湯杰，張相，朱娜麗，李靈香玉,*，王亞韡

1.國科大杭州高等研究院環(huán)境學(xué)院，杭州 310024

2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100085

納米顆粒被生物攝入到體內(nèi)后容易與蛋白質(zhì)相互作用。此時，蛋白質(zhì)自發(fā)的吸附到納米顆粒表面，形成納米顆粒-蛋白質(zhì)的核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合物，其表面蛋白質(zhì)被稱作“蛋白冠”。根據(jù)蛋白質(zhì)與納米顆粒表面親和力的差異，蛋白冠被分為“硬冠”和“軟冠”[1]。當?shù)鞍踪|(zhì)開始與納米顆粒相互作用時，軟冠借助弱相互作用吸附在納米顆粒表面，此時溶液中蛋白質(zhì)和吸附在納米顆粒表面的蛋白質(zhì)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。隨后發(fā)生Vroman效應(yīng)[2]，即最初的高濃度及具有高遷移率但是親和力相對低的蛋白質(zhì)將逐漸以弱結(jié)合的低穩(wěn)定態(tài)吸附在納米顆粒表面，隨著時間的推移，這些低親和力的軟冠蛋白會被親和力更強的蛋白質(zhì)取代[3]，進而改變蛋白冠組成，形成硬冠。通常，軟冠被描述為一種高度動態(tài)且松散的蛋白質(zhì)層，而硬冠比軟冠具有更高的結(jié)合能，使得硬冠在納米顆粒表面的吸附不可逆[4-7]。

蛋白冠的形成使得納米顆粒具有新的生物學(xué)特征，并影響納米顆粒在生物體或環(huán)境系統(tǒng)中的吸收/吸附、分布、轉(zhuǎn)化和歸趨等[8]。這些特征對納米顆粒的生物效應(yīng)[9]和靶向納米藥物的設(shè)計[10-12]等都具有重要意義。因此，在過去的10多年中，蛋白冠已成為一個研究熱點，由于蛋白質(zhì)易于分析和結(jié)構(gòu)表征，而且蛋白質(zhì)在受體參與和信號傳遞中起著關(guān)鍵作用，因此近些年的研究的重點和核心主要在蛋白冠上。

本文基于近期的文獻資料，較為系統(tǒng)地對蛋白冠的形成及影響因素、蛋白冠的表征分析方法和蛋白冠對納米顆粒生物效應(yīng)的影響進行歸納總結(jié)，并展望了后續(xù)的重點研究方向，以期待對蛋白冠的形成、應(yīng)用和風(fēng)險評估研究提供一定的參考。

1 蛋白冠的形成(Formation of protein corona)

1.1 蛋白質(zhì)吸附的作用機制

納米顆粒被生物體攝入后，會被體內(nèi)游離的蛋白質(zhì)所包圍。蛋白質(zhì)通過擴散或沿著勢能梯度遷移到納米顆粒表面，不斷地相互競爭納米顆粒表面的結(jié)合位點，以吸附到納米顆粒上形成蛋白冠。文獻資料表明，蛋白冠的形成主要由庫侖力和范德華力、氫鍵和疏水相互作用等介導(dǎo)[8,13-14]。熱力學(xué)因素影響蛋白冠的形成，只有在熱力學(xué)有利的條件下，蛋白質(zhì)吸附才會自發(fā)地發(fā)生。首先，高豐度蛋白質(zhì)會短暫形成軟蛋白冠，隨著時間的增加，根據(jù)Vroman效應(yīng)，高親和力蛋白質(zhì)會逐漸取代軟蛋白冠吸附到納米顆粒表面，進而形成硬蛋白冠，并最終在納米顆粒表面形成單層或多層的蛋白冠結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)對納米顆粒的親和力決定了它們與其他物質(zhì)發(fā)生相互作用或轉(zhuǎn)移到新的流體介質(zhì)時的行為與歸趨是吸附、保持結(jié)合還是解離[14]。蛋白冠的結(jié)合是一個自發(fā)的過程(公式(1)[14])，在整個過程中焓降低，同時納米顆粒周圍的水合層被取代，也導(dǎo)致了熵的增加。其中ΔGads、ΔHads和ΔSads分別表示吸附過程中吉布斯自由能、焓和熵的變化，T表示溫度。

ΔGads=ΔHads-TΔSads<0

(1)

共價鍵和非共價鍵的形成、界面水分子的重排以及蛋白質(zhì)或納米顆粒表面的構(gòu)象變化等一系列反應(yīng)都會使焓減少(ΔHads<0)或熵增加(ΔSads>0)，這些均有利于蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的吸附。吸附過程中所涉及的作用機制取決于蛋白質(zhì)和納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)。

