王 娟 茅 松

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指腎功能快速下降的一組臨床綜合征，其與終末期腎臟疾病、心血管疾病、高血壓等密切相關[1]。一項包括154項研究、350萬例的大樣本量Meta分析表明，AKI發(fā)生率高達21.6%，病死率為23.9%。重癥監(jiān)護患者的AKI發(fā)生率高達50%[2]。2013年我國大約有140萬例符合改善全球腎臟病預后組織(kidney disease:improving global outcomes, KDIGO)診斷標準的 AKI 患者在各級醫(yī)院接受治療，他們的消費支出約130億美元，給家庭、社會以及個人均造成了沉重的負擔[3]。因此，早期識別、阻斷、延緩AKI進展具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)觀念認為，AKI與慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是兩個相對獨立的疾病，但隨著研究的深入，有研究證實AKI 是CKD乃至終末期腎病(end stage of renal disease，ESRD)的關鍵性危險因素[4, 5]。腎臟的持續(xù)缺血、缺氧易導致腎臟慢性化的改變[6]。AKI有可能導致永久性的腎臟損害，進而增加發(fā)生慢性腎衰竭的風險。研究表明，與沒有AKI病史患者比較，AKI后CKD風險增加8.8倍，ESRD升高約3.1倍[7]。研究報道提示，即使輕度AKI表現為明顯的完全恢復，追蹤調查3年仍發(fā)現有約1.5%的人群進展為CKD，后續(xù)隨訪發(fā)現，血清肌酐的適度增加與CKD發(fā)生風險增加90%相關聯[8]。缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR) 是導致AKI的最常見原因之一，腎移植術、局部腎切除術、輸尿管阻塞等臨床診治過程中均不同程度的存在[9]。因此，尋找有效可靠的手段阻斷IR-AKI的發(fā)生、發(fā)展對于AKI的早期防治及延緩向CKD進展顯得尤為重要。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPAR-γ)是配體依賴型的轉錄因子，屬于核受體家族。PPAR-γ與配體結合后，與視黃酸類受體(RxR)形成異二聚體，然后與調節(jié)基因啟動子上游的過氧化物酶體增殖物反應元件結合而發(fā)揮轉錄調控作用[10]。它的生理作用包括調節(jié)各種代謝途徑，例如脂質的生物合成和葡萄糖代謝[11]。噻唑烷二酮是一種通過激活PPAR-γ起作用的合成藥物，羅格列酮 (rosiglitazone，RSG) 是其中的經典藥物。業(yè)已證實，PPAR-γ激活對腎臟可能發(fā)揮保護作用，且可延緩CKD 的進展。因此RSG在AKI-CKD的轉化中可能發(fā)揮阻斷作用，筆者進一步研究觀察RSG對急性腎IR模型的時間序列影響，試圖從源頭上觀察其在AKI-CKD中腎臟纖維化、慢性化損傷、腎功能改變上的影響。

材料與方法

1.動物實驗：所有實驗均獲得上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物保護與使用委員會的批準[動物實驗許可證號：SYXK(滬)2011-0128]。96只6～8周齡的雄性C57/B6小鼠,購自南京大學模式動物研究所，隨機分為4組，即對照組(8只)、RSG組(8只)、IR組(40只,1、3、7、14、28天各8只)、IR+RSG組(40只，1、3、7、14、28天各8只)。其中對照組不作任何處理，與RSG組于RSG灌胃后28天取右腎評估；RSG組按10mg/kg隔天給予RSG灌胃至28天，后進行處理取材右側腎臟以備評估；IR組通過夾閉小鼠右側腎蒂1h，建立腎臟IR誘導的AKI模型，分別在第1天(IR1,n=8)、第3天(IR3,n=8)、第7天(IR7,n=8)、第14天(IR14,n=8)、第28天(IR28,n=8)進行處理取材右側腎臟以備評估；IR+RSG組手術前30min按10mg/kg給予RSG灌胃，手術造模同IR組，之后隔天給予RSG，劑量為10mg/kg,分別在第1天(IR+RSG1,n=8)、第3天(IR+RSG3,n=8)、第7天(IR+RSG7,n=8)、第14天(IR+RSG14,n=8)、第28天(IR+RSG28,n=8)處理取材右側腎臟以備評估。缺血再灌注1、3、7、14、28天分別命名為缺血再灌注1、3、7、14、28組。具體手術過程：術前按10ml/kg腹腔注射0.5%戊巴比妥，待麻藥生效，將小鼠背部朝上固定于鼠板，右側背部中部備皮，用眼科剪依次劃開此處組織，用無齒鑷分離出右側腎臟，找到腎蒂，用動脈夾夾閉1h，依次縫合切口。

