劉汝夢(mèng)，杜勇，張劍波，葉曉馨,*

1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230000

2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310000

化感作用(allelopathy)是植物或微生物通過(guò)向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)對(duì)其他植物或微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)或抑制的現(xiàn)象[1]。植物或微生物釋放的這些化學(xué)物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)，由于其來(lái)源天然，具有生物降解性好、生態(tài)安全性高等特點(diǎn)，近年來(lái)植物釋放化感物質(zhì)抑制藻類生長(zhǎng)的研究引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[2-3]。目前化感抑藻研究關(guān)注最多的是水生植物，包括苦草(Vallisneriaspiralis)、穗花狐尾藻(Myriophyllumverticillatum)和微眼子菜(Potamogetonmaackianus)等[4-6]。水生植物對(duì)藻類的化感效應(yīng)存在強(qiáng)烈的種間差異性和季節(jié)性，且在同一生境中的生物有機(jī)體已經(jīng)適應(yīng)了該系統(tǒng)內(nèi)的化感物質(zhì)，所以在抑藻方面有一定的局限性[7]。部分陸生植物也被證實(shí)具有一定的化感抑藻效果，如大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)等[8-10]。王家春等[11]研究了加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)根、莖、葉和花4種器官的水浸提液對(duì)東海原甲藻(Prorocentrundonghaiense)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示4種器官水浸提液對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到90%左右。水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的抑制率分別達(dá)到83.68%和50.90%[12]。利用大麥秸稈治理藻華是目前實(shí)際運(yùn)用最為成功的陸生植物抑藻的實(shí)例。經(jīng)Ball等[13]測(cè)定，大麥秸稈浸提液對(duì)銅綠微囊藻有明顯抑制效果，腐爛的大麥秸稈浸提液可以顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，浸提液處理后銅綠微囊藻葉綠素a(Chla)的含量?jī)H為對(duì)照組的10%。作為陸生和水生植物過(guò)渡帶的部分濕生植物既能夠分泌化感物質(zhì)又可對(duì)其他植物產(chǎn)生強(qiáng)烈的化感作用[14]，如添加50 g·L-1香蒲(Typhaorientalis)葉浸提液12 d后，銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制率高達(dá)91.37%[15]。探討濕生植物的化感抑藻作用具有重要的研究意義。

植物化感物質(zhì)作用于藻細(xì)胞的機(jī)制主要包括：抑制細(xì)胞酶活性、影響藻類光合作用、損壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及其他生理方面影響如改變細(xì)胞的呼吸作用、蛋白質(zhì)合成和基因表達(dá)等[16]。酶在生物體中起著至關(guān)重要的作用，部分酶活性及功能受到化感物質(zhì)的影響從而直接或間接影響生物體的生長(zhǎng)和生理特性。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)2-甲基乙酰乙酸乙酯(eathyl-2-methyl acetoacetate,EMA)處理三角褐指(Phaeodactylumtricornutum)6 d后，藻細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性顯著下降。在化感物質(zhì)的作用下，藻類的光合色素也會(huì)受到影響，光合速率降低是化感物質(zhì)對(duì)光合作用造成影響的重要表現(xiàn)。經(jīng)0.65% (V∶V)水稻分蘗枝發(fā)酵液處理5 d的銅綠微囊藻Chla含量降至對(duì)照組的14.6%[12]?；形镔|(zhì)還可以破壞藻細(xì)胞質(zhì)膜上離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物滲出率增加，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，破壞細(xì)胞膜完整性[7]。蛋白核小球藻藻液中加入從蘆葦(Phragmitescommunis)中分離的化感物質(zhì)EMA后，藻細(xì)胞的離子滲出率達(dá)到細(xì)胞膜完全破壞時(shí)離子滲出率的95%以上[18]。探討化感植物對(duì)不同藻類的選擇性抑制機(jī)理有助于將化感作用有效應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化水體中的藻類控制。

