馬慧可 李 萍 陳 佳 劉 欣 姚文濤 林 燕 何秀娟

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer, DFU)創(chuàng)面遷延難愈，致殘率、致死率高，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[1, 2]。糖尿病足潰瘍分為3型，即神經(jīng)型、缺血型和神經(jīng)-缺血型。隨著糖尿病的發(fā)展，最終導(dǎo)致全身微循環(huán)障礙而致使并發(fā)癥發(fā)生，包括糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病腎病、糖尿病性心血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病足等[3]。25%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生糖尿病足潰瘍，而糖尿病足潰瘍會(huì)顯著增加截肢風(fēng)險(xiǎn)和病死率，其中神經(jīng)型患者的5年病死率高于霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌，神經(jīng)-缺血型患者的5年病死率高于大腸癌[4]。2007～2017年全國(guó)范圍內(nèi)1型糖尿病的發(fā)生率雖然仍處于較低水平，但呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。2021年，我國(guó)1型糖尿病新發(fā)人數(shù)中0～19歲為0.61萬(wàn)人。然而，1型糖尿病在中國(guó)的認(rèn)知度和關(guān)注度仍然較低，其發(fā)生率被低估，相關(guān)研究較少，因此探索1型糖尿病及其并發(fā)癥具有重要意義[5, 6]。

中性粒細(xì)胞是血液循環(huán)中首先遷移到炎癥部位的免疫細(xì)胞，通過(guò)吞噬、脫顆粒作用，在細(xì)胞因子的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)的釋放、病原體的捕獲和消除等固有免疫方面、適應(yīng)性免疫方面以及防御功能方面發(fā)揮著重要的作用[7]。中性粒細(xì)胞被激活后，可形成鑲嵌著組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、組織蛋白酶G等殺菌蛋白的DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)NETs。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面有大量NETs存在，而過(guò)多或持續(xù)存在的NETs可導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面愈合遲緩[8, 9]。糖尿病患者的血清中瓜氨酸化組蛋白H3(citrulline histone 3, Cit-H3)、游離的雙鏈DNA和NE的表達(dá)均顯著升高[8]。

佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)是體外刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的經(jīng)典誘導(dǎo)劑，其通過(guò)作用于蛋白激酶 C(PKC)，激活 Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路及煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX2)，進(jìn)而誘導(dǎo) ROS 的產(chǎn)生，之后核心組蛋白H3/H4在肽?；彼崦搧啺访?(peptidyl arginine deiminase 4, PAD4)的作用下發(fā)生瓜氨酸化，形成Cit-H3促使中性粒細(xì)胞核內(nèi)染色體的解聚，隨后胞核形態(tài)改變，核膜破裂生成NETs，并釋放NE和MPO，這個(gè)過(guò)程被稱為NETosis[10,11]。其中，Cit-H3是NETs最特異性的循環(huán)標(biāo)志物[12]。

中性粒細(xì)胞是在骨髓中由造血干細(xì)胞分化而來(lái)的。雖然PMA誘導(dǎo)NETosis的機(jī)制已經(jīng)比較清晰，但糖尿病動(dòng)物模型中骨髓來(lái)源的中性粒細(xì)胞進(jìn)行NETosis體外誘導(dǎo)的研究報(bào)道較少。因此本研究采用鏈脲佐菌素 (streptozocin，STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠，通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察不同濃度的PMA誘導(dǎo)糖尿病小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞NETs形成的影響，并分析NETs結(jié)構(gòu)及組分，建立1型糖尿病小鼠體外NETs模型和檢測(cè)方法，為研究糖尿病足潰瘍NETs產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞分離試劑盒(貨號(hào)：TBD2013NM)購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司。高糖DMEM(5.5mmol/L,貨號(hào)：11965092)、胎牛血清(貨號(hào)：10100154)和核酸染料Sytox Green(貨號(hào)：2204228)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。PMA(貨號(hào)：SLBX8889)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ROS探針DCFH-DA(貨號(hào)：S0033S)和Alex Fluor?488(貨號(hào)：A0423)標(biāo)記山羊抗兔抗體購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗鼠瓜氨酸化組蛋白H3(貨號(hào)：ab5103)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；血糖儀及試紙(貨號(hào)：479771)購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；鏈脲佐菌素(貨號(hào)：S8050)、8mm細(xì)胞爬片(貨號(hào)：YA0353)購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；激光共聚焦(型號(hào)：蔡司LSM780)購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司；掃描電子顯微鏡(型號(hào)：S-3400)購(gòu)自日本Hitachi日立公司。SPF級(jí)6～8周健康雄性 C57BL/6J小鼠20只，由斯貝福北京生物技術(shù)有限公司提供，體質(zhì)量為22g左右; 室溫22℃、濕度50%～60%、12h明暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。