2.血液和尿液生物學標志物測定：通過直接心臟穿刺收集血液，并在約-80℃下制備冷凍的血清，直至進行批量分析。隨后全自動生化分析儀檢測血清中的尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐。按實驗計劃于當天收取隨機尿液，收集的尿液在約-80℃凍結，直到進行批次分析。用酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法試劑盒(Mouse Albumin ELISA Kit, ab108792, 英國Abcam公司)檢測尿微量白蛋白水平,用ELISA試劑盒(肌酐Cr試劑盒，C011-2-1,南京建成生物工程研究所)肌氨酸轉化酶法檢測血清尿素氮水平。

3.組織學檢查：腎臟組織進行了蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色以觀察腎臟損傷程度，行Masson染色觀察組織纖維化程度。

4.腎臟組織基因表達分析：按實驗計劃處理取材右側腎臟后，速凍于-80℃冰箱。使用Trizol試劑(trizol,15596-018,美國Invitrogen公司)從組織中純化總RNA樣品。使用DNA酶試劑盒(DNaseⅠ,K1622,RNase-free, 美國Thermo Scientific公司)去除總RNA樣品中混合第DNA，使用cDNA反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit,EN0521,美國Thermo Scientific公司)生成cDNA，并使用FastStartTM通用SYBR Green預混液(ROX)(FastStart Universal SYBR Green Master，4913850001，瑞士Roche公司)進行qRT-PCR，檢測腎臟纖維化標志物(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表達水平，使用delta deltaCT方法計算與空白組的相對基因表達。引物設計詳見表1。

表1 引物序列(5′→3′)

5.Western blot法檢測：用冰冷的PBS洗滌腎組織，并用常規(guī)方法在新添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑(PMSF)的冷RIPA緩沖液中裂解。通過SDS-PAGE凝膠測定組織蛋白水平，并用以下抗體印跡：抗β-actin[β-actin (13E5) Rabbit mAb，4970S，美國Cell Signaling Technology公司]、α-SMA(Rabbit anti-alpha smooth muscle actin antibody，bs-10196R，博奧森生物科技有限公司)、collagenⅠ(Rabbit anti-collagen Ⅰ antibody，bs-10423R，博奧森生物科技有限公司)、collagenⅢ(Rabbit anti-collagen Ⅲ antibody，bs-0948R，博奧森生物科技有限公司),使用ImageJ軟件對蛋白質印跡結果進行定量。統(tǒng)計數據由GraphPad Prism 8.0(美國)繪制。

結 果

1.IR誘導了C57 / B6小鼠AKI向CKD的轉化：動脈夾(小型)夾閉小鼠右側腎動脈1h后去除，血BUN和血肌酐在術后第1天升高最為明顯，后逐漸下降，第28天，IR組較對照組仍明顯升高(P<0.05，圖1、圖2)。IR組尿微量白蛋白/尿肌酐術后第1天逐漸增加，在第7天達到峰值，后緩慢下降，在第28天IR組數值仍大于對照組 (P<0.05,圖3)。組織病理學(HE)分析顯示，IR組在第1天即出現腎小管損傷，后呈時間順序性持續(xù)加重(圖4)。Masson染色表明，膠原積累和沉積在第14天明顯增加，后持續(xù)增加(圖4)。RT-PCR分析顯示，collagen Ⅰ于第1天明顯升高，后持續(xù)增高 (P<0.05)，α-SMA與collagenⅢ于第7天明顯升高，后持續(xù)增高 (P<0.05,圖5)。Western blot法檢測顯示，IR組隨時間發(fā)展纖維化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)表達均增多(P<0.05，圖6)。