陌上菅(Carexthunbergii)為莎草科苔草屬多年生草本植物，是濕地消落帶的常見(jiàn)種和優(yōu)勢(shì)種，在濕地植物群落構(gòu)建和演替過(guò)程中起重要作用[19]。近年升金湖濕地陌上菅迅速擴(kuò)增，造成濕地結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化，生物多樣性降低。張金羽等[20]研究認(rèn)為陌上菅對(duì)其他伴生禾本科植物強(qiáng)烈的化感作用可能是陌上菅成為升金湖消落帶優(yōu)勢(shì)種的重要原因。探討陌上菅的化感抑藻效應(yīng)，不僅是對(duì)陌上菅的資源化利用，且擴(kuò)寬了化感抑藻植物的篩選范圍。斜生柵藻是淡水中極為常見(jiàn)的浮游綠藻，對(duì)污染物的耐性較強(qiáng)且繁殖快，常作為淡水水體生態(tài)常用指示物種，同時(shí)斜生柵藻也是淡水水體污染指示種之一，在水生生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位[21]。因此本文以指示物種斜生柵藻為受體，探討陌上菅對(duì)藻類的化感效應(yīng)，從氧化性角度探索其化感作用機(jī)制，為后續(xù)將陌上菅應(yīng)用于其他惡性藻類治理時(shí)可能會(huì)對(duì)斜生柵藻等常見(jiàn)藻類的破壞提供一定的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

陌上菅采自2019年6月安徽省升金湖國(guó)家自然保護(hù)區(qū)楊娥頭保護(hù)點(diǎn)(30°20′56″ N，117°2′24″ E)，取烘干至恒重的陌上菅全株于粉碎機(jī)中粉碎后過(guò)1 mm篩。在150 mL錐形瓶中加入1 g陌上菅粉末以及100 mL去離子水，使用超聲波清洗機(jī)(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)浸提20 min，獲得粗提液。浸提完成后將粗提液以9 000 r·min-1離心3 min，上清液用濾紙過(guò)濾至錐形瓶中，作為陌上菅浸提液原液(10 g·L-1)于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。斜生柵?編號(hào)FACHB-12)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻水庫(kù)，在25 ℃的BG11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(光照度為2 000 lx)，將受試生物培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期以供使用(約6.6×106cells·mL-1)。

1.2 生物量測(cè)定

根據(jù)升金湖綠藻密度變化范圍[22]，設(shè)定體系中斜生柵藻的初始藻密度分別為5×105cells·mL-1和1×106cells·mL-1。在無(wú)菌條件下加入一定量先前培養(yǎng)的藻液，再分別取10、25和50 mL陌上菅浸提液原液，最后加入BG11培養(yǎng)基中使整個(gè)體系保持150 mL，陌上菅浸提液的濃度分別為0.67、1.67和3.33 g·L-1，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不加任何陌上菅浸提液的藻液作為對(duì)照組，共24個(gè)處理。將錐形瓶置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置光照度2 000 lx，溫度為25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間共持續(xù)15 d。于實(shí)驗(yàn)第0、5、10和15天取樣測(cè)定有關(guān)參數(shù)。使用光密度法在紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)(TU-1900，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)波長(zhǎng)為680 nm下測(cè)定藻液的吸光度，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法建立生物量-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得光密度(y)和藻密度(x)線性方程為：y=905.98x+4.0993 (R2=0.9974)，確定藻細(xì)胞密度[23]。

1.3 葉綠素測(cè)定

參照Z(yǔ)hang等[24]的方法，用丙酮(≥99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)提取Chla，通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)在645 nm和663 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算Chla含量：

Chla(mg·L-1)=13.96A663-6.88A645

1.4 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

吸取10 mL的藻液加入到離心管中，然后在4 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心15 min，傾去上清液，然后向離心管中加入2 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1pH為7.8的磷酸緩沖液，使用液氮反復(fù)凍融3次，破碎液在10 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心30 min，獲得的上清液即為粗酶液，于-20 ℃儲(chǔ)存以備進(jìn)一步使用。超氧化物歧化酶(SOD)用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定[25]，一個(gè)單位(U)的SOD被定義為50%抑制NBT光化學(xué)還原的酶量，按下列公式計(jì)算SOD活性：

