楊 帆 武菲菲 蘇 潔 蔣書云 謝文靜 金 屏

膿毒癥(sepsis)導致的循環(huán)和細胞/代謝功能障礙及隨之引發(fā)的心功能不全，目前仍無有效治療策略[1,2]。膿毒癥引起的病理性損傷主要包括氧化應激、心肌細胞凋亡及線粒體功能異常等[3]。FUNDC1(FUN14domain containing 1)作為受損線粒體清除的核心調(diào)節(jié)受體之一，對心肌損傷具有重要的保護作用[4]。AMPK/FUNDC1信號通路的激活可通過改善線粒體功能障礙，進而緩解高血糖癥導致的心肌損傷，且FUNDC1對于LPS誘導的膿毒癥小鼠心肌組織具有顯著的保護作用[5]。然而，AMPK/FUNDC1信號通路在膿毒癥導致的心肌細胞損傷的病理進程中的作用機制尚未闡明。

姜黃素是姜黃根莖的重要生物活性成分，對心肌梗死等心血管疾病具有顯著的保護作用[6]。Zhang等研究證實，姜黃素可通過激活AMPK并保護線粒體功能，進而緩解高糖引起的心功能損傷[7]。此外，姜黃素對膿毒癥誘導的心功能不全具有明確的保護作用[8]。然而，這種保護作用是否通過保護線粒體功能及是否通過AMPK/FUNDC1信號通路，尚未明確。

本研究擬建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的原代心肌細胞損傷模型，探究姜黃素對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用，及在膿毒癥誘導的心肌細胞損傷中的重要作用，并進一步明確AMPK/FUNDC1信號通路在這種調(diào)節(jié)作用中的關鍵機制。

對象與方法

1.實驗動物：所有涉及動物實驗部分均遵循美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物使用指南，按照3R原則，并由中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學福利與倫理委員會批準(批準號：20200447)。

2.試劑：姜黃素、線粒體自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)及線粒體自噬激動劑SB-203580購自美國Med Chem Express公司；LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；JC-1檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA檢測試劑盒購自美國Cloud-Clone公司；一抗購自美國Cell Signaling公司及英國Abcam公司；二抗購自北京中山金橋公司；DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司。

3.細胞培養(yǎng)：1～3天齡的C57BL/6J乳鼠原代細胞以Pierce原代心肌細胞分離試劑盒分離(美國Thermo Fisher Scientific公司)，并轉移至高糖DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基中[9]。之后，混合細胞懸液并收集非貼壁細胞，將細胞轉移至含青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)與10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中，孵育培養(yǎng)備用。

4.LPS細胞損傷模型建立及分組：①對照(Con)組：NMCMS以高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；②curcumin處理(Cur)組：NMCMS以10nmol/L的Cur處理10h[10]；③LPS組：NMCMS以100ng/ml的LPS處理12h[11]；④Cur保護(LPS-Cur)組：NMCMS以100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑤LPS-scramble siAMPK(LPS-Scr)組：NMCMS用AMPK scramble siRNA處理36h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h；⑥LPS-scramble siAMPK-Cur(LPS-Cur-Scr)組：NMCMS用AMPK scramble siRNA處理36h，再加入100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑦LPS-siAMPK-Cur(LPS-siAMPK-Cur)組：NMCMS用AMPK siRNA處理36h，再加入100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑧LPS-siAMPK組：NMCMS用AMPK siRNA處理36h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h；⑨LPS-Cur-3-MA處理(LPS-Cur-3-MA)組：NMCMS以10nmol/L 3-MA處理60h，隨后加入100ng/ml的LPS處理2h，再加入10mmol/L的Cur共同處理10h；LPS-rapamycin組：NMCMS以100nmol/L 3-MA處理60h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h[12]。

5.細胞活力檢測：將分離培養(yǎng)的NMCMS以5×103個/孔接種于96孔板中，以前述方法分別對細胞進行處理后，避光條件下向每孔中加入10μl CCK-8溶液，并于37℃水浴中孵育90min，結束后在450nm波長以分光光度計測量各孔吸光度(A)值。細胞活力=(處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。

