喬鳳昌，程 青，張翠平，許爭峰

(南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，南京市婦幼保健院，南京 210004)

Joubert綜合征是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床典型特征為小腦蚓部發(fā)育不全或缺如、肌張力減退、眼部運動和呼吸異常、不同程度的智力低下及生長發(fā)育遲緩等。影像學磁共振成像為“臼齒狀”，即由伸長的小腦上腳和增寬的腳間窩構成[1]。目前已發(fā)現(xiàn)35個致病基因，主要遺傳方式為常染色體隱性遺傳，也有性染色體遺傳，具有臨床異質性和遺傳異質性[2]。因此，臨床上對于Joubert綜合征的診斷具有一定難度。本研究用外顯子測序技術(exome sequencing,ES)對患腦積水的胎兒進行基因測序分析以明確其病因，為家系的遺傳咨詢、再次妊娠提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 孕婦，27歲，G2P0。孕18周因“產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒腦部發(fā)育不良”于2020年12月28日于南京市婦幼保健院就診。孕婦本次妊娠為自然受孕，于當?shù)蒯t(yī)院早期NT檢查提示小腦延髓池稍寬，約4mm，胎兒NT<第95th百分位，建議16周復查超聲。孕16+2周于當?shù)蒯t(yī)院復查超聲提示側腦室寬4mm，小腦延髓池明顯增寬，約7mm，雙側小腦半球明顯變小，未探及小腦蚓部回聲。孕18周本院復查超聲提示胎兒顱后窩增寬約1.2cm，小腦蚓部未能清晰顯示，小腦半球顯示不完整，Dandy-Walker綜合征不能排除。孕婦曾于2019年因“孕20周，胎兒腦積水，右足內(nèi)翻可能”于當?shù)蒯t(yī)院引產(chǎn)1次，引產(chǎn)胎兒染色體微陣列檢查結果未見異常。否認家族遺傳病史，否認近親婚配。夫妻雙方及其他成員均未見異常表型，家系圖見圖1A。

圖1 家系圖和Sanger測序驗證結果A:家系圖；B:外顯子測序技術檢測出患兒TMEM216基因c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的復合雜合突變；C:Sanger測序驗證患兒TMEM216基因的復合雜合突變

經(jīng)遺傳咨詢和簽署知情同意書后，分別采集胎兒羊水15mL和父母外周血5mL，提取DNA后進行外顯子測序檢測基因突變情況。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 全外顯子測序 采用家系的方式對胎兒及父母進行檢測。DNA樣本經(jīng)過超聲隨機打斷為300～600bp大小，采用Agilent SureSelect XT Library Prep Kit建庫試劑盒和Agilent SureSelect XT Human All Exon V6 kit捕獲試劑盒(Agilent,Santa Clara,CA,USA)對樣本進行建庫和外顯子捕獲。富集的捕獲區(qū)域通過PCR的方法擴增后進行測序(Illumina Hiseq 2500平臺，2×150bp讀長模式)[3]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 去除接頭和低質量數(shù)據(jù)后，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner,v 0.7)軟件將測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組序列(GRCh37/hg19),samtool(v 0.1.18)軟件去除PCR重復序列后分別使用GATK(v 4.0)和Annovar軟件獲取位點變異和注釋信息。過濾掉最小等位基因頻率(GenomAD數(shù)據(jù)庫)>0.5%的位點后，根據(jù)軟件(Revel,Mutationtaster,Human Splicing Finder等)預測蛋白的功能改變、基因與表型關系(HPO數(shù)據(jù)庫)、遺傳方式(OMIM數(shù)據(jù)庫)、家系共分離情況等綜合考慮確定候選致病基因和位點。根據(jù)ACMG(2015)原則對變異位點進行致病性判斷[4]。