2.1型糖尿病小鼠模型制備：20只小鼠造模前禁食12h，避光環(huán)境中，腹腔注射由檸檬酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH4.5) 配置的 0.1% STZ(40mg/kg)，注射2h后進(jìn)食，連續(xù)注射5天；注射結(jié)束1周后，隔天尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖，血糖值>16.6mmol/L，則糖尿病小鼠模型造模成功[13]。

3.糖尿病小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞的分離：在無(wú)菌條件下，體外剝離糖尿病小鼠股骨和脛骨，勻漿沖洗液沖洗內(nèi)腔中的骨髓，70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，450×g，離心10min，棄上清；紅細(xì)胞沉降液重懸細(xì)胞；于離心管中依次加入3ml的中性粒細(xì)胞分離液與1.5ml的80%濃度中性粒細(xì)胞分離液；吸取1ml細(xì)胞懸液樣本加于80%濃度中性粒細(xì)胞分離液液面上，750×g，離心30min。吸取下層白色環(huán)狀中性粒細(xì)胞層，清洗，400×g，離心10min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液；細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)備用。

4.PMA體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs形成：用DMEM完全培養(yǎng)基重懸中性粒細(xì)胞，接種于激光共聚焦小皿中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，分別加入PMA(0、100、200、400nmol/L)，培養(yǎng)2.5h后加入Sytox Green染料(0.4μmol/L)，激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察3～7h。

5.熒光免疫組化法檢測(cè)Cit-H3：中性粒細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入4%多聚甲醛，室溫固定20min；PBS洗；用含0.5% Triton X-100的PBS透化1min；PBS洗；滴加5% FBS的封閉緩沖液，37℃孵育1min；加入兔源抗-H3Cit抗體(1∶250)，4℃孵育過(guò)夜；PBS洗；加入羊抗兔Alex Fluor?488(1∶600)，37℃孵育1h；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

6.細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)：熒光分光光度計(jì)法：中性粒細(xì)胞接種于6孔板(2×106/ml)，5%CO2、37℃培養(yǎng)1h；加入PMA(100nmol/L)培養(yǎng)6h；800r/min，離心5min，棄上清；陽(yáng)性對(duì)照組加入1ml ROSUP(50mg/ml)培養(yǎng)30min，800r/min，離心5min，棄上清；細(xì)胞收集后，重懸于1ml的DCFH-DA探針(1∶1000)中培養(yǎng)20min；洗滌，重懸細(xì)胞并接種于96孔板中，采用分光光度計(jì)法使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)485nm/530nm熒光值。熒光免疫組化法：中性粒細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入DCFH-DA探針(1∶1000)，孵育30min； 4%多聚甲醛固定；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

7.掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察NETs形成：將加入PMA的小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞(2×106/ml)接種于TC處理的細(xì)胞爬片上，5%CO2、37℃培養(yǎng)6h，4.0%戊二醛固定。吸除培養(yǎng)液，PBS洗，2.5%戊二醛(pH 7.2～7.4) 4℃固定，PBS洗， 1%鋨酸固定1h， PBS 洗，梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、80%、90%、100%，5分鐘/次)，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴鍍，掃描電子顯微鏡下觀察。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有結(jié)果均來(lái)自于3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 6.0軟件作圖，結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.中性粒細(xì)胞的分離純度鑒定：中性粒細(xì)胞分離后涂布于載玻片上，待干片后進(jìn)行快速吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并拍照。光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)馬蹄形或分葉狀的細(xì)胞核，核的顏色為藍(lán)紫色，可見(jiàn)淡紫色的中性粒細(xì)胞質(zhì)，計(jì)數(shù)不同視野中中性粒細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析其純度達(dá)到85%以上(圖1)。

圖1 小鼠骨髓來(lái)源的中性粒細(xì)胞快速吉姆薩染色(×40)

2.PMA誘導(dǎo)糖尿病小鼠中性粒細(xì)胞形成DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)NETs形成：PMA處理后(100、200、400nmol/L)5h時(shí)可見(jiàn)綠色絲狀或團(tuán)狀結(jié)構(gòu)；6h時(shí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯增多；刺激7h時(shí)，各組熒光開(kāi)始減弱。與0nmol/L PMA比較，100nmol/L PMA刺激中性粒細(xì)胞6h時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)生成顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。

