原因，這些生物學事件共同促進腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗作用。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)沉默ITGB1會促進奧沙利鉑對胃癌細胞的殺傷能力，而同時沉默Numb1和ITGB1將進一步加強藥物對癌細胞的殺傷作用，表明抑制Numb1和ITGB1會降低腫瘤細胞對于抗癌藥物的耐藥性。

綜上所述，我們的研究結果進一步揭示了胃癌細胞轉(zhuǎn)移及耐藥發(fā)生發(fā)展的具體生物學過程，并且確認Numb1在胃癌細胞轉(zhuǎn)移及耐藥形成過程中的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)也將為解決胃癌的臨床復發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥提供新的理論依據(jù)。