董麗麗 李 珍 徐 蓉 丁 芳 李華銘

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)在我國的發(fā)生率逐年升高，已有研究證實，西化的生活方式、飲食、環(huán)境、基因和自身免疫因素均可能導致UC的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，UC發(fā)病反復等特點可增加患結(jié)直腸癌的風險。既往研究表明，UC患者患癌的標準化發(fā)生率為3.7%～5.7%。近年來研究指出，實際UC轉(zhuǎn)罹患癌的概率已大幅降低，可能與改善治療管理有關(guān)。結(jié)腸鏡檢查是判斷UC患者腸道黏膜狀況的金標準，但其屬于侵入性檢查，耗時較長且不能實時動態(tài)評估患病情況。因此，臨床上篩選出敏感、準確的生物學標志物，對于改善患者的預后至關(guān)重要。微RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸。miRNAs廣泛參與UC的病理生理過程，其在UC活動期與緩解期的表達均有所不同。據(jù)報道，miRNA-221可通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究擬通過檢測UC患者血清外泌體miRNA-221的表達水平探討其具有的臨床意義，以期為臨床診療提供參考。

對象與方法

1.一般資料：選取2020年1月～2021年1月在筆者醫(yī)院收治的UC患者80例作為病例組，另選取同期60例健康體檢者作為對照組。本研究獲得筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學批號：KL201031)，所有研究治療和檢測方法均取得患者或家屬知情同意。納入標準：①診斷符合2012年廣州炎癥性腸病診斷與治療的共識意見；②年齡18～70歲。排除標準：①惡性腫瘤患者；②慢性心臟、肝臟、腎臟疾病患者；③伴有中毒性結(jié)腸擴張、結(jié)腸狹窄、梗阻、穿孔等；④檢查資料不完整的患者。收集患者的臨床基線數(shù)據(jù)包括年齡、性別、體重、吸煙史、紅細胞沉降率、基底漿細胞。

2.UC內(nèi)鏡活動度分級：采用Mayo評分評價UC臨床活動度，包含4個評分項目，每項0～3分。(1)排便次數(shù)：①排便次數(shù)正常；②比正常排便次數(shù)增加1～2次/天；③比正常排便次數(shù)增加3～4次/天；④比正常排便次數(shù)增加5次/天或以上。(2)便血：①未見出血；②不到一半時間內(nèi)出現(xiàn)便中混血；③大部分時間內(nèi)為便中混血；④一直存在出血。(3)內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)：①正?；驘o活動性病變；②紅斑、血管紋理減少、輕度易脆；③明顯紅斑、血管紋理缺乏、易脆、糜爛；④自發(fā)性出血、潰瘍形成。(4)醫(yī)生總體評價：①正常；②輕度病情；③中度病情；④重度病情。癥狀緩解：Mayo評分≤2分，輕度活動：3分≤Mayo評分≤5分；中度活動：6分≤Mayo評分≤10分；重度活動：11分≤Mayo評分≤12分。

3.UC嚴重度指數(shù)：采用UC內(nèi)鏡下嚴重度指數(shù)(UCEIS評分)進行評分，包含血管紋理、出血情況、糜爛和潰瘍3個方面。血管紋理評分范圍為0～2分，出血情況為0～3分，糜爛和潰瘍?yōu)?～3分，分數(shù)越高代表越嚴重。輕度患者：2分≤UCEIS評分≤3分；中度患者：4分≤UCEIS評分≤6分；重度患者：7分≤UCEIS評分≤8分。

4.血清采集：患者入院隔日采集空腹靜脈血5ml，室溫靜止30min后，4℃ 4000r/min離心15min。取血清到新的收集管后，再4℃ 12000r/min離心10min除去細胞碎片，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.指標檢測：采用速率比濁法檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，HE染色測定基底漿細胞，間接免疫熒光法檢測抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(ANCA)。

6.試劑和儀器： SYBRPrimeScriptmiRNA RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCRStripTubes購自美國Axygen公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；ABI-7300熒光定量PCR儀購自美國Ambion公司；引物設(shè)計與合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

7.引物設(shè)計與合成:根據(jù)GenBank序列設(shè)計引物，miRNA-221上游引物：5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′；下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。內(nèi)參β-actin上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

8.實時定量PCR:用PrimeScriptRT-PCR試劑盒將樣本提取后的RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，使用ABI-7500熒光實時定量PCR儀進行PCR擴增及檢測miRNA-221水平。miRNA-221及內(nèi)參β-actin的擴增產(chǎn)物長度分別為110、112bp。RT-PCR反應(yīng)體系：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火30s，最后72℃延伸30s，循環(huán)40次。

結(jié) 果

1.兩組一般臨床資料及血清miRNA-221比較：兩組年齡、性別、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)。病例組紅細胞沉降率、基底漿細胞、CRP、miRNA-221水平高于對照組(<0.05)，詳見表1。