圖2 PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外DNA含量變化A.動(dòng)態(tài)觀察(熒光免疫組化法染色，×400)；B.Sytox Green 染色后用ImageJ軟件定量分析6h時(shí)NETs*P<0.05，**P<0.01，n=3

3.PMA增強(qiáng)NETs結(jié)構(gòu)組分Cit-H3水平：與200nmol/L、400nmol/L PMA比較，100nmol/L PMA刺激中性粒細(xì)胞6h時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)生成顯著增多，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用100nmol/L作為PMA誘導(dǎo)NETs的適宜濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。100nmol/L PMA綠色熒光明顯增多(圖3A)，提示PMA刺激中性粒細(xì)胞，顯著上調(diào)了Cit-H3表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3B)。

圖3 PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞6h時(shí)Cit-H3(綠色)表達(dá)A.免疫熒光法：Cit-H3為綠色，胞核為藍(lán)色(熒光免疫組化法染色，×400)；B.ImageJ軟件定量分析Cit-H3(n=3)

4.PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活性氧(ROS)升高：100nmol/L PMA糖尿病小鼠骨髓中性粒細(xì)胞ROS生成顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞6h時(shí)ROS生成A.免疫熒光法：ROS為綠色，胞核為藍(lán)色(熒光免疫組化法染色，×630)；B.ImageJ軟件定量分析ROS；C.熒光分光光度計(jì)法(n=3)

5.掃描電鏡觀察PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞出現(xiàn)NETs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：0nmol/L PMA中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出完整的正常細(xì)胞形態(tài)，無(wú)明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；而PMA處理組中性粒細(xì)胞變得扁平，形成膜突起或包膜破裂，從而形成粗細(xì)不一的纖維束狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 各組掃描電鏡下NETs結(jié)構(gòu)(×4000)A.0nmol/L PMA;B.100nmol/L PMA

討 論

周圍神經(jīng)病變、周圍動(dòng)脈疾病、足部畸形、創(chuàng)傷與感染等是導(dǎo)致糖尿病足潰瘍的關(guān)鍵因素[14]。糖尿病足潰瘍的傳統(tǒng)治療方法如清創(chuàng)、抗感染與血運(yùn)重建臨床效果有限，而臨床上新型治療方法如物理療法(激光、局部負(fù)壓吸引、高壓氧療、藥物離子導(dǎo)入等)、生物治療(富集血小板和血小板衍生的生長(zhǎng)因子療法)、新型敷料(高分子合成敷料和人造生物敷料)、人皮膚移植、組織工程皮膚、干細(xì)胞療法等取得了一定的臨床療效，但存在纖維化、不穩(wěn)定性、免疫排斥、感染性、致癌性等安全性問(wèn)題，整體費(fèi)用高，易復(fù)發(fā)，給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與精神壓力[15]。研究發(fā)現(xiàn)，DPI(NOX2的強(qiáng)效抑制劑)、PAD4 抑制劑、脫氧核糖核酸酶Ⅰ (deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ)等NETs抑制劑處理可以有效阻止糖尿病患者和小鼠的中性粒細(xì)胞生成NETs[16, 17]。敲除PAD4的糖尿病小鼠創(chuàng)面NETs生成減少，創(chuàng)面愈合加快[8,18]。此外，硫化氫可通過(guò)抑制ROS介導(dǎo)的MAPK/ERK1/2和p38的激活來(lái)抑制NETosis形成，從而促進(jìn)糖尿病傷口愈合[19]。提示抑制NETs生成可以顯著改善糖尿病患者或糖尿病小鼠的創(chuàng)面愈合，為以NETs為靶點(diǎn)的糖尿病足潰瘍治療提供新的思路[11]。而糖尿病動(dòng)物模型中性粒細(xì)胞的NETosis誘導(dǎo)可提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

