范李靜，張 苗，鄭瑛紅，劉文杰，范小斌

(西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710021)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUAs)，也稱為Asherman綜合征，是一種子宮疾病，其特征是子宮內(nèi)膜受損，盆腔或?qū)m內(nèi)發(fā)生疤痕和粘連[1]。宮腔粘連是宮內(nèi)手術(shù)或子宮內(nèi)膜感染、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎有關(guān)的并發(fā)癥[2]。宮腔粘連發(fā)生的主要原因是細胞外基質(zhì)生成和降解異常，細胞外基質(zhì)過度的堆積導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化進一步形成瘢痕發(fā)生宮腔粘連。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種較強的促纖維化因子，與創(chuàng)面的修復(fù)愈合有關(guān)，高表達的TGF-β1對纖維疤痕組織的形成有促進作用。TGF-β1激活后，可與其受體結(jié)合并激活下游Smad信號，包括Smad2和Smad3，使其組織發(fā)生纖維化[3]。已有相關(guān)研究表明，TGF-β1/Smad信號通路參與宮內(nèi)粘連[3]。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的、內(nèi)源性的、非編碼的、由18～22個核苷酸組成的單一RNA分子，通過直接結(jié)合其靶基因的3'-UTR調(diào)控基因表達[4]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs的失調(diào)參與了宮腔粘連。宮腔粘連小鼠的子宮內(nèi)膜中miR-1291水平顯著升高[5]。miR-34a-5p具有促細胞凋亡和抗細胞增殖的能力[6]。miR-34a-5p在纖維化疾病肝硬化中表達降低，人肝星狀細胞中過度表達miR-34a-5p通過靶向Smad4和調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3途徑可以改善肝纖維化的發(fā)展[7]。而miR-34a-5p在宮腔粘連纖維化疾病中的研究未見相關(guān)研究報道。基于此，本文擬研究miR-34a-5p在子宮內(nèi)膜纖維化中的作用，并探討其可能機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月至2021年6月于西安市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行宮腔鏡檢查并確診為宮腔黏連的患者20例，年齡30～45歲。納入標準：經(jīng)宮腔檢查符合宮腔粘連的診斷。排除標準：合并婦科惡性腫瘤、不典型增生；合并生殖道和泌尿道急性感染。選取同期行宮腔鏡檢查的非宮腔黏連患者20例(因子宮縱膈、不孕或節(jié)育器嵌頓)作為對照組，年齡21～35歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑、儀器 人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(human endometrial stromal cell，hESC，CL0453)購自湖南豐暉生物；psiCHECK-2質(zhì)粒購自美國Promega；胎牛血清、雙抗購自Hyclone；MEM+NEAA培養(yǎng)基(PM150410)購自武漢普諾賽；TGF-β1(10804-HNAC)購自北京義翹神州；miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1-Smad4過表達質(zhì)粒購自上海吉瑪基因；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)、FastStart Essential DNA Green Master(06924204001)購自美國Roche公司；psiCHECK-2-WT-Smad4、psiCHECK-2-MUT-Smad4質(zhì)粒合成于北京擎科生物；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)購自美國Thermo；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(ab5831)、膠原蛋白Ⅰ(collagen I，COL1A1)抗體(ab138492)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)抗體(ab45688)和Smad4抗體購自英國Abcam；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(C008-3)、Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(A005-3)購自上海七海復(fù)泰。

1.3 實驗方法

1.3.1 hESC細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo) hESC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(MEM+NEAA+1%雙抗)，5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期hESC細胞，0.25%胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞濃度，按3×105細胞/孔鋪至6孔板。待細胞貼壁，更換成含5%血清的培養(yǎng)基，分別加5ng/mL和10ng/mL的TGF-β1處理細胞24h和48h，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)孔。

1.3.2 miR-34a-5p mimics轉(zhuǎn)染hESC細胞 將hESC細胞按5×104細胞/孔鋪至24孔板，待細胞匯合度為40%左右時每孔加50pmol/L miR-34a-5p mimics或mimics NC，經(jīng)X-treme GENE siRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染24h，檢測miR-34a-5p表達以驗證轉(zhuǎn)染效率。細胞分組：Control組：未處理的正常hESC細胞；TGF-β1組：10ng/mL TGF-β1處理hESC細胞；mimics NC組：hESC細胞轉(zhuǎn)染mimics NC后經(jīng)10ng/mL TGF-β1處理；miR-34a-5p mimics組：hESC細胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics后經(jīng)10ng/mL TGF-β1處理。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖 根據(jù)細胞增殖與毒性檢測試劑盒使用說明書，將對數(shù)生長期hESC細胞用0.25%胰蛋白酶消化并接種至96孔板。經(jīng)特定處理后，每孔加100 μL 7Sea-Cell Counting Kit溶液，置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h，酶標儀測定每孔在450nm處的吸光值。