1.2.3 Sanger測序 使用NCBI在線軟件(Primer-Blast,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=Blast Home)設計用于擴增TMEM216(NM_001173990.3)基因的引物，并由金唯智公司合成。針對c.357_359dup(p.I119.dup)的引物序列：上游5'-TCACATCTCCCACGCCTTTC-3',下游5'-AGAAATGGTCCCTCAGCAGC-3',退火溫度60℃,產(chǎn)物大小304bp。針對c.217C>T(p.R73C)的引物序列：上游5'-TTCCCAAGTGTGTGGCAGTT-3',下游5'-GCCCTGACGTGGAGTTACAA-3',退火溫度60℃,產(chǎn)物大小487bp。反應條件95℃ 10min;95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,共35個循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴增產(chǎn)物送金唯智公司進行一代測序驗證。

2 結 果

2.1 外顯子測序結果 患兒外顯子測序捕獲效率為73.02%，目標區(qū)域平均測序深度96.98×，其中測序深度20×以上的區(qū)域占目標捕獲區(qū)域的97.61%，覆蓋度良好。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在TMEM216基因(NM_001173990.3)上存在復合雜合突變。分別為第3號外顯子c.217C>T(p.R73C)的雜合突變，遺傳自父親；第4號外顯子c.357_359dup(p.I119.dup)的雜合突變，遺傳自母親(圖1B)。c.217C>T(p.R73C)位點在GnomAD數(shù)據(jù)庫中的人群頻率為0.000028(PM2)；據(jù)文獻報道，有患者中檢出該變異[5-9](PM3_P)；該變異與致病變異c.218G>T(p.R73L)、c.218G>A(p.R73H)在同一位置有不同的氨基酸改變(PM5_S)；對之前引產(chǎn)的胎兒留存的DNA進行Sanger測序驗證發(fā)現(xiàn)前一胎患兒同樣遺傳此位點(PP1)。根據(jù)ACMG(2015)指南，該變異判讀為疑似致病變異(PM2+PM3_P+PM5_S+PP1)；c.357_359dup(p.I119.dup)位點在GnomAD數(shù)據(jù)庫中未收錄(PM2)；反式位置有疑似致病性突變(PM3)；該變異為非重復區(qū)框內(nèi)插入，導致多肽鏈的長度發(fā)生改變(PM4)；前一胎患兒同樣遺傳此位點(PP1)。根據(jù)ACMG指南，該變異判讀為疑似致病變異(PM2+PM3+PM4+PP1)。OMIM數(shù)據(jù)庫顯示該基因的突變會導致Joubert綜合征2型。

2.2 Sanger測序驗證結果 兩個胎兒的TMEM216基因均存在c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的復合雜合突變，分別遺傳自父母，與外顯子測序結果一致(圖1C)。

3 討 論

Joubert綜合征的發(fā)病與纖毛結構及功能異常、Shh信號通路相關，臨床異質性和遺傳異質性較強，涉及35個基因，同一個基因的變異會引起不同表型，不同基因可能導致相同的表型；根據(jù)受累器官的差別分為6種亞型：單純型、合并眼缺陷型、合并視網(wǎng)膜缺陷型、合并肝臟缺陷型、合并腎缺陷型和伴有口面部畸形[2]。因此，臨床上對Joubert綜合征進行鑒別診斷相當困難。超聲影像學檢測具有非特異性和不敏感性，當有表型與其他疾病重疊時則無法做出診斷。胎兒除了明顯的結構異常和軟指標異常外，其他異常(如生理性的異常)超聲檢查無法檢出，且胎兒期無法表現(xiàn)出疾病應有的表型?？紤]到孕婦連續(xù)兩胎均有類似的癥狀可能為遺傳因素導致，因此采用外顯子測序技術為患者尋找致病原因。