6.線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)：將細胞以不同方式處理后，以陽離子熒光染料JC-1對線粒體膜電位進行檢測。按照操作說明將JC-1工作液加入細胞中并在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育30min，隨后以PBS清洗3次，每次5min。結束后采用日本Olympus熒光顯微鏡對各組細胞進行觀察。數(shù)據(jù)以藥物處理組與對照組各自的熒光強度表示。

7.NMCMS細胞線粒體分離：NMCMS線粒體按照操作說明，以線粒體分離試劑盒(英國Abcam公司)分離。以預冷的PBS緩沖液清洗NMCMS，并以1000×g離心5min，將上清液轉移至新的無菌管中。以12000×g再次離心20min，收集上清液。隨后以添加蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液中清洗，最終以12000×g離心20min收集備用。

8.Western blot法檢測：以上述方式處理NMCMS細胞，用預冷的PBS清洗以去除培養(yǎng)基殘留，使用預冷的中效RIPA裂解緩沖液(美國Santa Cruz公司)處理細胞。于冰上反應15min，隨后12000×g離心25min，隨后加入5×loading buffer，并煮沸7min，進行蛋白定量。將提取的細胞蛋白以SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，以5g/100ml脫脂牛奶在25℃孵育1.5h，加入相應一抗在4℃孵育過夜，清洗后再加入對應二抗緩慢搖晃，反應2h，再次清洗后采用化學發(fā)光系統(tǒng)進行檢測，之后使用Image Lab(美國Bio-Rad公司)進行蛋白定量分析。

9.ATP含量：使用ATP檢測試劑盒，對分離得到的NMCMS細胞線粒體進行定量分析(上海碧云天生物技術有限公司)。將ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成不同濃度梯度，繪制標準曲線。并按照每個樣品100μl配置適當?shù)腁TP檢測工作液，隨后采用分光光度計進行檢測。

結 果

1.細胞模型評價：如圖1A所示，與Con組比較，NMCMS中加入100ng/ml的LPS處理12h可顯著降低心肌細胞活力至50%左右。與Con組比較，以LPS處理NMCMS 12h后可顯著增加LDH活力并降低MMP的含量(圖1中B、C)。同時，ROS生成也顯著增加，且線粒體ATP含量顯著降低(圖1中D、E)。此外，對蛋白的Western blot法檢測結果顯示，p-AMPK及線粒體自噬標志蛋白FUNDC1的表達也顯著降低(圖1中F、G)。

圖1 LPS處理組與對照組細胞活力、損傷標志物及ROS生成等的檢測結果(n=6)A.細胞活力；B.LDH活力；C.MMP；D.ROS水平；E.ATP含量;F、G.Western blot法檢測

2.Cur對NMCMS線粒體膜電位影響：如圖2中A、B所示，相對于Con組，LPS處理可顯著增加ROS活力并降低線粒體ATP含量，而這一改變可被Cur顯著逆轉。此外，定量分析顯示，相對于Con組，LPS可顯著降低JC-1比值，提示Δψm顯著降低并線粒體損傷，而Cur可通過顯著增加JC-1比值，從而改善線粒體損傷(圖2中C、D)。

圖2 Cur處理對LPS誘導的心肌細胞ROS生成、ATP含量及線粒體膜電位的影響(n=6)A.ROS水平；B. ATP含量；C、D.JC-1熒光染色及統(tǒng)計結果與Con組比較, *P<0.05；與LPS組比較, #P<0.05

3.Cur可緩解LPS誘導的NMCMS毒性：如圖3A所示，相對于LPS處理組，培養(yǎng)的NMCMS中加入10nmol/L的Cur后可顯著增加細胞活力，然而隨著Cur濃度進一步增加，細胞活力無顯著改善。對培養(yǎng)細胞離心后的上清液檢測發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，LPS處理可顯著增加LDH活力并顯著降低MMP含量，而Cur處理可顯著減輕LPS誘導的細胞損傷(圖3中B、C)。對不同處理組的細胞蛋白的進一步檢測發(fā)現(xiàn)，Cur處理可顯著緩解LPS對p-AMPK及線粒體自噬標志蛋白表達的抑制作用(圖3中D、E)。