目前常用的糖尿病小鼠模型有STZ誘導(dǎo)的1型、2型糖尿病小鼠(大鼠)或db/db小鼠。STZ對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生糖尿病。1型糖尿病與2型糖尿病動(dòng)物模型的制備與STZ注射的劑量有關(guān)系，大劑量注射時(shí)，由于直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型。因此，STZ可建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定可靠同時(shí)病理表現(xiàn)與人類糖尿病類似的動(dòng)物模型[20,21]。db/db小鼠是4號(hào)染色體的瘦素(leptin)受體基因缺陷導(dǎo)致的糖尿病小鼠。由于db/db小鼠不存在人為誘導(dǎo)因素的干擾，糖尿病的產(chǎn)生與臨床患者更為相似，目前被認(rèn)為是較理想的2型糖尿病研究用動(dòng)物模型，但是價(jià)格昂貴[22,23]。STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和db/db小鼠創(chuàng)面Cit-H3表達(dá)升高，創(chuàng)面愈合延遲[8]。db/db小鼠創(chuàng)面造模后第15天，PAD4、NE、Cit-H3、MPO表達(dá)和游離DNA含量顯著升高[19]。糖尿病小鼠很好地體現(xiàn)了糖尿病患者在NETosis易感性方面的病理特征，可用于NETs相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。然而，糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)NETs誘導(dǎo)研究較普遍，但混雜因素眾多，并不能明確NETs及其各組分的升高受某種具體因素(血糖、感染、細(xì)胞間相互作用等)的影響。因此，體外NETs的誘導(dǎo)研究尤為重要，本研究選用STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠骨髓來(lái)源的中性粒細(xì)胞來(lái)建立體外NETs模型。

分離純化中性粒細(xì)胞最常見(jiàn)的方法有免疫磁珠法和密度梯度離心法。免疫磁珠法分離細(xì)胞純度高，操作簡(jiǎn)便、高效，國(guó)外應(yīng)用較廣泛且深受肯定，雖然價(jià)格昂貴，可作為常規(guī)分離純化中性粒細(xì)胞的首選方法。用于NETs研究所分離的中性粒細(xì)胞要選用非活化磁珠分選試劑，以免操作過(guò)程中中性粒細(xì)胞被活化生成NETs。因此，本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法分離純化中性粒細(xì)胞，該方法操作簡(jiǎn)便，成本低，細(xì)胞分離時(shí)間短，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性和刺激性，吉姆薩(Giemsa)染色后顯微鏡下觀察分析中性粒細(xì)胞純度可達(dá)90%。

刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs 的刺激因素包括多種病原體，如PMA、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和鈣離子載體(A23187)等[24, 25]。對(duì)于STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和db/db小鼠的外周血中性粒細(xì)胞，LPS(25g/ml)刺激2.5h，Cit-H3表達(dá)、PAD4活性和NETs含量升高[8]。對(duì)于STZ誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒細(xì)胞，PMA(100nmol/L)刺激3～5h時(shí)NETs形成[26]。與PMA和鈣離子載體A23187比較，LPS是一種更具生物學(xué)相關(guān)性的NETosis刺激物，但其誘導(dǎo)能力不穩(wěn)定，需高濃度才具有良好誘導(dǎo)能力[25]。NETs的體外誘導(dǎo)物如LPS或IL-8等細(xì)胞因子存在價(jià)格昂貴、獲取不易、誘導(dǎo)濃度高、時(shí)間長(zhǎng)、效果不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，本研究選用NETs的經(jīng)典誘導(dǎo)劑PMA，成功在較高誘導(dǎo)濃度(100nmol/L)與較長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間(6h)下刺激1型糖尿病小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞產(chǎn)生顯著性NETs。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMA誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞NETs形成，100nmol/L PMA 6h時(shí)，NETs顯著增多，并顯著促進(jìn)了Cit-H3表達(dá)與ROS釋放。既往報(bào)道PMA(100nmol/L)刺激STZ誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒細(xì)胞3～5h時(shí)NETs形成，筆者使用PMA的刺激濃度和時(shí)間基本一致。顯微鏡下NETs結(jié)構(gòu)與成分組成鑒定是評(píng)估NETs的重要標(biāo)準(zhǔn)，NETs具有獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)，其主要成分是直徑為15～17nm的DNA纖維和直徑為25～50nm的球形蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的可達(dá)50nm的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[27]。本實(shí)驗(yàn)在激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡下均可見(jiàn)PMA刺激后形成NETs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

綜上所述，調(diào)控NETs生成是治療糖尿病足潰瘍的重要研究靶點(diǎn)，本研究建立了PMA誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠體外NETs模型，該模型中NETs的體外誘導(dǎo)與Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的相關(guān)性需進(jìn)一步驗(yàn)證。在糖尿病足潰瘍復(fù)雜病理?xiàng)l件下，中醫(yī)藥在糖尿病足潰瘍中NETs產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機(jī)制的探索是筆者課題組后期體外研究的主要方向，這將為實(shí)現(xiàn)對(duì)NETs形成精細(xì)調(diào)控與新的治療策略提供理論依據(jù)。