通過外顯子測序技術對本次胎兒及父母進行檢測，發(fā)現(xiàn)胎兒TMEM216基因的復合雜合突變，分別遺傳自父母，父母決定終止妊娠。TMEM216基因(NM_001173990.3)位于11q12.2，含有5個外顯子，編碼145個氨基酸，形成的蛋白含有跨膜結構域。Valente等在胎兒組織中首次鑒定，原位雜交結果顯示TMEM216在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢芽、腎臟和軟骨中表達，在小鼠的內(nèi)髓集尿管細胞、人視網(wǎng)膜色素上皮細胞和近端腎小管上特異性表達，定位于初生纖毛的基部或臨近的基體部，是纖毛的組裝和功能所必需[5]。目前研究顯示，TMEM216基因有127個變異，包含錯義突變、剪切位點突變、移碼突變、內(nèi)含子突變等(數(shù)據(jù)來源于GeneCards數(shù)據(jù)庫:https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMEM216&keywords=TMEM216#snp)，但目前尚無產(chǎn)前的病例報道。TMEM216基因突變屬于常染色隱性遺傳模式，該病例存在復合雜合突變，分別位于c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)。錯義突變c.217C>T(p.R73C)和框內(nèi)插入變異c.357_359dup(p.I119.dup)位于Transmemb_17結構域，變異破壞了蛋白的跨膜功能，前者已有致病性報道[6-9]，后者為新發(fā)現(xiàn)的變異位點。根據(jù)ACMG原則可對這兩個位點做出可疑致病的判斷，患兒診斷為Joubert綜合征2型患者。Joubert綜合征2型除了有腦部典型特征外，還可有肌張力減退、眼球震顫、斜視和腎功能障礙等特點[10]，但因患者為產(chǎn)前的胎兒，因此其他癥狀無法檢出或暫時沒有表型。此家系中兩個胎兒均遺傳了父母攜帶的雜合突變，父母再生育時需進行植入前產(chǎn)前診斷排除致病位點或自然妊娠，但自然妊娠的胎兒有25%概率仍遺傳此復合雜合變異，需妊娠期進行產(chǎn)前診斷。同時提示連續(xù)兩胎具有類似癥狀的患兒，其患隱性遺傳病的可能性較大。

本研究中夫妻曾有過一次不良孕產(chǎn)史，且染色體芯片結果未見異常，因此對于本次具有類似表型的胎兒直接進行外顯子測序，這種策略也符合ISPD最新的聲明[11]。已有報道發(fā)現(xiàn)連續(xù)兩次不良生育史的家庭其患兒的遺傳學病因是父母的復合雜合突變導致。Wang等[12]對連續(xù)兩次羊水過多胎兒進行外顯子測序檢測發(fā)現(xiàn)胎兒系LMOD3的c.1412delA(p.Lys471Serfs*18)和c.1283dupC(p.Gly429Trpfs*)變異引起的線狀體肌病。Wang等為兩個異染性腦白質營養(yǎng)不良患兒尋找到致病性原因是ARSA基因的c.302G>T和c.1344dupC復合雜合變異[13]。同時，Chitty等綜合分析了文獻報道的4350余例各系統(tǒng)畸形胎兒采用外顯子測序后的異常檢出情況，發(fā)現(xiàn)417例神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒在核型/染色體芯片檢出陰性后進行外顯子測序進一步確診的為17%(12%～22%)[14]。對于產(chǎn)后神經(jīng)系統(tǒng)異常的患者，神經(jīng)系統(tǒng)疾病專家組分析了30篇已有報道發(fā)現(xiàn)外顯子測序的檢出率為36%，單純神經(jīng)系統(tǒng)異?；颊叩臋z出率為31%，合并其他系統(tǒng)異常的檢出率高達53%[15]。因此，外顯子測序技術為神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒/患者尋找遺傳學病因的一項有效手段。

綜上所述，采用外顯子測序技術為患有Joubert綜合征2型的胎兒提供了遺傳學診斷，同時拓展了Joubert綜合征的致病基因變異譜，為該綜合征的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和再次妊娠提供了理論依據(jù)，進一步證實了外顯子測序技術在產(chǎn)前神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒中應用的可行性及價值。