張小敏, 劉 文, 蔡傲竹
(武漢大學(xué)中南醫(yī)院眼科, 湖北 武漢 430070)
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是影響視神經(jīng)病變的重要細胞類型之一,例如青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷等[1]。其中,視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是許多視網(wǎng)膜疾病發(fā)生的基礎(chǔ),也是導(dǎo)致視力障礙或失明的主要原因,該過程可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生一系列損傷反應(yīng),從而破壞細胞正常生理功能,加重視網(wǎng)膜組織損傷。單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporters,MCT)是溶質(zhì)載體16轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員,可介導(dǎo)細胞乳酸、丙酮酸及其它單羧酸的跨膜轉(zhuǎn)運[2]。研究表明,MCT2在整個視網(wǎng)膜內(nèi)層大量表達,其表達受抑制將導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能降低,同時降低光轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性和谷氨酸能神經(jīng)元的水平[3],這提示MCT2可能是治療視網(wǎng)膜疾病和保護視力的潛在靶點。鑒于此,本研究以缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)處理人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5模擬視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型,研究MCT2對RGC-5細胞的保護作用,并初步探究其可能的作用機制。
1.1材料:人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5購于廣州博輝生物科技公司,Nrf2抑制劑ML385(純度99.59%,北京百奧萊博科技公司),胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液和DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司),Lipofectamine 2000脂質(zhì)體試劑盒和Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司),M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程公司),AceQ qPCR Probe Master Mix(南京諾唯贊生物公司),CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海弗元生物公司),免疫熒光染色試劑盒(江蘇凱基生物公司),Hoechst33342/PI雙染試劑盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白測定試劑盒及ECL超敏發(fā)光液(上海碧云天生物研究所),特異性抗體MCT2、Nrf2、Caspase-1、Bax、Caspase-3、Bcl-2、GSDMD、Caspase-1、NLRP3、IL-1β、GAPDH以及Alexa Fluor?647熒光二抗(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。pcDNA3.1-MCT2重組質(zhì)粒及陰性對照pcDNA3.1-NC重組質(zhì)粒交由上海吉凱基因公司設(shè)計構(gòu)建。
1.2方 法
1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:RGC-5細胞采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的RGC-5細胞,接種于6孔培養(yǎng)板,在培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng),確保細胞貼壁后密度80~90%,采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑盒將pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RGC-5細胞中,記為MCT2組,NC組將pcDNA3.1-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RGC-5細胞中,并以正常培養(yǎng)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的RGC-5細胞作為對照組,轉(zhuǎn)染具體按照試劑盒說明書進行,4h后更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后,通過實時熒光定量PCR和Western blot測定轉(zhuǎn)染效果,收集各組細胞進行后續(xù)實驗研究。
1.2.2實時熒光定量PCR:Trizol法提取細胞總RNA,微量核酸測定儀檢測總RNA純度與濃度,OD260/OD280值在1.8~2.0即為合格。取提取的總RNA,按照M-MLV試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以獲得cDNA作為模板,通過實時熒光定量PCR實驗進行擴增以測定目的基因mRNA的表達水平,在CFX96熒光定量PCR儀上進行檢測,GAPDH作為內(nèi)參基因。程序設(shè)置為:預(yù)變性,95℃ 5min;循環(huán)反應(yīng),95℃ 10s、60℃ 30s,循環(huán)35次,實驗重復(fù)3次。擴增結(jié)束后,采用χ2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。具體引物序列如下:MCT2,上游引物5’-CGTTGACAGCGAGGCGAATC-3’,下游引物5’-GTGGCATTTCTGCTCCTAGAGT-3’;GAPDH,上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’,下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。
