郭維盛，郭和利，郭湧，郭秀權(quán)，蘇新國(guó)

（1.廣東笑咪咪食品有限公司，廣東 潮州 515638；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507）

隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏加快，慢性咽炎、無(wú)病因咳嗽以及口腔潰瘍等問(wèn)題成為常態(tài)，潤(rùn)喉糖具有清熱解毒、清肺止咳、清新口氣、提神解困等作用，消費(fèi)需求不斷升級(jí)，2019 年我國(guó)潤(rùn)喉糖市場(chǎng)產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到4.28 萬(wàn)噸，規(guī)模增長(zhǎng)至31.62 億元。目前國(guó)產(chǎn)潤(rùn)喉糖的主導(dǎo)產(chǎn)品是含中藥成分的潤(rùn)喉產(chǎn)品，其作用溫和，以緩解咳嗽、咽喉疼痛為主。潤(rùn)喉糖產(chǎn)品的配料包括甜味劑、轉(zhuǎn)化糖、玉米糖漿和藥食兩用中藥提取物，按照一定重量份比,經(jīng)過(guò)混合、加熱熬煮、冷卻、風(fēng)干、定型、包裝工藝制作而成的固態(tài)或半固態(tài)甜味食品。常見(jiàn)的藥食兩用資源有甘草、胖大海、薄荷腦、生姜、茯苓、枸杞等，均富含多酚類抗氧化物質(zhì)，具有潤(rùn)嗓、消腫、降火、解毒等功效[1]。如何提高多酚類物質(zhì)的提取率，保持較高的抗氧化活性，對(duì)于提升潤(rùn)喉糖產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。

近年來(lái)隨著廣東鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實(shí)施，廣東省共設(shè)立了16 個(gè)茶葉相關(guān)的現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)園，在茶葉加工及深加工規(guī)模與日遞增的同時(shí)，茶產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量廢棄物，如茶渣、茶梗、茶碎末等[2]。其中，茶梗在單叢茶生產(chǎn)中最為常見(jiàn)，約占總量的18%左右，茶梗富含多酚類物質(zhì)，具有較好的抗氧化活性成分，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等活性[3-4]，由于茶梗中纖維素含量較高，酚類物質(zhì)的提取率較低，長(zhǎng)期以來(lái)茶?；钚猿煞值难芯枯^少。前期研究表明，潤(rùn)喉糖混合植物配料可以由甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗按照4：3：1：2 的比例復(fù)配，粉碎后添加纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶在50℃下發(fā)酵2h，可以破壞茶梗細(xì)胞壁和纖維素糖苷鍵，從而有利于后續(xù)的多酚類物質(zhì)提取過(guò)程。

提取過(guò)程及其工藝參數(shù)對(duì)植物原料中生物活性成分的提取效率具有密切關(guān)系[5-6]。超聲波輔助提取法利用超聲波的機(jī)械作用、空化作用、熱效應(yīng)等，有效地促進(jìn)多酚等成分溶出，提高目標(biāo)成分的浸出率，具有綠色高效的特點(diǎn)[7]。響應(yīng)面法可以通過(guò)多因素來(lái)優(yōu)化復(fù)雜的提取過(guò)程，是優(yōu)化提取植物中活性成分的一種有效方法[8]，本研究以潤(rùn)喉糖混合植物配料為原料，采用超聲波輔助提取其多酚類物質(zhì)，以多酚得率為指標(biāo)，再通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度和液料比四個(gè)因素，及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化，研究超聲波輔助提取的最佳工藝參數(shù)，后續(xù)將為充分開(kāi)發(fā)和利用廣東茶產(chǎn)業(yè)的茶梗資源，提高茶葉的附加值提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

單叢茶梗：2021 年6 月產(chǎn)自廣東省潮州市登塘鎮(zhèn)世田村叢山茶廠，經(jīng)過(guò)3 次色選后剔除的單叢茶廢棄物。甘草、胖大海、干生姜：2021 年10 月購(gòu)置于廣州市藥材公司中藥飲片廠，生產(chǎn)時(shí)間為2021 年7月。

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、分析純無(wú)水乙醇、福林酚、碳酸鈉、30%過(guò)氧化氫、抗壞血酸（VC）等均為分析純，購(gòu)自廣州宴辰生物技術(shù)有限公司；纖維素酶（≥15 000 U/g）購(gòu)自山東信得利生物工程有限公司，半纖維素酶（≥40 000 U/g）購(gòu)自河北潤(rùn)步生物科技有限公司，淀粉酶（4U/mg）購(gòu)自上海閎潞生物科技有限公司。

（三）實(shí)驗(yàn)儀器

BSA123-CW 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；820DP 高功率數(shù)控超聲波清洗器（深圳市光點(diǎn)超聲波設(shè)備有限公司）；UV-27000島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易有限公司）；SHA-C 水浴恒溫振蕩器（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1.混合植物配料制備

將甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗按4：3：1：2的比例復(fù)配，粉碎后過(guò)20 目篩，稱取200g 混合植物配料粉，添加800mL 纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶（20：5：1）的復(fù)配酶溶液，將pH 值調(diào)整至6.5，在50℃下發(fā)酵2h，混合發(fā)酵液備用。

2.多酚回歸方程的建立

參照胡棟寶等人[9]的方法進(jìn)行完善，移取1.000 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品-乙醇溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL 和5.00mL 至50mL 容量瓶中，再加入10.0%福林酚溶液5.00mL。靜置8min后，加入7.5%碳酸鈉溶液4.00mL，混勻后分別用蒸餾水定容至50mL，在25℃室溫下振蕩反應(yīng)90min后，在765nm 處測(cè)定體系吸光度A，并以吸光度A對(duì)沒(méi)食子酸濃度c（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得多酚標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程：A=118.8c+0.031，R2=0.9916。

3.混合植物配料的多酚提取試驗(yàn)

稱取10g 混合發(fā)酵液（干物質(zhì)含量按20%計(jì)），置于1000 mL 錐形瓶中，以其干物質(zhì)含量設(shè)定在已設(shè)定的因素水平表，采用不同的超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、乙醇濃度和液料比進(jìn)行提取，反復(fù)兩次。合并提取液，濃縮至50mL，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，50%乙醇溶液定容，800 r/min 離心10 min 后收集上清液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法測(cè)定多酚含量。

4.多酚提取單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10g 混合發(fā)酵液原料，固定基準(zhǔn)提取條件：超聲提取時(shí)間30min，提取溫度60℃，乙醇濃度50%，液料比30：1。單因素試驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中，在所得單因素最佳水平基礎(chǔ)上依次考察提取時(shí)間（10min～50min）、提取溫度（40℃～80℃）、乙醇濃度（30%～70%）和液料比（10mL/g～50mL/g）對(duì)植物基料多酚提取效果的影響。

5.響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定其中的顯著因素為自變量，多酚提取量為響應(yīng)值，利用Box-Bohnken法在最優(yōu)提取條件下優(yōu)化提取試驗(yàn)方案，Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平編碼值見(jiàn)表1，超聲提取時(shí)間為A 因素，提取溫度為B 因素，乙醇濃度為C 因素，液料比為D 因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)編排組合共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中24 個(gè)析因點(diǎn)，5 個(gè)中心點(diǎn)。

表1 優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平表

（五）數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019 進(jìn)行繪圖，SPSS24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，Design Expert 8.06 對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。

二、結(jié)果與分析

（一）單因素試驗(yàn)

1.提取時(shí)間

如圖1 所示，微波輔助提取對(duì)混合植物配料總多酚提取量率的影響。超聲時(shí)間從10 min 延長(zhǎng)至50 min 的過(guò)程中，總多酚的提取量逐漸增加，從最開(kāi)始的6.5247mg/g 到30min 時(shí)達(dá)到峰值，為12.4902mg/g，之后又逐漸下降，提取時(shí)間延長(zhǎng)到50min 的時(shí)候，總多酚的提取量只有峰值的88.67%，這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波對(duì)多酚化合物等活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，多酚測(cè)定值下降，因此選擇30 min 作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.提取溫度

如圖2 所示，提取溫度在40℃～60℃區(qū)間，總多酚的提取量與溫度呈正相關(guān)，并在60℃的時(shí)候達(dá)到峰值。隨著提取溫度的升高，多酚提取量開(kāi)始下降，在80℃時(shí)的得率僅有峰值的72.07%，低于40℃條件下的提取量。提取溫度的升高有利于乙醇等溶劑與提取物進(jìn)行物質(zhì)交換，將多酚類物質(zhì)浸出。由于多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的還原性，在浸出的過(guò)程中也存在氧化的過(guò)程，當(dāng)浸出量低于氧化量時(shí)，則呈現(xiàn)總多酚提取量下降的情況，因此，選擇提取溫度60℃作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

3.乙醇濃度

如圖3 所示，多酚提取量隨乙醇濃度的升高而迅速提高，在乙醇濃度為60%時(shí)多酚提取量最大，繼續(xù)提高乙醇的濃度，多酚的提取量開(kāi)始緩慢下降，在乙醇濃度為70%時(shí)，得率是峰值的96.88%。由于高濃度乙醇對(duì)脂溶性成分有更好的溶出效率，擠占多酚的浸出空間，反而抑制了多酚物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致其提取率下降，這與冼麗清[10]的研究結(jié)果相近。由于50%濃度乙醇的多酚提取量是峰值的99.49%，相差無(wú)幾，因此從經(jīng)濟(jì)性上考慮，選取50%濃度作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

4.液料比

如圖4 所示，從10mL/g 開(kāi)始，多酚提取量隨液料比的提高呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢(shì)。在液料比為40 mL/g 時(shí)，混合植物配料的多酚提取量為11.3268mg/g，之后下降到峰值的88.61%；液料比在30mL/g 的情況下，多酚提取量為10.9658mg/g，達(dá)到峰值的96.81%，而液料比在20mL/g 的時(shí)候，多酚提取量為峰值的80.57%?？紤]到過(guò)大的溶劑用量將增加雜質(zhì)含量及后續(xù)烘干溶劑制備多酚浸膏的工作量和經(jīng)濟(jì)成本，因此，本次實(shí)驗(yàn)選取液料比30mL/g 作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

