王曉婉 代 會 趙騰飛 劉玉旗 費愛華

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào),進而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，臨床上40%～50%的膿毒癥患者存在心肌損傷[1,2]。膿毒癥合并心肌損傷患者的病死率可高達70%～90%[3]。膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機制涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體損傷等，且多種因素間常互為因果，共同影響疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。研究表明，膿毒癥時細胞內(nèi)過度激活的活性氧(reactive oxygen species, ROS)和大量的炎性細胞因子介導(dǎo)線粒體損傷，后者進一步造成ROS產(chǎn)生和堆積，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致膿毒癥心肌損傷[5，6]。

地奧司明是一種黃酮類化合物，臨床上常用于治療慢性靜脈功能不全、靜脈潰瘍。近年來研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明在心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和其他心血管疾病中發(fā)揮保護性作用，并表現(xiàn)出抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[7～10]。然而地奧司明在膿毒癥心肌損傷中的作用和機制鮮有報道。本實驗擬通過腹腔注射LPS建立膿毒癥模型，觀察地奧司明對膿毒癥心肌損傷的影響并探討其潛在機制。

材料與方法

1. 材料：地奧司明(貨號：PHR2799)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,貨號：L2630)購自美國Sigma公司；一抗：線料體動力相關(guān)蛋白/(dynamin-related protein1,DRP1,貨號：12957-1-AP)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2,貨號：12186-1-AP)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM,貨號：22586-1-AP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gluceraldehyole-3-p hosphate dehydrogenase,GAPDH,貨號：10494-1-AP)和超氯化物歧化酶2(superoxide dismutase2,SOD2,貨號：10269-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ATP含量測定試劑盒(貨號：A095-1-1)購自南京建成生物有限公司；TNF-α(貨號：JL13202)、IL-1β(貨號：JL20884)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;DHE染色試劑盒(貨號：S0063)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.實驗動物和膿毒癥模型構(gòu)建：60只雄性SD大鼠(220～250g)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實驗動物中心提供，采用隨機數(shù)字表法將60只SD大鼠分為對照組、模型組、地奧司明組，每組20只。地奧司明組大鼠連續(xù)7天給予30mg/(kg·d)地奧司明灌胃，對照組和模型組連續(xù)7天給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。第7天灌胃后1h，模型組和地奧司明組大鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)以構(gòu)建膿毒癥模型。12h后處死3組大鼠，收集大鼠血液和心臟組織。

3.HE染色：取大鼠心臟，將心臟充分浸于4%多聚甲醛溶液中固定24h，隨后浸蠟和包埋，制成4μm石蠟切片。對切片進行二甲苯透明，梯度乙醇脫水，蘇木精染色，鹽酸分化，伊紅染色，乙醇脫水透明和樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

4.ELISA法檢測TNF-α、IL-1β：收集大鼠血液，3000×g離心10min獲得上層血清。根據(jù)ELISA試劑盒說明書上的步驟依次檢測血清TNF-α、IL-1β的含量。

5.石蠟切片免疫組織化學(xué)染色：在心肌組織石蠟切片的基礎(chǔ)上，對切片進行二甲苯脫蠟、檸檬酸抗原修復(fù)、血清封閉、一抗SOD2孵育，二抗孵育及顯色后，光學(xué)顯微鏡下觀察。

6.線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：取1mm×1mm×1mm 體積的左心室前壁心肌組織，浸于2.5%戊二醛溶液中固定，再經(jīng)1%鋨酸溶液固定、脫水包埋和切片(2μm)后，于透射電子顯微鏡下觀察。

7.ATP檢測：取新鮮的大鼠左心室組織，稱重后加入雙蒸水制成勻漿液, 100℃加熱15min，冷卻離心(3500×g，10min)后在96孔板中加入上清液，隨后用酶標(biāo)儀在636nm處測定吸光度(A)值，根據(jù)吸光度和樣本濃度計算組織中ATP的濃度。

8.Western blot法檢測左心室SOD2、DRP1、MFN2、TFAM蛋白的相對表達量：提取大鼠左心室組織總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用一抗SOD2、DRP1、MFN2、TFAM和GAPDH在4℃孵育12h，隨后常溫孵育二抗2h，使用Amersham Imager 600采集圖像。

9.DHE染色：冷凍切片機將大鼠心臟制成約5μm的組織冷凍切片，加入DHE染色液，37℃孵育20min，在熒光顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清炎性細胞因子水平的比較：LPS刺激可明顯增加大鼠血清TNF-α,IL-1β水平(P<0.01)。地奧司明預(yù)處理使膿毒癥大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.01)，詳見表1。

表1 血清TNF-α、IL-1β和心肌組織ATP的含量

2.各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果：對照組大鼠心肌纖維排列緊密且規(guī)則，細胞形態(tài)正常且結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、甚至中斷，心肌細胞水腫；地奧司明組大鼠心肌纖維排列稍紊亂，細胞水腫較模型組減輕，詳見圖1。

圖1 心肌組織HE染色結(jié)果(×400)A.對照組；B.模型組；C.地奧司明組

3.各組大鼠心肌氧化應(yīng)激結(jié)果：DHE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠心肌細胞表達微弱的紅色熒光，模型組可見明顯的紅色熒光，地奧司明組紅色熒光強度較模型組降低，詳見圖2。免疫組化和Western blot法結(jié)果表明，模型組大鼠心肌組織中SOD2蛋白水平較對照組明顯降低(P<0.05)，地奧司明預(yù)處理使膿毒癥大鼠心肌組織中SOD2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 心肌組織DHE染色結(jié)果(×400)A.對照組；B.模型組；C.地奧司明組