1.2.3Western blot法:在細胞中加入預(yù)冷RIPA緩沖液置于冰上裂解,提取總蛋白,Bradford法檢測蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠,將蛋白樣品與上樣緩沖液混合,沸水浴煮沸10min,上樣至凝膠加樣孔內(nèi),經(jīng)恒壓電泳分離蛋白,通過濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜,以5%脫脂奶粉封閉2h,TBST洗膜,加入稀釋后的一抗工作液,4℃孵育過夜。次日,棄去一抗,TBST洗膜后,加入對應(yīng)稀釋后的二抗工作液,室溫放置1h,TBST再次洗膜,利用ECL顯色,經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)掃膜后拍攝圖像,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為目的蛋白相對表達量。
1.2.4細胞H/R處理:取對數(shù)生長期的RGC-5細胞,0.25%胰酶消化,加入新鮮培養(yǎng)基制備細胞懸液,接種于24孔培養(yǎng)板,將其置于含有94%N2、5%CO2以及1%O2的培養(yǎng)箱,造成細胞缺氧,持續(xù)4h后,除去原培養(yǎng)液,更換新鮮培養(yǎng)液,并將細胞移至37℃、5%CO2以及21% O2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h,使細胞復(fù)氧。
1.2.5實驗分組與處理:實驗分為4組進行,具體分組與處理如下:①對照組,RGC-5細胞正常培養(yǎng),不進行任何處理;②H/R組,RGC-5細胞進行H/R處理;③MCT2組,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒至RGC-5細胞,并進行H/R處理;④MCT2+ML385組,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒至RGC-5細胞,進行H/R處理后使用Nrf2抑制劑2μmoL/L的ML385處理細胞24h。各組細胞進行相應(yīng)處理后,收集細胞。
1.2.6CCK-8法:將處理后的各組RGC-5細胞接種于96孔板,放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別在24、48、72h檢測細胞的增殖活性,每分組設(shè)置6復(fù)孔,在各孔內(nèi)加入CCK-8檢測液,混合均勻,放于培養(yǎng)箱反應(yīng)2h后,酶聯(lián)免疫檢測儀測定450nm處各孔細胞的光密度值(OD值)。
1.2.7流式細胞術(shù):將收集的各組RGC-5細胞以1500rpm離心5min,棄上清,PBS洗滌沉淀,加入適量Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細胞,調(diào)整密度為5×105個/mL,取100μL懸液移入干凈離心管,依次添加5μL Annexin V-FITC和10μL PI,混勻,進行雙染操作,室溫避光孵育30min后,通過流式細胞儀測定各組細胞凋亡情況。
1.2.8Hoechst/PI染色法:將RGC-5細胞按分組處理完畢后,接種于含細胞爬片的24孔板中培養(yǎng)24h,更換為1mL含有染色液(5μL Hoechst 33342和5μL PI)的培養(yǎng)液進行處理,放置于37℃培養(yǎng)箱孵育30min,吸棄染色液,PBS清洗細胞,抗熒光淬滅劑封片,通過熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況,PI為紅色熒光,Hoechst為藍色熒光,隨機選擇6個視野,計數(shù)紅染細胞與藍染細胞,以兩者比值作為PI凋亡指數(shù)。
1.2.9免疫熒光染色:收集各組RGC-5細胞接種于含細胞爬片的24孔板中,加入預(yù)冷的丙酮固定細胞,采用0.25%Triton-X穿透液室溫作用10min,再用10%山羊血清在37℃下封閉2h,滴加特異性一抗Nrf2(1∶200)或Caspase-1(1∶200),濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日,棄一抗,并用PBS清洗干凈,滴加熒光標(biāo)記二抗(1∶500),室溫繼續(xù)孵育1h,PBS清洗后,采用DAPI常溫避光孵育30min進行染核,PBS再次清洗后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況,并采集圖片,Image Pro Plus 6.0系統(tǒng)計算蛋白染色的熒光強度。
2.1各組細胞內(nèi)MCT2 mRNA與蛋白表達水平比較:轉(zhuǎn)染后測定細胞內(nèi)MCT2在mRNA與蛋白上的表達變化,與對照組比較,MCT2組細胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05);此外,相較于NC組,MCT2組細胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對表達量也均顯著上調(diào)(P<0.05),見圖1。
圖1 各組細胞MCT2 mRNA與蛋白表達水平測定結(jié)果
2.2各組細胞增殖活性比較:CCK-8檢測各組細胞增殖活性變化,檢測結(jié)果顯示,在24h、48h及72h,H/R組細胞增殖活性較對照組顯著下降(P<0.05);MCT2組細胞增殖活性則顯著高于H/R組細胞增殖活性(P<0.05);而相較于MCT2組,MCT2+ML385組細胞增殖活性顯著下降(P<0.05),見圖2。
圖2 CCK-8檢測各組細胞增殖活性
2.3各組細胞凋亡與焦亡水平比較:流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,H/R組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);MCT2組細胞凋亡率較H/R組則顯著減少(P<0.05);此外,MCT2+ML385組細胞凋亡率較MCT2組顯著增加(P<0.05),見圖3。
圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率
由Hoechst/PI染色法檢測結(jié)果可見,各組細胞內(nèi)均出現(xiàn)PI紅色熒光,說明細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡,與對照組比較,H/R組細胞PI凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05);與H/R組比較,MCT2組細胞PI凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05);與MCT2組比較,MCT2+ML385組細胞PI凋亡指數(shù)則顯著升高(P<0.05),見圖4。
圖4 Hoechst/PI染色觀察各組細胞凋亡情況(比例尺=100μm)
2.4各組細胞內(nèi)凋亡與焦亡蛋白表達水平比較:Western blot檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達水平,與對照組比較,H/R組細胞中Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著上調(diào),Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05);與H/R組比較,MCT2組中Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著下調(diào),Bcl-2蛋白相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05);與MCT2組比較,MCT2+ML385組Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著上調(diào),同時,Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05),見圖5。
圖5 Western blot檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達
Western blot檢測細胞內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達水平,H/R組細胞內(nèi)GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量較對照組均顯著上調(diào)(P<0.05);與H/R組比較,MCT2組內(nèi)GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05);而相較于MCT2組,MCT2+ML385組GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05),見圖6。
圖6 Western blot檢測各組細胞焦亡相關(guān)蛋白表達
2.5各組細胞內(nèi)Nrf2與Caspase-1蛋白免疫熒光染色結(jié)果:免疫熒光染色觀察各組細胞內(nèi)Nrf2與Caspase-1表達,染色結(jié)果顯示,與對照組比較,H/R組細胞內(nèi)Nrf2熒光強度顯著減弱,Caspase-1熒光強度顯著增強(P<0.05);與H/R組比較,MCT2組細胞內(nèi)Nrf2熒光強度顯著增強,Caspase-1熒光強度顯著減弱(P<0.05);而相較于MCT2組,MCT2+ML385組細胞內(nèi)Nrf2熒光強度顯著減弱,Caspase-1熒光強度顯著增強(P<0.05),見圖7。
圖7 免疫熒光染色檢測各組細胞Nrf2與Caspase-1表達(比例尺=50μm)
目前,視網(wǎng)膜缺血再灌注已被公認為各種視網(wǎng)膜疾病的關(guān)鍵病理因素,包括視網(wǎng)膜血管阻塞、急性青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。急性青光眼作為最常見且最危險的眼部疾病,主要是由眼內(nèi)壓的快速升高和降低引起的,可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、軸突損傷和后續(xù)的視力喪失。盡管濾過手術(shù)和降壓藥等降低眼壓的策略在臨床實踐中得到廣泛應(yīng)用,但一些開角型青光眼患者無法通過降低眼壓獲得有效治療,此外,降低眼壓的藥物如前列腺素類似物和縮瞳劑等,會產(chǎn)生各種局部或全身性副作用,從而限制了這類藥物的臨床應(yīng)用[4]。因此,探索視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中相關(guān)的分子機制以開發(fā)安全有效的治療靶點,并對促進視網(wǎng)膜缺血再灌注介導(dǎo)的其他視網(wǎng)膜疾病的預(yù)防與治療均具有重大意義。
SLC16由MCT家族的14個成員組成,這些成員在細胞營養(yǎng)物質(zhì)運輸以及細胞代謝和pH調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要作用,與激素、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)。近年來,MCT1~4被研究者們進行了大量且廣泛的研究,已揭示其參與了L-乳酸、丙酮酸、短鏈脂肪酸和單羧酸在各種組織中質(zhì)子依賴型的轉(zhuǎn)運[5]。此外,MCT1、MCT 2和MCT 4在多種癌癥中過度表達,并與癌癥的預(yù)后惡化有關(guān),抑制其表達可作為癌癥的一種新治療策略。MCT2在肝臟、腎、腦、心臟、脾臟等多種組織中表達,與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),例如Harun-Or-Rashid等[6]通過將攜帶MCT2的AAV2腺相關(guān)病毒注射入青光眼模型中以提高MCT2表達后發(fā)現(xiàn),MCT2促進了高眼壓期間單羧酸鹽在視網(wǎng)膜中的轉(zhuǎn)運,增加了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量,改善能量穩(wěn)態(tài)并維持視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的線粒體功能,這一結(jié)果提示MCT2可能在改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損傷方面也發(fā)揮積極作用。
