張芳菲 王奕雪 王 莉 劉 麗 劉東偉 王 鋒 汪年松 劉章鎖 梁如練

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是終末期腎衰竭的主要原因。調(diào)查顯示，我國(guó)2018年糖尿病的發(fā)生率高達(dá)12.4%，其中約40%的2型糖尿病和30%的1型糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展成慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)。microRNA(miRNA)是高度保守的非編碼短RNA，主要通過(guò)與靶基因mRNA 3′UTR結(jié)合而降解靶mRNA或抑制翻譯參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在調(diào)節(jié)腎組織細(xì)胞損傷、壞死與間質(zhì)纖維化等方面發(fā)揮著重要功能。miR-214是一種進(jìn)化保守的miRNA，參與了急性腎損傷、CKD和DKD等多種腎臟疾病的病理生理過(guò)程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽誘導(dǎo)的Dahl鹽敏感大鼠中，miR-214表達(dá)顯著增加，抑制miR-214明顯改善了高鹽誘導(dǎo)的蛋白尿和高血壓。進(jìn)一步研究表明，miR-214通過(guò)調(diào)控腎臟中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)參與鹽敏感性高血壓的發(fā)病機(jī)制。但是miR-214/eNOS軸在DKD進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬利用miR-214反義核苷酸(anti-miR-214)抑制miR-214表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME)抑制eNOS活性，探討miR-214/eNOS軸在糖尿病大鼠腎損傷的發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

1.材料與試劑：鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，anti-miR-214和陰性對(duì)照Scrambled anti-miR(美國(guó)Exiqon公司)，L-NAME(美國(guó)Cayman Chemical公司)；尿白蛋白檢測(cè)試劑盒(英國(guó)Abcam公司)， eNOS ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)，TaqMan檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)，2×SYBR Green Color qPCR Mix試劑盒(上海怡澤生物科技有限公司)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和程序均經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：DWLL2022-0521)。選取6～7周雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250±20g，SPF級(jí)，購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施許可證號(hào)：SYXK(滬)2021-0028。對(duì)SD大鼠行腹腔注射單劑量65mg/kg STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5)，注射3天后測(cè)空腹血糖，>16.7mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功。

3.實(shí)驗(yàn)分組：(1)探討miR-214在糖尿病大鼠腎組織中的動(dòng)態(tài)變化：利用6～7周雄性SD大鼠36只，分為對(duì)照組與STZ誘導(dǎo)的糖尿病組，分別于糖尿病發(fā)生后0、1、2、6周處死動(dòng)物，觀察大鼠腎組織miR-214及尿白蛋白變化。(2)探討miR-214是否促進(jìn)糖尿病腎損傷的發(fā)生及其潛在機(jī)制：將36只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型(STZ)組，Scrambled anti-miR處理(STZ+Scrambled anti-miR)組，anti-miR-214處理(STZ+anti-miR-214)組，Scrambled anti-miR聯(lián)合L-NAME處理(STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME)組與anti-miR-214聯(lián)合L-NAME處理(STZ+anti-miR-214+L-NAME)組。STZ誘導(dǎo)成糖尿病后7周對(duì)動(dòng)物予以anti-miR-214(10mg/kg，腹腔注射，兩周1次)處理；L-NAME處理組在注射anti-miR-214或Scrambled anti-miR的同時(shí)施加L-NAME。STZ誘導(dǎo)為糖尿病后13周處死各組動(dòng)物，取血、尿與腎組織標(biāo)本。

4.生化分析：按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)尿白蛋白和eNOS水平。

5.組織學(xué)分析：腎組織采用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，3μm 連續(xù)切片，脫蠟、水化后，行高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，用 Image J 軟件測(cè)量每個(gè)視野下PAS染色陽(yáng)性無(wú)核區(qū)腎小球膜基質(zhì)面積，計(jì)算細(xì)胞外基質(zhì)面積占腎小球面積的百分比，即腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張系數(shù)。

6.qRT-PCR：用 TRIzol 法提取組織RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照TaqMan檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明方法，以5S rRNA作為內(nèi)參，應(yīng)用StepOnePlus定量PCR儀(美國(guó) ABI 7500)檢測(cè)miR-214的表達(dá)。其他基因mRNA，以18S rRNA為內(nèi)參，按2×SYBR Green Color qPCR Mix試劑盒的說(shuō)明方法進(jìn)行擴(kuò)增。MCP-1上游引物：5′-GTGCTGACCCCAATAAGGAA-3′，下游引物：5′-TGAGGTGGTTGTGGAAAAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-AATACGTCAGACATFCGGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAATGTACAGCTGCCGTACAC-3′；eNOS上游引物：5′-CAGCCACGTTAATTTCCACTG-3′， 下游引物：5′-GACCCTCACCGATACAACATAC-3′； 18S rRNA上游引物：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′， 下游引物：5′-CCTGTATTGTTATTTTTCGTCACTACCT-3′。

結(jié) 果

1.糖尿病大鼠腎組織miR-214與尿白蛋白動(dòng)態(tài)變化：糖尿病大鼠腎組織miR-214在STZ 誘導(dǎo)后第1、2、6周顯著升高。蛋白尿在糖尿病誘導(dǎo)成功后的第2周開(kāi)始出現(xiàn)，較于腎組織miR-214出現(xiàn)顯著變化延遲了1周(<0.05，圖1)。

