朱文婷 鄒 茵 李曉丹 徐賢寅

牙周炎是一種由牙周致病微生物引起的慢性炎癥和病變,其特征是牙周炎癥和進(jìn)行性牙槽骨破壞。通常通過潔治或刮治來消除致病因素，而局部治療使用化學(xué)藥物治療無法在牙周帶深處進(jìn)行潔治或刮治。大多數(shù)化學(xué)治療劑都是化學(xué)合成的抗菌類沖洗劑，含漱劑和凝膠類抗菌劑。長期全身和局部應(yīng)用抗生素會導(dǎo)致機(jī)體細(xì)菌群落失衡，同時產(chǎn)生耐藥性，不能促進(jìn)牙槽骨的再生。

中藥或天然物質(zhì)治療牙周炎是近年來的研究重點之一。隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展，越來越多具有抗炎作用的化合物從中草藥中分離提取出來，這表明具有潛在的藥理學(xué)作用。黃芩苷是黃芩的干燥根莖中提取出來的一種黃酮類化合物，因其具有顯著的生物活性，在臨床上廣泛用于抗炎、抑菌、抗腫瘤和心腦血管疾病的治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)，局部使用黃芩苷可以減少牙周袋的深度，改善牙齦出血，減少牙周炎癥。然而黃芩苷是一種幾乎不溶于水的黃色結(jié)晶，作為藥物生物利用度低。隨著生物材料學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的生物材料作為新型藥物載體應(yīng)用于藥物研究中。納米載體藥物能深入病變部位，并以預(yù)定的速度釋放，從而改善治療效果，減少不良反應(yīng)。因此研究者開發(fā)了一系列藥物載體，如核鞘結(jié)構(gòu)纖維和粒子、多層結(jié)構(gòu)納米纖維膜、粒子包覆纖維或水凝膠等，與傳統(tǒng)藥物比較，可以有效地利用不溶性藥物。本研究采用乳化-蒸發(fā)法制備黃芩苷納米水凝膠，通過考察其藥物特性，并通過構(gòu)建大鼠實驗性牙周炎以研究黃芩苷納米水凝膠對大鼠實驗性牙周炎的保護(hù)作用。

材料與方法

1.實驗材料:Wistar大鼠[SCXK(京)2016-0011]購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；黃芩苷購自上海阿拉丁生物科技有限公司；膽固醇(cholesterol)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；二油酰基卵磷脂(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)購自艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司；殼聚糖溶液(相對分子質(zhì)量=50000)購自青島海普生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α ELISA 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；十六烷基季銨化羧甲基殼聚糖(hqcmc)由本單位實驗室自制；其他化學(xué)試劑均為分析純購自國藥集團(tuán)。本研究使用 savant modulyo 冷凍干燥機(jī)購自美國Varian公司;電子天平購自德國Sartorius公司;納米粒度分析儀(nanozs90 zetasizer)購自英國Malvern公司；掃描電子顯微鏡購自日本HITACHI公司；紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher公司；離心機(jī)5415d購自德國Eppendorf公司;微量移液器購自德國Eppendorf公司;移液槍頭和離心管等實驗耗材均購自美國Axygen公司。

2.黃芩苷載藥納米水凝膠制備：采用乳化-揮發(fā)法制備黃芩苷納米粒。將8mg黃芩苷和20mg 的mPEG-PCL載體溶于1ml 氯仿作為有機(jī)相。將上述有機(jī)相滴入3ml 5%的聚乙烯醇溶液中進(jìn)行超聲乳化(17.5W，30s)，得到的o/w乳狀液進(jìn)一步分散在含有1%聚乙烯醇的8ml溶液中，室溫攪拌2h，得到的液體用慢濾紙過濾除去可能的黃芩苷沉淀。將上述液體按3% 的比例加入甘露醇中，冷凍干燥72h，在4℃陰暗條件下貯存。無載藥空白納米粒的制備方法與上述方法相同，但有機(jī)相中未加入黃芩苷。以殼聚糖衍生物和二烯基磷脂為支架，合成了黃芩苷納米球，并將其均勻分散于水溶液中，制成凝膠。

3.黃芩苷納米水凝膠的研究:采用粒度分析儀測定黃芩苷納米微球凝膠的粒徑和和電位。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察藥物在PBS緩沖溶液中的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測定不同pH值下藥物在一系列作用次數(shù)下的釋放速率。