圖3 心肌組織SOD2蛋白表達A.心肌組織SOD2免疫組化結(jié)果(×400);B.SOD2免疫組化結(jié)果相對表達量;C.心肌組織SOD2的Western blot法條帶圖;D.SOD2 Western blot法結(jié)果相對表達量。與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

4.各組大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能：透射電鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體嵴清晰、完整；模型組線粒體腫脹，部分線粒體膜破裂，線粒體嵴溶解斷裂；而地奧司明組線粒體輕微腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)較清晰，排列較齊，詳見圖4。模型組大鼠心肌組織ATP含量較對照組明顯降低(P<0.05)，地奧司明預(yù)處理使膿毒癥大鼠心肌組織ATP含量明顯升高(P<0.05)，詳見表1。Western blot 法檢測結(jié)果表明，模型組大鼠心肌組織DRP1表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，MFN2、TFAM表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)，地奧司明預(yù)處理使膿毒癥大鼠心肌組織DRP1表達水平明顯降低(P<0.05)，MFN2、TFAM表達水平明顯升高(P<0.05)，詳見圖5。

圖4 心肌細胞線粒體透射電鏡圖(×7000)A.組照組；B.模型組；C.地奧司明組

圖5 心肌組織DRP1、MFN2和TFAM蛋白表達與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

多項研究表明，炎癥瀑布反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞能量代謝障礙、線粒體功能損傷等會造成心肌細胞損傷[11]。因此，以改善心肌損傷為靶向可成為膿毒癥的一種潛在有效的治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預(yù)處理降低LPS刺激引起的大鼠血清炎性細胞因子水平升高，改善心肌組織結(jié)構(gòu)損傷，降低ROS含量，改善線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，改善線粒體功能障礙和線粒體動力學(xué)失衡。本研究結(jié)果表明，地奧司明在膿毒癥心肌損傷中具有保護性作用。

LPS刺激激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路，釋放大量下游的TNF-α和IL-1β等炎性細胞因子。筆者研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TNF-α和IL-1β明顯升高。地奧司明干預(yù)明顯降低血清TNF-α和IL-1β含量，表明地奧司明減輕膿毒癥大鼠的炎性反應(yīng)。

膿毒癥時心肌細胞大量的活性氧和超氧陰離子，通過氧化線粒體膜蛋白和脂質(zhì),損傷心肌線粒體膜的完整性，誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生更多的活性氧類(即活性氧誘導(dǎo)的活性氧釋放現(xiàn)象)進一步加重線粒體損傷[12]。SOD2是抗氧化酶類的重要成員，能有效清除線粒體ROS，是線粒體清除過度氧自由基的第一道防線，TFAM調(diào)控著線粒體氧化磷酸化復(fù)合物的表達，與線粒體氧化代謝功能密切相關(guān)，對線粒體起保護作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明組ROS含量比模型組明顯降低，且SOD2和TFAM表達水平比模型組明顯升高，表明地奧司明能降低膿毒癥心肌損傷時線粒體氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮保護作用。

線粒體是心肌細胞能量代謝的中心。在膿毒癥患者及動物模型中, 心肌細胞均顯示線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞，電鏡下可以觀察到膿毒癥大鼠靜脈注射LPS后6h可出現(xiàn)部分心肌細胞線粒體腫脹、線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失、肌絲溶解;24h多數(shù)線粒體會出現(xiàn)空泡樣變性, 心肌纖維出現(xiàn)斷裂[14,15]。膿毒癥不但導(dǎo)致心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，并且導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，是膿毒癥心肌損傷的重要發(fā)病基礎(chǔ)[16]。線粒體是不斷進行分裂融合的細胞器，其分裂融合動態(tài)不僅決定著線粒體的形態(tài)、體積、分布和功能，也參與線粒體的損傷修復(fù)[17]。DRP1介導(dǎo)線粒體分裂，MFN2介導(dǎo)線粒體外膜融合，抑制DRP1表達可減輕線粒體病理分裂，改善線粒體功能障礙和細胞能量供應(yīng)，改善膿毒癥小鼠的心功能、提高其生存率，而促進線粒體分裂抑制線粒體融合則會導(dǎo)致預(yù)后不良[18～20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS處理的膿毒癥大鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂，心肌細胞的線粒體膜破裂，線粒體嵴溶解斷裂，組織ATP含量也明顯降低，提示LPS導(dǎo)致線粒體形態(tài)和功能發(fā)生異常，而地奧司明治療能逆轉(zhuǎn)LPS造成的線粒體形態(tài)和功能發(fā)生異常。此外，筆者研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠線粒體分裂融合相關(guān)蛋白DRP1、MFN2表達異常。地奧司明干預(yù)后，筆者研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明能逆轉(zhuǎn)LPS造成的DRP1和MFN2表達異常，地奧司明通過促進MFN2的表達和抑制DRP1的表達來維持線粒體的分裂融合動態(tài)平衡。

本實驗用地奧司明干預(yù)膿毒癥大鼠，觀察各組大鼠血清炎性細胞因子水平，心臟組織結(jié)構(gòu)、心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、ATP含量、DRP1、MFN2和TFAM蛋白的表達以及檢測線粒體ROS含量和SOD2表達，來探討地奧司明在膿毒癥心肌損傷治療中的作用機制。實驗結(jié)果表明，地奧司明能夠減輕膿毒癥大鼠血清炎性細胞因子水平，改善心臟結(jié)構(gòu)損傷，改善心肌細胞線粒體形態(tài)上的病變和功能上的障礙，維持線粒體的分裂融合動態(tài)平衡，降低膿毒癥心肌損傷時線粒體氧化應(yīng)激水平。綜上所述，地奧司明具有減少炎性細胞因子的產(chǎn)生，減少活性氧的產(chǎn)生，保護線粒體形態(tài)和功能，緩解膿毒癥心肌損傷的作用，其詳細機制有待于進一步探討。