SOD活性(U·cells-1) = [(A0-AS)×V]/(A0×0.5×VT×Va×C)

式中：A0為對(duì)照管吸光度；AS為樣品管吸光度；V為提取液總體積(mL)；VT為測(cè)定時(shí)提取液用量(mL)；Va為離心的藻液體積(mL)；C為藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)。

過(guò)氧化氫酶(CAT)參照Rao等[26]的方法測(cè)定，一個(gè)單位的CAT被定義為在1 min內(nèi)A240降低0.1為一個(gè)酶活性單位(U)，按下列公式計(jì)算CAT活性：

CAT活性(U·cells-1) = (ΔA240×V)/(0.1×VT×1×Va×C)

ΔA240=AS0-(AS1+AS2)/2

式中：AS0為煮死酶液對(duì)照管吸光度；AS1、AS2為樣品管吸光度；V為提取液總體積(mL)；VT為測(cè)定時(shí)提取液用量(mL)；Va為離心的藻液體積(mL)；C為藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)；1為反應(yīng)時(shí)間(min)。

丙二醛(MDA)含量參照Heath和Packer[27]的方法測(cè)定，根據(jù)MDA與硫代巴比妥酸(TBA)的定量反應(yīng)來(lái)測(cè)定MDA的含量。在532、600和450 nm處測(cè)定吸光度，按下列公式計(jì)算MDA的含量：

MDA濃度(μmol·L-1) = 6.45×(A532-A600)-0.56×A450

然后再用μmol·(107cells)-1(藻細(xì)胞密度)表示MDA的含量。

1.5 細(xì)胞膜完整性與酯酶活性測(cè)定

斜生柵藻細(xì)胞培養(yǎng)15 d后，收集不同處理的藻液，參照Xiao等[28]的方法使用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM) (Cytoflex型，美國(guó)BeckmanCoulteer公司)測(cè)定了斜生柵藻藻細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性和酯酶活性，使用66.8 mg·L-1碘化丙啶(PI) (>94%，上海易匯生物科技有限公司)溶液和10 mg·L-1熒光素二乙酸醋(FDA) (～97%，合肥巴斯夫生物科技有限公司)溶液染色15 min。氬離子激光器(激發(fā)波長(zhǎng)480 nm)對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)。采用FL2檢測(cè)器(564～606 nm)檢測(cè)PI染色細(xì)胞，用以評(píng)估細(xì)胞膜的完整性。數(shù)據(jù)以染色細(xì)胞百分比表示：

染色細(xì)胞(%)=(PI染色細(xì)胞的數(shù)量/FCM檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)量)×100

FDA的熒光用FL1檢測(cè)器(515～545 nm)檢測(cè)藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性，依據(jù)熒光強(qiáng)度將藻細(xì)胞劃分為：酯酶活性抑制群(R1)、酯酶活性正常群(R2)和酯酶活性激發(fā)群(R3)，并分別統(tǒng)計(jì)其占總細(xì)胞的百分比。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 25.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素(one-way ANOVA)和雙因素(two-way ANOVA)方差分析確定不同濃度陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)及生理的影響，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較(α=0.05)。用Flowjo軟件(Tree Star,San Carlos,CA,USA)分析計(jì)算FCM所檢測(cè)到的信號(hào)值，使用Origin 2018(OriginLab Corp.,Wellesley Hills,USA)繪圖。圖表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果(Results)