圖3 Cur處理對LPS誘導的心肌細胞活力、LDH、MMP及AMPK與FUNDC1蛋白表達的影響(n=6)A.細胞活力；B.LDH活力；C.MMP；D.p-AMPK及AMPK蛋白表達；E.FUNDC1蛋白表達與Con組比較, *P<0.05；與LPS組比較, #P<0.05

4.siAMPK對Cur及LPS處理的NMCMS線粒體的影響：對Cur及LPS處理的NMCMS中加入siAMPK的結果顯示，Cur可顯著降低LPS損傷引起的ROS水平增加及促進ATP生成，而siAMPK處理則降低了Cur對細胞損傷的保護作用(圖4中A、B)。此外，以JC-1陽離子探針檢測Cur及siAMPK對LPS誘導的NMCMS毒性的影響，定量分析結果顯示，加入scramble RNA后線粒體膜電位無顯著改變。相對于LPS-Cur-Scr組，加入siAMPK后則顯著降低JC-1比值，提示線粒體損傷加劇(圖4中C、D)。

圖4 Cur與siAMPK處理對心肌細胞氧化應激的影響(n=6)A.ROS水平；B.ATP含量；C.JC-1熒光染色；D.線粒體膜電位熒光染色統(tǒng)計結果與LPS-Scr組比較, *P<0.05；與LPS-Cur-Scr組比較, #P<0.05；與LPS-siAMPK-Cur組比較, ΔP<0.05

5.抑制AMPK的表達可降低Cur對LPS誘導的NMCMS的保護作用：如圖5中A、B所示，對于LPS處理的NMCMS，與LPS-Scr組比較，Cur可顯著降低LDH活性并增加MMP含量，而siAMPK可通過逆轉這一趨勢增加LPS誘導的細胞損傷。與LPS組比較，Cur可顯著增加p-AMPK及FUNDC1蛋白的表達，而siAMPK處理后，隨著p-AMPK表達量的降低，F(xiàn)UNDC1蛋白表達量也顯著降低(圖5中C、D)。提示FUNDC1可能作為重要的調(diào)節(jié)因子，參與Cur對LPS誘導的NMCMS的保護作用。

圖5 Cur與siAMPK處理對LPS誘導的心肌細胞LDH、MMP及AMPK與FUNDC1蛋白表達的影響(n=6)A.LDH活力；B.MMP；C.p-AMPK及AMPK蛋白表達；D.FUNDC1蛋白表達與LPS-Scr組比較, *P<0.05；與LPS-Cur-Scr組比較, #P<0.05；與LPS-siAMPK-Cur組比較, ΔP<0.05

6.AMPK/FUNDC1信號通路對Cur抵抗LPS誘導的NMCMS損傷具有重要的調(diào)節(jié)作用：如圖6中A、B所示，對于LPS處理的NMCMS，加入Cur或線粒體自噬激活劑rapamycin均可顯著降低LDH活性并增加MMP含量，而加入線粒體自噬抑制劑3-MA后，這種保護作用被部分抵消。此外，Cur或rapamycin均可顯著降低LPS誘導的NMCMS的ROS生成并促進ATP合成，而3-MA則可顯著增加ROS生成及抑制ATP合成(圖6中C、D)。對不同處理組NMCMS蛋白的進一步檢測發(fā)現(xiàn)，Cur及rapamycin可顯著改善LPS誘導的NMCMS線粒體自噬標志蛋白降解，而3-MA處理則通過降低FUNDC1蛋白表達而部分抵消Cur對細胞線粒體的保護作用，而并未改變p-AMPK的蛋白表達(圖6中E、F)。提示，F(xiàn)UNDC1可能作為AMPK下游分子，參與調(diào)控Cur對LPS誘導的NMCMS的保護作用。