圖1 IR血尿素氮時間序列變化與對照組比較，*P<0.05

圖2 IR血肌酐時間序列變化與對照組比較，*P<0.05

圖3 IR尿蛋白/肌酐比值時間序列變化與對照組比較，*P<0.05

圖4 IR腎組織病理時間序列改變(×40)

圖5 IR纖維化因子mRNA時間序列改變與對照組比較，*P<0.05

圖6 IR纖維化因子蛋白表達水平時間序列改變與對照組比較，*P<0.05

2.羅格列酮可延緩AKI-CKD轉化：腎功能評估表明，對照組和RSG組腎功能沒有差別；與對應IR分組(1、3、7、14、28天)比較，IR+RSG分組BUN在1、3、7、14天明顯降低(P<0.05，圖7)，血肌酐在7、28天明顯降低(P<0.05，圖8)。尿微量白蛋白/尿肌酐在術后3、14天明顯減少(P<0.05,圖9)。組織病理學(HE)分析顯示，與對照組比較，RSG組無明顯改變；與對應IR(1、3、7、14、28天)分組比較，IR+RSG (1、3、7、14、28天)分組腎小管損傷均減少(圖10)。Masson染色表明，與對照組比較，RSG組無明顯改變；與對應IR分組(1、3、7、14、28天)比較，IR+RSG分組(1、3、7、14、28天)纖維物沉積減少，且隨時間延長，減少程度越來越明顯(圖10)。RT-PCR分析顯示，與對照比較，RSG組未見明顯差異；與IR組28天比較，IR+RSG組28天纖維化因子較IR組表達明顯減少(P<0.05，圖11)。Western blot法檢測顯示，與對照組比較，RSG組未見明顯差異；與IR組28天比較，IR+RSG組28天纖維化因子(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)均顯著減少(P<0.05)，詳見圖12。

圖7 RSG干預對IR血尿素氮的時間序列影響與對照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖8 RSG干預對IR血肌酐的時間序列影響與對照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖9 RSG干預對IR尿蛋白/肌酐比值的時間序列影響與對照組比較，*P<0.05;與同組RSG-比較，#P<0.05

圖10 RSG干預對腎組織病理時間序列改變(×40)

圖11 28天時RSG干預對IR纖維化因子mRNA的影響與對照組和RSG組比較，*P<0.05;與IR組比較，#P<0.05

圖12 28天時RSG干預對IR纖維化因子蛋白表達水平的影響與對照組和RSG組比較，*P<0.05;與IR組比較，#P<0.05

討 論

AKI是一種發(fā)生率高、合并癥多的疾病，持續(xù)進展可能誘導CKD，導致腎功能的持續(xù)惡化，誘發(fā)多系統(tǒng)的功能影響。因此，早期有效阻斷AKI，并延緩其進展具有重要意義。IR是導致AKI的重要原因之一，動脈夾夾閉腎蒂一段時間后去除動脈夾是導致IR腎損傷的經典模型。筆者通過腎蒂夾閉1h后再松開模擬AKI，并試圖分析研究RSG對AKI-CKD轉化的作用。已有研究證實，雙側腎蒂夾閉40min或更長時間的缺血能夠導致10天后小鼠無法存活[12]。雖然雙側IR模型更加貼近AKI慢性化發(fā)展病程，但是雙側模型往往不是特別穩(wěn)定，而單側模型往往損傷小，動物的死亡率低，且同樣也能誘導腎臟慢性化的損傷發(fā)生[13]。本研究為更加有效地模擬IR所致的AKI-CKD的轉化進展，遂行單側夾閉腎蒂1天。筆者以AKI發(fā)生、發(fā)展的時間為線索，分別于1、3、7、14、28天觀察其具體變化，形成AKI進展至CKD的時間序列變化。腎臟功能指標均于術后呈現上升趨勢，后逐漸下降，7天后下降緩慢，但仍顯著大于基礎值(P<0.05)；HE染色所示的腎小管損傷呈現隨時間加重趨勢，Masson染色所示的纖維物沉積呈現進行性加重趨勢，纖維化指標(α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ)改變趨勢在RT-PCR 和Western blot法檢測結果與之前一致。本研究中，IR導致的AKI沒有完全修復損傷，其表現為腎功能持續(xù)惡化以及纖維化損傷持續(xù)加重，最終轉化為CKD。