2.1 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

初始藻密度和陌上菅浸提液濃度均能顯著影響斜生柵藻藻細(xì)胞的密度，但它們之間的交互作用并沒(méi)有顯著影響(表1)。總體來(lái)看，陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)具有一定的抑制效果(圖1)。在陌上菅浸提液添加的第5天，未見(jiàn)浸提液對(duì)斜生柵藻的密度有顯著的抑制效果，甚至在初始藻密度為5×105cells·mL-1的條件下，陌上菅浸提液的添加輕微但不顯著地促進(jìn)了斜生柵藻的生長(zhǎng)。然而，暴露于陌上菅浸提液10 d，與對(duì)照相比，添加了陌上菅浸提液的斜生柵藻藻密度顯著降低(P<0.05)，不同濃度陌上菅浸提液處理間藻密度無(wú)明顯差異(P>0.05)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第15天，陌上菅浸提液顯著抑制了斜生柵藻的生長(zhǎng)(P<0.05)。相較對(duì)照陌上菅對(duì)斜生柵藻藻密度的最大抑制率可達(dá)59.6% (1.67 g·L-1)。在初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)前10 d陌上菅浸提液的添加雖然抑制了斜生柵藻的生長(zhǎng)，但抑制效果并不顯著(P>0.05) (圖1(b))。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第15天，陌上菅浸提液顯著抑制了斜生柵藻的生長(zhǎng)(P<0.05)。整體來(lái)看，陌上菅濃度較高時(shí)，抑制率隨時(shí)間的增加而升高，濃度較低時(shí)隨時(shí)間的增加先上升后降低。對(duì)照組藻密度隨時(shí)間而增加，高濃度陌上菅浸提液處理下，藻密度呈單峰曲線。3.33 g·L-1陌上菅浸提液處理下，藻密度在第5天達(dá)到最大值，僅為2.51×106cells·mL-1。

圖1 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻藻密度的影響注：(a)初始藻濃度5×105 cells·mL-1；(b)初始藻濃度1×106 cells·mL-1；同一時(shí)間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；下同。Fig.1 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the algal density of Scenedesmus obliquusNote:(a) Initial algal density at 5×105 cells·mL-1;(b) Initial algal density at 1×106 cells·mL-1;different letters indicated significant difference among different treatments in the same time at 0.05 level;the same below.

2.2 對(duì)斜生柵藻光合系統(tǒng)的影響

Chla可反映斜生柵藻潛在光合能力，一旦Chla的合成被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也將受到抑制。斜生柵藻Chla的含量受初始藻密度和陌上菅浸提液濃度的影響顯著，但是初始藻密度和陌上菅浸提液濃度交互作用對(duì)Chla含量沒(méi)有顯著的影響(表1)。由圖2可知，Chla含量與藻密度的變化趨勢(shì)基本保持一致。對(duì)照處理的斜生柵藻Chla含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)，在添加3.33 g·L-1陌上菅浸提液5 d后，Chla合成較對(duì)照顯著升高(P<0.05)。然而，在暴露于陌上菅浸提液10 d后，添加了陌上菅浸提液的Chla含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，不同濃度陌上菅浸提液處理間藻密度無(wú)明顯差異。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第15天，3.33 g·L-1陌上菅浸提液處理下，Chla含量?jī)H為對(duì)照組的28%。初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)，在陌上菅浸提液添加的第5天，未見(jiàn)浸提液對(duì)斜生柵藻的Chla有顯著的抑制效果。在暴露于陌上菅浸提液10 d后，與對(duì)照相比，添加了陌上菅浸提液的Chla含量顯著降低。

圖2 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻葉綠素a含量的影響Fig. 2 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the chlorophyll a content of Scenedesmus obliquus

表1 不同初始藻密度和陌上菅浸提液濃度及其互作對(duì)斜生柵藻生物量和生理生化特性影響的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA for the effect of different initial algal density and concentration of Carex thunbergii aqueous extract and their interaction on biomass and physiological characteristics of Scenedesmus obliquus