4.大鼠實驗性牙周炎模型的建立及分組：選取30只SPF級牙體牙列完整、無齲壞及牙周異常的5周齡雄性Wistar大鼠，隨后把動物隨機(jī)分為5組(每組6只)，即正常組、模型組(牙周炎對照組)、對照組(空白納米水凝膠)、陽性對照組(洗必泰)和實驗組(黃芩苷納米水凝膠)。采用0.2mm正畸鋼絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙頸部，結(jié)扎后給予10%的糖水代替飲水，前3天每只大鼠每天喂食20mg氨芐青霉素，以抑制普氏菌和核梭桿菌內(nèi)源性細(xì)菌的有害物質(zhì)。每只大鼠每天注射0.5ml 1.0×10CFU/ml 普氏菌+0.5ml 1.0×10CFU/ml 梭狀芽胞桿菌核酸，連續(xù)給藥3天。模型組大鼠喂飼飼料和水，不加干預(yù)。實驗組給予黃芩苷納米水凝膠，對照組給予空白納米水凝膠，陽性對照組在實驗第1周每2天給予0.5ml 洗必泰，隨后每天1次，連續(xù)3周。

5.觀察其抗炎、抑菌作用:第4周觀察牙齦炎癥和牙周袋深度。采用1967年修訂的Loe與Silness檢測方法檢測牙齦指數(shù):0表示健康牙齦組織，1、2、3分別表示輕度、中度和重度白色牙齦炎癥。用滅菌鑷子將滅菌紙尖插入牙周袋，采集左上頜第二磨牙齦下菌斑，放置約20s后，將紙尖插入含1ml無菌PBS的EP管內(nèi)，涂于相應(yīng)的平板上，計數(shù)作為病原菌的定植試驗。采用添加氨芐青霉素(12g/ml)和5%綿羊血的BHI固體培養(yǎng)基計數(shù)大鼠口腔內(nèi)的梭桿菌核普菌和梭桿菌數(shù)量。

6.牙周組織學(xué)檢查：采用檸檬酸甲酸鈉脫鈣液對大鼠固定牙周組織(包括牙齒)進(jìn)行脫鈣處理2個月。標(biāo)本用石蠟包埋，切成5μm厚的切片進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察大鼠牙周組織切片，觀察牙周組織的破壞情況。

7.酶聯(lián)免疫吸附試驗:在10μg/ml 不含乙二胺四乙酸 (EDTA) 的蛋白酶抑制劑混合物 (Thermo Scientific) 存在下，使用玻璃勻漿器在補(bǔ)充有 0.05%吐溫20(TWEEN-20)的PBS中勻漿牙齦組織。勻漿組織的懸浮液以 1500r/m 離心，收集上清液。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒在收集的上清液中測量IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白的濃度。

結(jié) 果

1.黃芩苷納米球凝膠的粒徑和形態(tài):納米粒度分析儀檢測結(jié)果顯示，黃芩苷納米球凝膠粒徑分布為100～1000nm，平均為577.0nm，分散指數(shù)PDI為0.81(圖1A)，ZETA電位平均值為46.3mV(圖1B)，SEM顯示黃芩苷納米球凝膠為光滑的膠束，大小約為500nm (圖1C)。

2.黃芩苷納米球凝膠在不同pH值溶液中的釋藥速率:根據(jù)黃芩苷在278nm 處的紫外吸收峰，測定了黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定了樣品中游離黃芩苷的含量(圖2A)。根據(jù)黃芩苷的外加質(zhì)量，計算黃芩苷納米球凝膠包埋黃芩苷的含量、包埋率和載藥量詳見表1。藥物在0.03mol/L PBS (pH=7.4)緩沖液中的釋放速率分別為2、4、6、8、10、12、14、24、36、48、60、72、84、96和120h。黃芩苷在6h內(nèi)的釋放率為73.67%，黃芩苷納米球凝膠的釋放率為36.03%(圖2B)。結(jié)果表明，黃芩苷納米球凝膠具有良好的緩釋特性，不會突然釋放。

3.抑菌作用:干預(yù)4周后，所有大鼠模型均出現(xiàn)輕度牙齦炎癥，3組間牙齦指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組牙周袋深度為0.79±0.29mm，對照組為0.75±0.32mm，陽性對照組為0.84±0.22mm，實驗組為0.64±0.17mm。實驗組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=-0.613，<0.05)，而實驗組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)后第2周和第4周大鼠核梭桿菌和普氏菌細(xì)胞計數(shù)發(fā)生變化。干預(yù)4周后，模型組與對照組以及陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組牙周病原菌明顯減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05,表2)。