2.不同內(nèi)鏡活動度UC患者血清miRNA-221水平比較：重度活動組、中度活動組患者血清miRNA-221水平均高于輕度活動組，重度活動組血清miRNA-221水平高于中度活動組(均<0.05)，詳見表2。

3.不同UC嚴重度指數(shù)患者血清miRNA-221水平比較：重度、中度患者血清miRNA-221水平高于輕度患者，重度患者血清miRNA-221水平高于中度患者(均<0.05)，詳見表3。

4.UC患者血清miRNA-221水平與臨床參數(shù)相關(guān)性：血清miRNA-221與紅細胞沉降率、基底漿細胞、CRP、Mayo評分、UCEIS評分呈正相關(guān)(均<0.05)，詳見表4。

5.血清miRNA-221水平對UC、UC內(nèi)鏡下活動度、UC嚴重程度的診斷價值：血清miRNA-221在預測發(fā)生識別UC、UC內(nèi)鏡下活動度、UC嚴重程度的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.786(95%CI：0.713～0.857)、0.674(95%CI：0.576～0.771)、0.801(95%CI：0.725～0.887)，詳見表5和圖1。

討 論

研究顯示，腫瘤或炎癥性疾病患者的circRNA可抑制miRNA功能，調(diào)控基因表達，從而影響表型。lncRNA H19可通過調(diào)控miRNA-675-5p表達，間接調(diào)控腸上皮細胞屏障功能相關(guān)蛋白VDR、ZO-1等的表達，從而導致UC發(fā)生。miRNA-221與多種炎性疾病關(guān)系密切，是一種功能性miRNA。既往研究指出，miRNA-221在UC患者中異常表達能通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子水平參與到UC的發(fā)病過程。本研究結(jié)果提示，miRNA-221相對表達量是UC發(fā)病的危險因素，其發(fā)病可能與miRNA-221因子參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)。研究表明，慢性炎癥與癌癥發(fā)展之間存在關(guān)聯(lián)。通過激活炎性細胞因子IL-6促進上皮細胞和免疫細胞正常分泌向惡性細胞轉(zhuǎn)變。據(jù)報道，結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有炎性反應(yīng)，但尚不清楚這些炎癥是否與信號調(diào)節(jié)的通路相同。本研究顯示，miRNA-221作為炎癥效應(yīng)分子在UC患者中表達失調(diào)，提示其在結(jié)直腸癌發(fā)生中的重要性。

目前，臨床上常用UCEIS評分和Mayo內(nèi)鏡評分評價UC患者的黏膜病變程度，而Mayo內(nèi)鏡評分以黏膜脆性為分級標準，由于知識和經(jīng)驗掌握程度不同，致使各醫(yī)生對UC患者的評估結(jié)果各異，容易影響結(jié)果判斷的準確性。而UCEIS主要從糜爛和潰瘍、出血情況、血管紋理3方面進行黏膜病變評價，判斷標準上容易量化，對黏膜病變程度的評價更為細致。研究顯示，UCEIS評價UC患者臨床轉(zhuǎn)歸及遠期預后方面的準確度高于Mayo內(nèi)鏡評分。本研究結(jié)果顯示，miRNA-221與UCEIS評分和Mayo內(nèi)鏡評分密切相關(guān)，提示miRNA-221在UC患者臨床轉(zhuǎn)歸及遠期預后方面也可能發(fā)揮重大作用。研究表明，miRNA-221可參與調(diào)節(jié)單核細胞及巨噬細胞的分化等多種生理活動。此外，有多項研究表明，miRNA-221與肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細胞癌及膠質(zhì)瘤等發(fā)生有關(guān)。

研究表明，miRNA-17-92、miRNA-21家族在腫瘤組織中常表達異常，非酒精性脂肪性肝病小鼠T細胞中可見170種miRNA，其中大部分通過MAPK信號通路表達下調(diào)。miRNA因其穩(wěn)定性和多樣性等特點，被廣泛用于疾病治療、診斷以及預后評估，可作為分子標志物。慢性UC反復發(fā)作可演變?yōu)榻Y(jié)直腸癌，是UC最嚴重的并發(fā)癥。基于miRNA-221在UC相關(guān)結(jié)腸癌患者中的獨特表達模式，其可能是UC發(fā)病機制中重要的調(diào)節(jié)因子。筆者研究結(jié)果表明，miRNA-221可以作為一種生物學標志物，用于識別有這種惡性轉(zhuǎn)化風險的患者。本研究還表明，miRNA-221表達水平與UC活動和疾病持續(xù)時間密切相關(guān)，這為當前臨床診療指南提供分子生物學基礎(chǔ)。

綜上所述，潰瘍性結(jié)腸炎血清miRNA-221水平升高，血清miRNA-221水平與潰瘍性結(jié)腸炎疾病嚴重程度呈正相關(guān)，其表達水平有助于早期識別評估UC的發(fā)展階段和疾病嚴重程度，可作為早期診治的生物學標志物。