各種研究表明IR可能誘導AKI向CKD的轉化，但并不是所有的IR所誘導的AKI都可轉化為CKD，準確地說是在一定觀察期內不會發(fā)生轉化，但將觀察期延長至生命終點，一次特定的AKI是否一定導致CKD值得商榷。一項綜述分析表明，在一定觀察期內，輕、中、重度AKI轉化為CKD的概率逐漸上升[5]。大量研究表明，腎臟修復的能力與初始損傷的嚴重程度、頻率和持續(xù)時間呈負相關[14]。當然，醫(yī)療水平、年齡和性別在轉化過程中也發(fā)揮一定作用，但長遠來看，損傷的嚴重程度是最為重要的影響因子。所以，筆者認為，AKI向CKD的轉化是一個綜合損傷累計的效應，當達到一定損傷閾值，累計損傷大于該閾值即可觸發(fā)向CKD的進展。

RSG是一種PPARγ激動劑，臨床上廣泛應用于2型糖尿病，已被證明可通過改善抗炎、抗增殖和抗氧化應激的作用來保護腎臟，且對腎臟晚期腎病合并癥有保護作用[15]。研究發(fā)現，在尿毒癥環(huán)境中，高磷酸鹽誘導的PPARγ失活是CKD血管內側鈣化發(fā)病機制中的重要事件，而PPARγ的激活可減輕CKD鈣化[16]。研究發(fā)現，在單側輸尿管梗阻大鼠模型中，PPARγ激動劑治療可通過降低腎臟中TGF-β、Ⅳ型膠原和纖連蛋白的表達來顯著減輕腎間質纖維化[17]。同時在敗血癥所致的AKI的模型中，研究者發(fā)現缺乏PPARα(與PPARγ同為核受體家族) 的小鼠腎功能更差[18]。在本研究中，RSG預處理后，腎IR導致的腎臟功能損傷明顯改善，纖維化損傷亦明顯減輕，結果提示激活RSG預處理可能有效延緩AKI進展，減輕CKD腎纖維化損傷。

本研究以AKI后1、3、7、14、28天的時間序列為線索，觀察AKI至CKD的動態(tài)演變。筆者發(fā)現1～3天是AKI的急性期，之后腎功能有所恢復，但纖維化損傷持續(xù)加重，腎臟損傷向慢性化發(fā)展，即AKI逐漸轉化為CKD。RSG干預早期即發(fā)揮腎臟保護作用，第28天纖維化分子mRNA和蛋白表達水平較IR組均顯著下降(P均<0.05)，這充分說明RSG早期干預可以有效的延緩IR誘導的AKI-CKD轉化, 并且可以有效減輕腎臟纖維化損傷。

一項研究表明，AKI 不但可以誘發(fā)腎纖維化，并且還會對肺、心臟和肝臟產生有害的影響[19]。這與筆者發(fā)現的結果相吻合，持續(xù)性的AKI損傷刺激導致腎臟慢性化纖維化損傷，最終可能誘發(fā)一些列合并癥。另有研究發(fā)現，RSG雖可降低腎小球濾過率，但長期并不會因此而損傷腎功能[20]。近年來研究表明，RSG的舒張血管的功能并不會直接導致心血管事件的發(fā)生，相反的還會不同程度的減少此類事件的發(fā)生[21]。本研究亦發(fā)現RSG早期持續(xù)干預可有效的改善腎臟損傷，減輕腎臟纖維化慢性損傷，這充分說明早期激活PPAR-γ可能是延緩阻斷AKI-CKD轉化的有效靶點。本研究進行至28天,如果延長研究時間可能更有助于進一步深入分析延緩AKI-CKD轉化后一系列腎臟合并癥的影響，以及對其遠期并發(fā)癥的影響。

綜上所述，RSG可有效延緩AKI向CKD的轉化，保護腎功能，減輕腎臟纖維化損傷。線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥刺激等多種因素可能參與了RSG對腎臟的保護機制，但是其具體機制仍有待于進一步研究。AKI-CKD的轉化，AKI后對其他臟器的影響及PPARγ對AKI及其并發(fā)癥的遠期影響仍需開展進一步研究。