2.3 對(duì)斜生柵藻抗氧化酶活性的影響

陌上菅浸提液處理顯著影響了斜生柵藻的抗氧化酶系統(tǒng)，而初始藻密度對(duì)抗氧化酶活性均不具顯著作用。藻密度和陌上菅浸提液的交互作用顯著影響了SOD活性但對(duì)CAT活性影響并不顯著(表1)。對(duì)照處理的斜生柵藻SOD和CAT活性在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間始終保持在穩(wěn)定的范圍內(nèi)。初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)(圖3(a))，在陌上菅浸提液添加的第5天，0.67 g·L-1和1.67 g·L-1浸提液顯著刺激了斜生柵藻SOD活性。在暴露于陌上菅浸提液10 d，與對(duì)照組相比不同濃度浸提液處理下SOD活性顯著增加，最大值可達(dá)4.6 U·(107cells)-1(3.33 g·L-1組)，是對(duì)照組的4.1倍。然而，在實(shí)驗(yàn)第15天，不同濃度陌上菅浸提液處理下的SOD活性均有所下降，其中0.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下SOD活性下降至與對(duì)照組同等水平。初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)(圖3(b))，當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第5天，1.67 g·L-1浸提液則顯著刺激了斜生柵藻SOD活性。在暴露于陌上菅浸提液10 d，與對(duì)照相比，添加了陌上菅浸提液的斜生柵藻SOD活性顯著增加(P<0.05)。然而，陌上菅浸提液添加第15天，SOD活性均有所下降，其中1.67 g·L-1和3.33 g·L-1浸提液處理下SOD活性下降至與對(duì)照組同等水平(P>0.05)。

圖3 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig. 3 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the superoxide dismutase (SOD) activity of Scenedesmus obliquus

斜生柵藻在陌上菅浸提液的作用下CAT活性的變化如圖4所示。初始藻密度為5×105cells·mL-1和初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)，不同濃度陌上菅浸提液處理下斜生柵藻CAT活性變化趨勢(shì)大體一致。添加0.67 g·L-1陌上菅浸提液的第5天，浸提液對(duì)斜生柵藻有明顯刺激效果。然而，在暴露于陌上菅浸提液10 d，CAT活性下降至與對(duì)照組接近水平。在實(shí)驗(yàn)第5天，與對(duì)照組相比，添加1.67 g·L-1和3.33 g·L-1陌上菅浸提液處理的CAT活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異。第10天，1.67 g·L-1浸提液則顯著刺激了斜生柵藻CAT活性，并在初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)達(dá)到最大值0.27 U·(107cells)-1，是對(duì)照組的4倍。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第15天，3.33 g·L-1陌上菅浸提液處理的CAT活性與對(duì)照組出現(xiàn)明顯差異，顯著刺激了斜生柵藻CAT活性(P<0.05)。

圖4 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 4 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the catalase (CAT) activity of Scenedesmus obliquus

2.4 對(duì)斜生柵藻MDA含量的影響

圖5 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the malondialdehyde (MDA) content of Scenedesmus obliquus

2.5 對(duì)細(xì)胞膜完整性和酯酶活性的影響

相較對(duì)照，陌上菅浸提液的添加顯著增加了凋亡細(xì)胞的占比(圖6)。在實(shí)驗(yàn)第15天，初始藻密度5×105cells·mL-1和1×106cells·mL-1時(shí)，0.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下，凋亡細(xì)胞的占比從對(duì)照組的3%分別增加到9%和25%，1.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下分別增加到14%和27%。陌上菅浸提液的濃度為3.33 g·L-1時(shí)，細(xì)胞的凋亡率下降至8%左右。

圖6 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 6 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the cell membrane integrity of Scenedesmus obliquus

根據(jù)FDA染色后的熒光強(qiáng)度將藻細(xì)胞分為酯酶活性抑制群(R1)、酯酶活性正常群(R2)和酯酶活性激發(fā)群(R3)。與對(duì)照組相比，陌上菅浸提液的添加導(dǎo)致R2群藻細(xì)胞占比顯著下降。不添加陌上菅浸提液的對(duì)照處理15 d后，R2群藻細(xì)胞占比90%以上。而1.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下，R2群占比降為77.6% (初始藻密度5×105cells·mL-1)和63.1% (1×106cells·mL-1) (圖7)。陌上菅浸提液處理的R1和R3區(qū)細(xì)胞數(shù)量均有所增加。初始藻密度為5×105cells·mL-1，添加了陌上菅浸提液的R1群細(xì)胞占比顯著高于對(duì)照，0.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下，R1群細(xì)胞占比為7.2%，顯著高于對(duì)照 (1.9%)。添加了陌上菅浸提液后R3群細(xì)胞占比也顯著增高，皆高于10%。初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)，不同處理下R1群細(xì)胞占比無(wú)顯著差異，但陌上菅浸提液處理顯著增加了高活性R3區(qū)細(xì)胞的比例。1.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下R3區(qū)細(xì)胞占比最高(29.3%)，顯著高于對(duì)照的R3區(qū)細(xì)胞占比(4.7%)。