圖6 Cur、3-MA及rapamycin處理對心肌細胞的影響(n=6)A.LDH活力；B.MMP；C.ROS水平；D.ATP含量；E.p-AMPK及AMPK蛋白表達；F.FUNDC1蛋白表達與LPS組比較, *P<0.05； 與LPS-Cur組比較, #P<0.05

討 論

本研究通過離體建立LPS誘導的NMCMS損傷模型并發(fā)現(xiàn)，Cur可通過激活抑制LDH活力及ROS生成并增加MMP與ATP的含量，減輕線粒體損傷，保護NMCMS抵抗LPS誘導的心肌細胞毒性。其作用機制主要是通過激活AMPK/FUNDC1介導的線粒體自噬并降低ROS生成及維持線粒體膜電位實現(xiàn)的。本研究結果提示，Cur及AMPK/FUNDC1介導的線粒體自噬對于保護心肌細胞線粒體功能，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷具有重要作用。

膿毒癥期間的心血管系統(tǒng)及其功能障礙不容忽視[13]。研究表明，線粒體功能障礙，在膿毒癥誘導的器官衰竭的發(fā)病機制中起著關鍵作用[14]。LPS可以誘導選擇性的線粒體自噬過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，LPS處理的NMCMS細胞活力顯著降低，同時細胞損傷增加(LDH活性增加與MMP含量降低)與ROS水平升高及線粒體ATP生成降低。研究表明，F(xiàn)UNDC1依賴的線粒體自噬在通過緩解炎性反應，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷[5,15]。本研究證實，LPS處理的NMCMS與對照組比較，p-AMPK及線粒體自噬標志蛋白FUNDC1顯著激活，與既往研究結果一致[5]。

Cur是從姜黃根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)。姜黃素具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎等功效[16,17]。研究表明，Cur對心肌缺血再灌注損傷具有重要的保護作用，其主要作用機制是通過抑制ROS生成并促進ATP合成，從而減輕線粒體功能損傷，進而緩解缺血再灌注引起的心肌損傷[18]。此外，姜黃素通過調(diào)控自噬和減輕細胞凋亡來預防心肌損傷[19]。本研究證實，相對于LPS誘導的NMCMS，Cur可顯著降低ROS生成并促進ATP合成，并促進AMPK的磷酸化與線粒體自噬標志蛋白FUNDC1的表達，同時通過增加JC-1的比值維持線粒體膜電位穩(wěn)定，緩解LPS誘導的NMCMS損傷。

既往研究表明，AMPK/FUNDC1信號通路的激活可緩解高糖導致的心肌細胞線粒體功能障礙，且FUNDC1在LPS誘導的膿毒癥小鼠心肌組織中也具有調(diào)節(jié)作用[5,20]。本研究通過對NMCMS給予siAMPK證實，Cur對LPS誘導的NMCMS損傷的保護作用可被AMPK的抑制而抵消，提示AMPK/FUNDC1信號通路可能是Cur抵抗LPS誘導的心肌細胞損傷的關鍵調(diào)控因子。進一步的體外研究表明，NMCMS以線粒體自噬抑制劑3-MA處理后，Cur對心肌細胞的保護作用被部分抵消，而AMPK的磷酸化未見顯著改變，提示FUNDC1可能作為AMPK的下游關鍵分子，參與調(diào)控Cur對LPS誘導的心肌細胞損傷的保護作用。

綜上所述，本研究證實，Cur可顯著緩解LPS誘導的心肌細胞損傷。其潛在的保護機制是通過激活AMPK/FUNDC1信號通路，抑制ROS生成與促進ATP合成，減輕心肌細胞線粒體損傷。而抑制AMPK的磷酸化或降低FUNDC1的蛋白表達，可加劇LPS誘導的心肌細胞損傷。因此，激活AMPK/FUNDC1介導的線粒體自噬是Cur緩解LPS誘導的心肌細胞毒性的潛在治療策略。