4.牙周組織觀察：干預(yù)4周后，模型組牙周組織與正常牙周組織比較，牙周骨高度降低，血管擴(kuò)張充血，局部炎性細(xì)胞浸潤。干預(yù)4周后，實驗組和陽性對照組牙槽骨高度降低，牙周組織有輕度炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，實驗組和陽性對照組的炎性反應(yīng)程度較輕而對照組炎性反應(yīng)變化不大(圖3)。

5.黃芩苷納米水凝膠對實驗性牙周炎中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)影響：干預(yù)4周后，模型組牙周組織與正常牙周組織比較，牙周組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α顯著升高。與模型組比較，對照組無明顯變化，陽性對照組和實驗組均顯著降低；與陽性對照組比較，實驗組炎性細(xì)胞因子水平也有顯著降低。

討 論

黃芩苷已經(jīng)被證明具有多種生物學(xué)功能，如抗炎、抗氧化和抗菌的作用，由于其生物學(xué)功能，黃芩苷稱為治療牙周炎提供了一種非常有前景的藥物。為了更好地利用其作用筆者使用了生物聚合物給藥系統(tǒng)，從而提高其生物學(xué)功能。在選擇合適的生物生物聚合物的前提下，筆者考慮了黃芩苷和所用材料之間的協(xié)調(diào)作用。殼聚糖是一種常見的生物材料載體，在口腔疾病治療中發(fā)揮這重要作用。本研究筆者利用乳化-蒸發(fā)法制備黃芩苷納米水凝膠，通過考察其藥物特性，并通過構(gòu)建大鼠實驗性牙周炎以研究黃芩苷納米水凝膠對大鼠實驗性牙周炎的保護(hù)作用。

本研究中首先采用殼聚糖衍生物和二油酰基卵磷脂作為骨架材料制備成包載黃芩苷納米球水凝膠，在解決其水溶性差的基礎(chǔ)上使其能在局部用藥達(dá)到緩釋的效果，以增強(qiáng)療效。改性后的殼聚糖在水介質(zhì)中發(fā)生微相分離形成的具有疏水性內(nèi)核與親水性外殼的兩親性聚合物，可作為疏水藥物的增溶載體,避免因反應(yīng)引入表面活性劑, 同時能保護(hù)藥物不被迅速降解,使得藥物能緩慢釋放,而親水性外殼則有助于長時間保留在血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。因此以殼聚糖衍生物和二油酰基卵磷脂構(gòu)建納米緩釋微球水凝膠，提高了體系對疏水性藥物黃芩苷的包封率，包封率可達(dá)95%以上，載藥率為14.21%±0.25%，同時粒徑較小約577.0nm，表面ZETA電位為+46.3mV，表面光滑，分散均勻，形狀規(guī)則穩(wěn)定。體外釋放實驗顯示，藥物緩釋過程中突釋較小，釋放時間較長，釋放時間可持續(xù)4天，可在一定程度上避免給藥后藥物吸收的不完全。

在動物實驗中，將黃芩苷納米球凝膠作用于大鼠實驗性牙周炎模型第2周、第4周進(jìn)行牙周檢查。首先通過對牙周袋深度測量，實驗組牙周袋深度小于模型組和對照組，與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)，提示黃芩苷納米球凝膠能抑制炎癥對牙周組織的破壞；隨后對牙周組織致病菌核梭桿菌和普氏菌細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷納米微球凝膠能有效的抑制牙周致病菌的發(fā)展。通過組織形態(tài)檢查顯示，黃芩苷水凝膠能顯著改善牙周組織炎癥。研究表明，黃芩苷通過抑制牙齦組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎介質(zhì)的表達(dá)來減輕炎癥，減少牙槽骨破壞，促進(jìn)牙周結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，本研究結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)一致，并優(yōu)于陽性對照組。因此，動物實驗結(jié)果顯示，黃芩苷納米球凝膠生物利用度高，具有緩釋的特性，能用做牙周炎的局部治療藥物。

綜上所述，黃芩苷納米球凝膠具有較高的載藥量和緩釋效果，能夠改善牙齦炎癥、牙周袋深度、微生物及牙周組織病變，這為凝膠治療牙周疾病提供初步的實驗依據(jù)，也證明黃芩苷納米球凝膠具有良好的臨床應(yīng)用前景和價值。