2.anti-miR-214促進(jìn)糖尿病大鼠腎小球eNOS mRNA和腎皮質(zhì)eNOS 蛋白的表達(dá)：如圖2所示，與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠腎小球eNOS mRNA和腎皮質(zhì)eNOS蛋白表達(dá)明顯增加(<0.05)。抑制miR-214表達(dá)可進(jìn)一步上調(diào)腎小球eNOS mRNA和腎皮質(zhì)eNOS蛋白水平(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)；eNOS抑制劑L-NAME不影響anti-miR-214對(duì)eNOS的表達(dá)調(diào)控(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，<0.05)。

3.miR-214/eNOS軸參與糖尿病大鼠蛋白尿的發(fā)生：如圖3所示，與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠空腹血糖和尿白蛋白水平明顯增加(<0.05)；利用anti-miR-214抑制miR-214表達(dá)明顯減輕糖尿病大鼠蛋白尿(<0.05)，但不影響血糖水平(>0.05)。進(jìn)一步研究顯示，eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對(duì)糖尿病大鼠蛋白尿的保護(hù)作用消失(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，>0.05)，這提示miR-214通過(guò)調(diào)控eNOS參與糖尿病大鼠蛋白尿的發(fā)生。

4.miR-214/eNOS軸參與糖尿病大鼠腎損傷：如圖4所示，與對(duì)照組比較，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體質(zhì)量減輕，腎肥大指數(shù)增加，系膜基質(zhì)增生(<0.05)。anti-miR-214顯著減輕糖尿病大鼠腎肥大，改善系膜基質(zhì)增生(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)，但對(duì)糖尿病大鼠體重?zé)o顯著影響(>0.05)。eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用消失(STZ+anti-miR-214+L-NAME組與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，腎肥大指數(shù)和腎小球系膜擴(kuò)張系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，>0.05)，這提示miR-214通過(guò)調(diào)控eNOS參與糖尿病大鼠腎損傷機(jī)制。

5.miR-214/eNOS軸調(diào)控糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1的表達(dá)：如圖5所示，與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠的腎皮質(zhì)TGF-β1和MCP-1表達(dá)顯著增高(<0.05)。anti-miR-214抑制了TGF-β1和MCP-1的表達(dá)(與STZ+Scrambled anti-miR組比較，<0.05)，eNOS抑制劑L-NAME顯著抑制了anti-miR-214介導(dǎo)的TGF-β1和MCP-1表達(dá)上調(diào)(與STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME組比較，>0.05)，這提示miR-214通過(guò)調(diào)控eNOS參與調(diào)節(jié)糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和MCP-1的表達(dá)。

討 論

本研究表明，糖尿病大鼠腎組織miR-214表達(dá)明顯上調(diào)。抑制miR-214表達(dá)減輕了糖尿病大鼠白蛋白尿，腎肥大和腎小球系膜基質(zhì)增生，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)eNOS表達(dá)，達(dá)到保護(hù)糖尿病腎損傷的作用。

miR-214是一種重要的miRNA，在多種腎損傷模型中被顯著上調(diào)。筆者發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎組織中高表達(dá)，抑制miR-214改善了糖尿病腎損傷。糖尿病腎病早期主要表現(xiàn)為持續(xù)的微量白蛋白尿。本研究發(fā)現(xiàn)，anti-miR-214可以降低糖尿病大鼠蛋白尿，但對(duì)血糖無(wú)影響，表明anti-miR-214介導(dǎo)的腎保護(hù)作用與血糖調(diào)控機(jī)制無(wú)關(guān)。腎小球肥大和系膜外基質(zhì)積聚是DKD的重要特征。

TGF-β1是一種重要的促纖維化因子，它調(diào)控系膜細(xì)胞肥大，增加膠原蛋白合成，促進(jìn)系膜外基質(zhì)積聚，最終導(dǎo)致糖尿病腎病腎小球硬化。MCP-1也被報(bào)道直接參與細(xì)胞外基質(zhì)合成，并在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的促炎作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)，anti-miR-214可顯著減輕糖尿病大鼠腎肥大，改善腎小球系膜基質(zhì)增生，同時(shí)下調(diào)腎組織TGF-β1與MCP-1的表達(dá)水平。

已有研究表明，miR-214通過(guò)抑制PTEN表達(dá)加重db/db小鼠腎小球系膜肥大和細(xì)胞外基質(zhì)積聚。筆者既往研究表明，除PTEN外，eNOS也是miR-214的靶標(biāo)，參與miR-214對(duì)血壓的調(diào)控。內(nèi)皮功能障礙是DKD早期病理異常的標(biāo)志，eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的限速酶，其功能失調(diào)或表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。與野生型小鼠比較，eNOS敲除的糖尿病小鼠表現(xiàn)出更明顯的白蛋白尿和腎小球病變。臨床研究表明，eNOS基因多態(tài)性與糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本研究顯示，在糖尿病大鼠腎活檢中腎小球eNOS表達(dá)增高，抑制miR-214上調(diào)了糖尿病大鼠腎組織eNOS水平并改善糖尿病腎損傷。此外，eNOS抑制劑L-NAME使anti-miR-214對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用消失，提示miR-214可能通過(guò)抑制eNOS表達(dá)參與DKD的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-214/eNOS軸可能參與了糖尿病大鼠腎損傷的分子機(jī)制；抑制miR-214的表達(dá)可減輕糖尿病腎損傷，為臨床DKD防治提供了新思路。在本研究使用了STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型來(lái)探討anti-miR-214的腎保護(hù)作用，該模型無(wú)法完全模擬臨床糖尿病腎病。未來(lái)需要進(jìn)一步使用更理想動(dòng)物模型、基于更大的樣本量開(kāi)展miR-214/eNOS軸參與糖尿病腎損傷的分子機(jī)制研究。