吸附過程中ΔGads決定了蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物的穩(wěn)定性。具有較大ΔGads的蛋白冠解吸釋放到孵育溶液的概率較低，且傾向于和納米顆粒保持結(jié)合。而有著較小ΔGads的蛋白冠很容易解吸并釋放到孵育溶液中。由此，帶電荷或疏水的納米顆粒比親水性的納米顆粒更易與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的相互作用[14]。

總體上，蛋白質(zhì)與納米顆粒相互作用形成蛋白冠的作用機制包括非極性氨基酸的疏水作用、共價鍵結(jié)合、范德華力、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、靜電吸引或排斥作用、陽離子橋連作用、配體交換、氫鍵作用、蛋白質(zhì)與其他生物分子的螯合或置換作用等[8](圖1)。資料顯示，部分相互作用可能導(dǎo)致吸附在納米顆粒表面的蛋白質(zhì)變性，進而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能[15]。

在蛋白冠形成過程中，蛋白質(zhì)可能發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，即“構(gòu)象變化”。如果蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水或帶電序列分別與疏水或帶電的納米顆粒表面相互作用，則有利于構(gòu)象的熱力學(xué)變化，大多數(shù)蛋白冠在對納米顆粒的吸附過程中都表現(xiàn)出了一定程度的構(gòu)象變化[16]。然而，構(gòu)象變化的程度取決于蛋白質(zhì)和納米顆粒的化學(xué)與結(jié)構(gòu)特征。具體表現(xiàn)為：具有較強內(nèi)部穩(wěn)定性(如鹽橋或二硫鍵[17])的蛋白質(zhì)在吸附過程中通常會發(fā)生較小的構(gòu)象變化，相反，帶電或疏水的納米顆粒比親水性的納米顆粒更能改變吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象。有研究探討了牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)與石墨烯碳基修飾的單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWNTs)之間的相互作用[18]。結(jié)果顯示，BSA蛋白冠作為一個弱受體，可以促進電荷在SWNTs結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)移；但是由于SWNTs尖銳和分立的電子態(tài)密度，電荷轉(zhuǎn)移只發(fā)生在SWNTs，卻不發(fā)生在石墨烯中。而且，BSA二級結(jié)構(gòu)中外α螺旋的弛豫隨電荷的轉(zhuǎn)移而增加[19]。蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變通常是不可逆的，包括在解吸之后。例如，人轉(zhuǎn)鐵蛋白暴露于超順磁氧化鐵納米顆粒后，鐵的釋放改變了該蛋白的主要功能，但磁性納米顆粒去除后，原蛋白的構(gòu)象并沒有恢復(fù)，轉(zhuǎn)鐵蛋白的構(gòu)象已經(jīng)從緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)殚_放結(jié)構(gòu)，發(fā)生了不可逆的變化[18]。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用可以調(diào)節(jié)這些結(jié)構(gòu)的變化，而且它們也可以導(dǎo)致已吸附的蛋白質(zhì)被親和力更強的蛋白質(zhì)所取代。此外，蛋白質(zhì)吸附會增強納米顆粒之間的相互作用，使其產(chǎn)生團聚，團聚物的形成會對納米藥物的有效性產(chǎn)生不利影響[13]。在復(fù)雜生理環(huán)境中，蛋白冠的形成涉及到許多蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)-納米顆粒和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用。每一種相互作用都有其特有的結(jié)合能。有一種流行的假設(shè)是，硬蛋白冠直接與納米材料表面相互作用，而軟蛋白冠通過弱蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)與硬冠蛋白之間相互作用。另一種假設(shè)是硬冠和軟冠中的蛋白質(zhì)都可以與具有不同結(jié)合能的納米顆粒表面直接相互作用。然而，目前幾乎沒有實驗證據(jù)來區(qū)分以上2種假設(shè)[14]。

1.2 蛋白質(zhì)的吸附動力學(xué)

研究表明，蛋白冠的特性及其相對豐度在本質(zhì)上是動態(tài)變化的[20]。對于特定類型的納米顆粒，蛋白冠的動態(tài)特征主要受以下因素影響：(1)不同蛋白質(zhì)吸附在納米顆粒表面的親和力和平衡常數(shù)的差異非常大，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的停留時間不同；(2)納米顆粒-蛋白質(zhì)結(jié)合/解離常數(shù)的變化；(3)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)種類的差異?？偟膩碚f，蛋白冠的形成是蛋白質(zhì)在納米顆粒表面上連續(xù)吸附和解吸平衡的動態(tài)過程，其中的結(jié)合常數(shù)(kon)和離解常數(shù)(koff)所描述的動力學(xué)過程很重要(圖1)。kon的值取決于蛋白質(zhì)與納米顆粒的接觸頻率，koff的值取決于蛋白質(zhì)與納米顆粒復(fù)合物的結(jié)合能。kon和koff這2個常數(shù)之間的平衡決定了蛋白質(zhì)與納米顆粒的親和力，并將其定義為解離常數(shù)(Kd)。目前，通過表面等離子體共振(SPR)或石英晶體微天平(QCM)等技術(shù)，根據(jù)Langmuir吸附等溫線或Scatchard方程，可以得到實時的定量吸附曲線，并掌握蛋白冠形成的Kd。例如，血清蛋白在納米顆粒上吸附的Kd大約在10-4～10-9mol·L-1之間，與抗體-抗原之間相互作用的Kd范圍相似[21]。