圖7 陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻酯酶活性的影響注：依據(jù)熒光強(qiáng)度將藻細(xì)胞劃分為酯酶活性抑制群(R1)、酯酶活性正常群(R2)和酯酶活性激發(fā)群(R3)，圖中數(shù)據(jù)為不同酯酶活性藻細(xì)胞占比。Fig.7 Effect of Carex thunbergii aqueous extract on the esterase activity of Scenedesmus obliquusNote:R1 represents a decrease in esterase activity;R2 represents esterase activity in the control cells;R3 represents an increase in esterase activity;data are expressed as the percentage of S. obliquus cells with various esterase activity.

3 討論(Discussion)

近年來(lái)利用植物化感作用控制藻類生長(zhǎng)被認(rèn)為是極具前景的生態(tài)防治水華暴發(fā)的方法，其中濕生植物具有較強(qiáng)生物活性潛能，資源豐富，探討濕生植物對(duì)藻類的化感作用及機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[29-30]。本研究結(jié)果表明，濕生植物陌上菅的浸提液能夠有效抑制斜生柵藻生長(zhǎng)，降低其藻密度。陌上菅浸提液的濃度以及藻液的初始密度對(duì)斜生柵藻的藻密度均有顯著性影響。在初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)，陌上菅浸提液處理5 d對(duì)斜生柵藻有輕微的促進(jìn)效應(yīng)。與對(duì)照組相比，陌上菅浸提液的添加對(duì)藻密度整體呈先促后抑作用，可能是前期陌上菅浸提液的加入給藻細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，而后期陌上菅化感效應(yīng)起主導(dǎo)作用抑制了藻細(xì)胞進(jìn)一步繁殖生長(zhǎng)。Hong等[31]也認(rèn)為蘆葦中重要的化感物質(zhì)EMA對(duì)羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)的化感作用具有多重效應(yīng)，從而導(dǎo)致不同初始藻密度的羊角月牙藻生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)對(duì)EMA的響應(yīng)不同。初始藻密度為1×106cells·mL-1時(shí)，不同濃度陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻的藻密度呈整體抑制。初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)，1.67 g·L-1陌上菅浸提液處理下，抑制率在第15天達(dá)到最大值59.6%。這說(shuō)明陌上菅具有有效控制藻類增長(zhǎng)的可能性。同時(shí)，雖然與對(duì)照組相比經(jīng)陌上菅浸提液處理15 d后斜生柵藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制，但是與初始藻密度相比，處理15 d后的斜生柵藻藻密度仍然有生長(zhǎng)的趨勢(shì)，可以看出斜生柵藻對(duì)陌上菅浸提液有較強(qiáng)的耐受力。

Chla是藍(lán)綠藻中的主要光合色素，是決定光合速率的重要因素。經(jīng)不同濃度陌上菅浸提液處理后斜生柵藻的Chla含量顯著低于對(duì)照組。與先前研究結(jié)果相似，菹草(Potamogetoncrispus)分別與普通小球藻(Chlorellavulgaris)和銅綠微囊藻共同培養(yǎng)6 d后，小球藻和銅綠微囊藻的Chla含量均顯著降低[32]。本實(shí)驗(yàn)中Chla含量的降低說(shuō)明由于陌上菅浸提液抑制了斜生柵藻的光合作用，進(jìn)而導(dǎo)致其生理代謝的異常。