1.3.4 miR-34a-5p靶基因預(yù)測 利用miRanda、TargetScan及PicTar數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-34a-5p的潛在靶基因并取其交集。利用David網(wǎng)站對得到的188個靶基因進行KEGG通路分析，并篩選miR-34a-5p的靶基因。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?經(jīng)生物信息學(xué)分析，初步篩選Smad4為miR-34a-5p的靶基因；將包含miR-34a-5p結(jié)合序列的psiCHECK-2-Smad4野生質(zhì)粒(psiCHECK-2-Smad4-wt)及psiCHECK-2-Smad4突變質(zhì)粒(psiCHECK-2-Smad4-mut)分別與miR-34a-5p mimics和mimics NC用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染入人胚腎細胞HEK-293T。 48h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒檢測Smad4的熒光強度，驗證miR-34a-5p和Smad4之間的靶向關(guān)系。

1.3.6 Smad4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 分離、純化并擴增Smad4的基因片段，與pCDNA3.1連接(pCDNA3.1-Smad4)，空質(zhì)粒載體pCDNA3.1-vector作為陰性對照。將pCDNA3.1-Smad4和pCDNA3.1-vector用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染入hESC細胞，孵育48h后檢測Smad4表達以驗證轉(zhuǎn)染效率。將miR-34a-5p mimics和Smad4過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至hESC細胞，TGF-β1處理24h檢測hESC細胞的增殖情況和纖維化情況。

1.3.7 實時定量PCR hESC細胞和經(jīng)研磨處理的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)TRizol裂解液裂解提取樣本的RNA。Nanodrop分光光度計測定RNA濃度。Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測。反應(yīng)條件：95℃，300s；95℃，5s，60℃，30s，循環(huán)次數(shù)為45次。

1.3.8 Western blot檢測 將收集的細胞加適量體積的RIPA裂解液并收集上清。BCA法測定總蛋白濃度。準備好樣品，用微量進樣器上樣，每孔上樣量20μg蛋白，使用恒壓80V電泳。電轉(zhuǎn)至PVDF膜(電流200mA轉(zhuǎn)膜2h)，5%脫脂奶粉室溫搖床孵育封閉1h。PVDF膜加入α-SMA、fibronectin和COL1A一抗， 4℃搖床過夜孵育。將膜置于二抗稀釋液，室溫搖床孵育1h。加入ECL蛋白發(fā)光液觀察蛋白條帶，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-34a-5p在宮腔粘連內(nèi)膜組織及TGF-β1處理后hESC細胞中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與未粘連組[1.38(0.65，2.05)]相比，粘連組的miR-34a-5p表達水平[0.74(0.42，1.01)]顯著降低(Z=-2.218，P=0.027)。10ng/mL TGF-β1分別處理hESC細胞24、48h后，細胞中miR-34a-5p表達水平顯著降低(P<0.01)。后續(xù)均用10ng/mL TGF-β1處理hESC細胞24h。見圖1。

圖1 TGF-β1處理的hESC細胞中miR-34a-5p表達水平#P<0.01 vs control組

2.2 miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)hESC增殖和細胞形態(tài)的影響 CCK-8結(jié)果顯示，TGF-β1組hESC細胞增殖顯著高于對照組[(114.1±0.94)% vs (100 ±0.76)%，P= 0.003]；與mimics NC組相比，miR-34a-5p mimics組細胞增殖顯著下降[(113.8±1.1)% vs (105.4± 0.5)%，P=0.001]。Control組細胞形態(tài)呈圓形或卵圓形，胞間連接緊密。TGF-β1誘導(dǎo)后細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細胞多為長梭形，細胞間隙較大。miR-34a-5p mimics組細胞形態(tài)與Control組相似，多為圓形或卵圓形(圖2)。

圖2 miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)的hESC細胞形態(tài)的影響A:Control;B:TGF-β1;C:TGF-β1+mimics NC;D:TGF-β1+ miR-34a-5p mimics

2.3 miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)hESC纖維化的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，TGF-β1組纖維化標志物α-SMA、fibronectin和COL1A1顯著升高(P<0.05)，miR-34a-5p mimics組的α-SMA、fibronectin和COL1A1表達顯著低于mimics NC組(P<0.05)。見圖3。提示miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)的hESC纖維化有抑制作用。

圖3 miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)hESC纖維化的影響A～C:qRT-PCR檢測hESC細胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1的mRNA的表達水平； D～G:Western blot法檢測hESC細胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1蛋白表達水平;*P<0.05;1:control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NC;4:TGF-β1+miR-34a-5p mimics