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡是包括青光眼在內(nèi)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷引發(fā)的疾病中的主要變化,此外,急性青光眼的眼壓升高與視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的凋亡呈正相關(guān)[7]。細胞焦亡即炎癥性程序性細胞死亡,對于防御病原微生物和機體危險信號至關(guān)重要。當(dāng)遭受缺血性損傷時,受損組織會釋放危險信號,激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體,活化的NLRP3炎癥小體隨后裂解gasdermin D(GSDMD)蛋白,同時激活下游Caspase-1而催化炎癥因子IL-1β等的成熟和釋放,導(dǎo)致細胞焦亡發(fā)生。然而,過度的細胞焦亡會導(dǎo)致細胞不斷腫脹和裂解,從而致使細胞內(nèi)容物大量釋放,從而引發(fā)強烈的促炎反應(yīng)[8]。在機體內(nèi),細胞凋亡與焦亡的分子機制有所不同但又存在著一定聯(lián)系,腫瘤細胞焦亡機制在一定刺激下會被啟動,且在細胞焦亡現(xiàn)象中有檢測到Caspase-1通路的激活,而Caspase-1能夠進一步激活caspase-3/7誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。而在H/R誘導(dǎo)的各種組織細胞損傷中抑制細胞凋亡途徑的激活及焦亡相關(guān)因子的表達,可降低炎癥與組織損傷,減緩疾病病程的發(fā)展[10]。本研究結(jié)果顯示,在H/R誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中過表達MCT2后,細胞增殖活性得到提高,細胞凋亡率減少,促凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達下調(diào)而抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào),同時,細胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β表達均下調(diào),由此說明,MCT2抑制了H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡與焦亡。
本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Nrf2熒光強度減弱而Caspase-1熒光強度升高,而在H/R誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中過表達MCT2后,細胞中Nrf2熒光強度增加,Caspase-1熒光強度減弱。Nrf2是全身抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子,在正常情況下,Nrf2與具有CNC同源性(ECH)相關(guān)蛋白1(Keap1)的Kelch樣紅細胞衍生蛋白結(jié)合作為復(fù)合物,并被限制在細胞質(zhì)中進行泛素化和蛋白酶體降解;而在壓力條件下,Nrf2與Keap1分離并轉(zhuǎn)移到細胞核中,與DNA啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,啟動ARE控制的抗氧化酶轉(zhuǎn)錄[11]。大量研究表明,激活Nrf2在眼神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用,例如,富馬酸單甲酯在缺血再灌注損傷后通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)元保護作用,明顯改善了Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化基因的表達,降低了炎癥基因的表達,減少了神經(jīng)節(jié)細胞層中神經(jīng)元細胞損傷,并改善了小鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜功能;MicroRNA-141作為Keap1的靶向抑制劑,可在紫外線誘導(dǎo)后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中引發(fā)Nrf2激活和細胞核易位,使ARE控制的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄水平增強,從而減弱紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞死亡[12]。因此推測,在本研究中MCT2可能是通過激活Nrf2發(fā)揮了對H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用,為了進一步驗證該作用,通過以Nrf2抑制劑ML385抑制Nrf2激活后,MCT2對H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用消失或減弱。
綜上所述,H/R處理可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡及焦亡,使細胞增殖活性下降,而MCT2能夠減輕H/R處理下細胞凋亡與焦亡,從而達到保護視網(wǎng)膜的作用,該作用可能是通過介導(dǎo)Nrf2激活實現(xiàn)的。本研究為視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷以及其他視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的治療研究提供了分子機制及理論依據(jù),但關(guān)于MCT2在該體內(nèi)試驗中是否同樣發(fā)揮作用需要進一步驗證。