不同濃度陌上菅浸提液對(duì)藻細(xì)胞的損傷導(dǎo)致ROS增加，隨之細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化增加進(jìn)一步加劇了細(xì)胞損傷程度。為了抵消或抵抗陌上菅浸提液帶來(lái)的不良影響，藻細(xì)胞需提供能量以維持一些基因的表達(dá)以及酶和化合物的合成，進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞酯酶活性增加。這與以往的化感控藻實(shí)驗(yàn)中，如EMA的添加促使銅綠微囊藻酯酶活性增加的原理相似[38]。同時(shí)，抑制群和激發(fā)群細(xì)胞含量增加為陌上菅浸提液削弱斜生柵藻的酶促系統(tǒng)提供了額外的經(jīng)驗(yàn)證據(jù)[39]。

在陌上菅浸提液添加第15天，不同濃度陌上菅浸提液對(duì)斜生柵藻的藻密度抑制均達(dá)到了40%以上，最高抑制率達(dá)到59.6%，而藻細(xì)胞凋亡率最高僅為27%。陌上菅浸提液處理后，斜生柵藻藻密度顯著降低，但絕大數(shù)的藻細(xì)胞仍保持其細(xì)胞膜完整性。這說(shuō)明陌上菅對(duì)斜生柵藻的抑藻效應(yīng)表現(xiàn)為“algistatic (阻止藻種群生長(zhǎng))”。浸提液雖然在一定程度上能夠?qū)е律倭總€(gè)體藻細(xì)胞凋亡，但是主要的抑制作用是通過(guò)抑制藻細(xì)胞光合作用，改變細(xì)胞酯酶活性，誘導(dǎo)過(guò)氧化損傷等從而延遲了斜生柵藻種群的增長(zhǎng)速度。同樣在其他環(huán)境對(duì)藍(lán)藻的脅迫下也得到了相似的結(jié)果，如：人面子(Dracontomelonduperreanum)落葉水浸出液、大麥秸稈腐解液和稻草提取液對(duì)銅綠微囊藻的化感作用相似，均是在一定劑量的暴露下延遲藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[40-42]。陌上菅浸提液化感物質(zhì)控藻方式更多是減緩藻種群生長(zhǎng)速度而非直接致死，因此導(dǎo)致斜生柵藻在較強(qiáng)外界壓力下進(jìn)一步進(jìn)化及變異的可能性相對(duì)較小，生態(tài)安全性較好。盡管目前沒(méi)有研究對(duì)陌上菅浸提液的化感物質(zhì)進(jìn)行分析，但是Li等[43]研究認(rèn)為有機(jī)酸可能是灰化苔草中抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的主要化感物質(zhì)，然而陌上菅具體的化感物質(zhì)成分還需在未來(lái)的研究中進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果表明，陌上菅浸提液添加以及初始藻密度能夠顯著影響斜生柵藻生長(zhǎng)和生理。初始藻密度影響了斜生柵藻對(duì)不同濃度浸提液的響應(yīng)敏感性。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，陌上菅浸提液對(duì)藻密度抑制效應(yīng)提高。初始藻密度為5×105cells·mL-1時(shí)，經(jīng)1.67 g·L-1陌上菅浸提液處理15 d斜生柵藻藻密度相較對(duì)照抑制率最高，可達(dá)59.6%。陌上菅浸提液可以破壞藻細(xì)胞膜完整性，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，初始藻密度為1×106cells·mL-1陌上菅浸提液濃度為1.67 g·L-1時(shí)細(xì)胞凋亡率最高達(dá)27%。但陌上菅對(duì)藻密度抑制效應(yīng)主要是抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。陌上菅浸提液處理下，藻細(xì)胞葉綠素明顯降低，抗氧化酶活性大幅度提升，MDA含量顯著上升，酯酶活性正常的細(xì)胞占比降低。綜上所述，陌上菅浸提液可通過(guò)削弱一系列生理活動(dòng)從而抑制斜生柵藻種群增長(zhǎng)，更深入的研究可為利用陌上菅進(jìn)行化感抑藻提供參考依據(jù)，為陌上菅的資源化利用提供思路。