2.4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因 David網(wǎng)站分析顯示，miR-34a-5p的靶基因主要分布于TGF-β 通路，這些靶基因主要包括Smad4、p70S6k等。Smad4作為TGF-β的激活分子是miR-34a-5p的一個靶基因(圖4A)。雙熒光素酶報告基因結(jié)果表明，與陰性對照組比較，miR-34a-5p可顯著抑制Smad4 3'-UTR野生型的報告基因活性，而對Smad4 3'-UTR突變型的報告基因活性沒有影響(圖4A)。表明miR-34a-5p可作用于Smad4的3'-UTR區(qū)。Western blot結(jié)果表明，miR-34a-5p過表達可顯著下調(diào)Smad4蛋白的表達水平(圖4B)。

圖4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因A：雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒hESC細胞中的熒光強度；B：Western blot法檢測過表達miR-34a-5p后Smad4表達水平；*P<0.05

2.5 Smad4參與miR-34a-5p的抗增殖、抗纖維化作用 與空載體對照處理的hESC相比，Smad4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hESC細胞后Smad4表達水平升高2.3倍(P=0.004)。見圖5A、B。過表達Smad4后，hESC細胞活力顯著升高(圖5C)。與共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p和空載對照的hESC細胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p和Smad4過表達質(zhì)粒的hESC細胞內(nèi)α-SMA(P=0.01)和COL1A1(P<0.01)mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(圖5D～H)。

圖5 Smad4參與miR-34a-5p對TGF-β1誘導(dǎo)hESC細胞增殖和纖維化作用的抑制A、B：Smad4過表達效率檢測；C：CCK-8檢測各組hESC細胞活力；D、E:qRT-PCR檢測各組hESC細胞α-SMA和COL1A1 mRNA表達量；F:Western blot法檢測hESC細胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達水平；G、H:hESC細胞中α-SMA和COL1A1蛋白相對定量水平。*P<0.05；#P<0.05;1:miR-34a-5p mimics;2:miR-34a-5p mimics+Scramble;3:miR-34a-5p mimics+Smad4

3 討 論

宮腔粘連是育齡婦女最常見的疾病之一，中度至重度宮腔粘連患者正常月經(jīng)模式減少、閉經(jīng)甚至不孕，對患者的身心健康產(chǎn)生不利影響。TGF-β在宮腔粘連的形成中起重要作用，宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜中TGF-β蛋白水平顯著升高，促進子宮內(nèi)膜發(fā)生纖維化[8]。

miRNAs在纖維化的調(diào)節(jié)中起著決定性的作用。miR-326在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中下調(diào)，miR-326通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路抑制子宮內(nèi)膜纖維化[9]。miR-543通過抑制子宮內(nèi)膜細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制宮腔粘連的發(fā)生和發(fā)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮腔粘連內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達量降低。miR-34家族具有強大的促細胞凋亡和抗細胞增殖的作用[6]。miR-34a-5p參與腎小管間質(zhì)纖維化及肝臟纖維化等多種纖維化疾病[7,11]。目前miR-34a-5p是否影響宮腔粘連纖維化還未見研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p參與hESC細胞的纖維化，miR-34a-5p表達增加可降低hESC細胞的纖維化進程。這與Zhang等[12]研究結(jié)果相似，即miR-34a可通過減少I型膠原蛋白的產(chǎn)生以及通過靶向Pin-1信號傳導(dǎo)減輕糖尿病性心肌病的心肌纖維化。但也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a促進肝星狀細胞及腎小球系膜細胞纖維化[13-14]。上述結(jié)果的差異可能與細胞及疾病種類相關(guān)。

Smad4表達失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，如組織纖維化、炎癥和癌變，提示Smad4在治療這些疾病方面具有治療潛力[15]。本研究利用miRanda、TargetScan、Pictar數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-34a-5p的潛在靶基因，預(yù)測Smad4的3'UTR區(qū)和miR-34a-5p可能有結(jié)合位點；使用雙熒光素酶報告驗證確定Smad4的3'UTR區(qū)和miR-34a-5p有結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，Smad4表達水平影響纖維化，hESC細胞共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics和Smad4后，過表達Smad4可逆轉(zhuǎn)miR-34a-5p mimics抗纖維化作用。表明Smad4與miR-34a-5p共同影響TGF-β1介導(dǎo)的hESC細胞纖維化進程，參與miR-34a-5p的抗增殖抗纖維化作用。

綜上所述，宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達量降低；miR-34a-5p可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的hESC細胞的增殖和纖維化；miR-34a-5p及其靶基因Smad4共同調(diào)控hESC細胞的增殖和纖維化，有望成為宮頸粘連的新治療靶點。