（二）響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

對(duì)混合植物配料的多酚得率響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚得率（Y）與超聲波提取各因素變量的二次回歸方程模型：

表2 Box-Bohnken 法優(yōu)化的提取實(shí)驗(yàn)方案

上述公式中，A 為提取時(shí)間(min)，B 為提取溫度（℃），C 為乙醇濃度(%)，D 為液料比（mL/g）。

由Design-Expert 8.0 軟件分析結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)方差及擬合程度進(jìn)行綜合分析，方差分析見(jiàn)表3。對(duì)比表3 的F 值可知，各因素影響效果的顯著性順序?yàn)椋篋＞A＞C＞B。各因素的二次項(xiàng)均極顯著，這與單因素影響效果不同，顯著性順序?yàn)椋篊2＞D2＞A2＞B2。影響潤(rùn)喉糖混合植物配料的總多酚提取量的因素主次為：D 液料比＞A 提取時(shí)間＞C 乙醇濃度＞B提取溫度。為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)超聲波提取多酚的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子的偏向回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸方程的方差分析

回歸方程模型P＜0.0001，極顯著，可預(yù)測(cè)不同提取條件下的多酚得率。失擬項(xiàng)P=0.2231＞0.05，不顯著，說(shuō)明上述總多酚提取的回歸方程可良好契合試驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的誤差較小?；貧w模型下，A、D、AB、A2、B2、C2、D2對(duì)總多酚提取量具極顯著影響（P＜0.01）。C、AC、BC、BD 對(duì)總多酚提取量具有顯著影響（P＜0.05）?；貧w方程總決定系數(shù)R2=0.9162，調(diào)整決定系數(shù)R2(Adj)=0.9056，說(shuō)明方程的擬合狀況良好，該回歸方程可用于分析混合植物配料總多酚提取效果隨著考察因素、水平變化的趨勢(shì)及波動(dòng)情況。

（三）響應(yīng)面分析

如圖5 所示，混合植物配料總多酚微波輔助提取各因素存在交互作用。圖5（A）顯示，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總多酚提取量影響的響應(yīng)面坡度較為平緩，且等高線均呈卵圓形且曲線間距較大；圖5（B）顯示，乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)總多酚提取量影響的響應(yīng)面坡度較為陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明乙醇濃度與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)總多酚提取量具有顯著的影響。圖5（C，D，E，F(xiàn)）顯示，液料比與提取時(shí)間、液料比與提取溫度、液料比與乙醇濃度的響應(yīng)面坡度均陡峭，且等高線呈橢圓形且曲線較為密集，這些結(jié)果說(shuō)明液料比對(duì)總多酚提取量的影響更明顯，這與回歸方程的方差分析的結(jié)果一致。液料比是影響混合植物配料中總多酚提取量的首要因素。

（四）驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析所建立的數(shù)學(xué)模型，由Design-Expert.12 求解回歸方程，得出最優(yōu)的總多酚提取方案為：乙醇濃度52.08%，液料比為33.34，提取溫度61.49 ℃，超聲提取時(shí)間26.60min，總多酚的提取率13.1144mg/g。對(duì)最佳提取工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得潤(rùn)喉糖混合植物配料的多酚提取量為13.0682±0.3461 mg/g，與預(yù)測(cè)值誤差小于1.0%，響應(yīng)面模型與實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果擬合情況良好。

三、結(jié)論與討論

本研究以潤(rùn)喉糖的混合植物配料（甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗）中的總多酚提取量為原料，首先通過(guò)添加纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶（20：5：1）的復(fù)配酶溶液，在50℃下發(fā)酵2h，降解混合植物配料纖維，促進(jìn)多酚類物質(zhì)溶出。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Bohnken 法優(yōu)化超聲波輔助提取多酚的工藝，獲得該工藝的回歸方程，方差分析表明該方程極顯著，可用于分析因素、水平變化對(duì)多酚提取效果的影響?？疾煲蛩氐娘@著性順序?yàn)橐毫媳龋境曁崛r(shí)間＞乙醇濃度＞超聲提取溫度。試驗(yàn)確定的最優(yōu)總多酚提取方案為：乙醇濃度52.08%，液料比為33.34，提取溫度61.49 ℃，超聲提取時(shí)間26.60min。在此工藝參數(shù)下，驗(yàn)證試驗(yàn)表明潤(rùn)喉糖混合植物配料的多酚提取量為13.0682±0.3461mg/g，接近預(yù)測(cè)提取量13.1144 mg/g，與預(yù)測(cè)值誤差小于1.0%。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)結(jié)果較為可靠。響應(yīng)面模型與實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果擬合情況良好，可為優(yōu)化混合植物配料的多酚提取，以及廣東茶葉產(chǎn)業(yè)中的茶梗綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。