吸附動力學(xué)與時間有關(guān)，其速率與蛋白質(zhì)濃度和Kd有關(guān)。然而，當介質(zhì)是生理溶液時，在復(fù)雜混合物中測量每個蛋白質(zhì)的kon和koff來估算Kd值的方法仍有難度。作為替代方法，可以用雙指數(shù)函數(shù)來建模[22]。這個模型將蛋白質(zhì)吸附和解吸分為“快”和“慢”2個部分，每一部分都有自己的“有效”kon和koff(圖1)。吸附和解吸的快和慢組分分別代表硬冠和軟冠。文獻資料顯示，在血漿蛋白吸附到N-異丙基丙烯酰胺/N-叔丁基丙烯酰胺共聚物納米顆粒過程中，快組分(硬冠)在幾秒鐘內(nèi)形成，而慢組分(軟冠)則在幾分鐘到幾小時的時間范圍內(nèi)才形成，其解吸行為都比較相似，快組分(軟冠)的平均壽命約為10 min，慢組分(硬冠)的平均壽命約為8 h[23]。類似的動力學(xué)行為也適用于血漿蛋白在其他納米顆粒表面的吸附。綜上，軟蛋白冠和硬蛋白冠的概念模型及介導(dǎo)蛋白冠形成的物理化學(xué)相互作用如圖1所示。

圖1 軟蛋白冠和硬蛋白冠的概念模型及介導(dǎo)蛋白冠形成的物理化學(xué)相互作用Fig. 1 Conceptual model of soft and hard protein corona and physicochemical interactions that mediate protein corona formation

1.3 蛋白冠形成的影響因素

1.3.1 納米顆粒的物理化學(xué)屬性

各種各樣的納米顆粒由許多不同的材料合成，具有不同的界面性質(zhì)，這些性質(zhì)影響納米顆粒與生物分子的相互作用[13]。針對蛋白質(zhì)與不同材料納米顆粒之間相互作用的研究已經(jīng)開展較多，證實了表面自由能、顆粒形貌、尺寸、電荷和疏水性等因素對蛋白質(zhì)吸附過程的影響[24]。

蛋白質(zhì)在納米顆粒表面吸附的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)很大程度取決于納米顆粒的尺寸和形貌。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在與納米顆粒結(jié)合過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)變化，其構(gòu)象變化在顆粒尺寸較大的情況下顯得更為明顯[25]。此外，納米顆粒的形態(tài)轉(zhuǎn)化，如氧化、硫化、還原和溶解等非生物或生物轉(zhuǎn)化過程，能夠劇烈影響納米顆粒的表面形貌，甚至實現(xiàn)對顆粒表面的修飾這些變化均能影響納米顆粒表面的蛋白冠形成與動態(tài)變化。

蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的相互作用受納米顆粒的表面特性影響。無機納米顆粒多為小晶體，其表面性質(zhì)取決于暴露的晶面、邊緣和漩渦等，表面缺陷的存在會導(dǎo)致納米顆粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而容易發(fā)生重構(gòu)。因此，結(jié)晶型納米顆粒表面通常有配體修飾，如羧基、胺或其他基團，使其具有化學(xué)和膠體穩(wěn)定性。研究表明納米顆粒的表面修飾能夠影響蛋白冠的形成：聚丙烯酸酯聚合物修飾的TiO2納米顆粒主要借助表面羧基和氨基酸羥基的酯化作用，通過該共價鍵形成蛋白冠。與此同時，TiO2表面修飾的羧基和蛋白質(zhì)正電荷也可通過靜電作用形成蛋白冠。而對于聚乙烯吡咯烷酮表面修飾的TiO2，其表面為電中性，因此其主要借助氨基酸與聚乙烯吡咯烷酮之間的氫鍵和范德華力吸附氨基酸形成蛋白冠[26]。

聚合物納米顆粒是一類具有高度通用性的納米材料，具有出色的生物相容性，在臨床醫(yī)療方面表現(xiàn)出優(yōu)良性能[27-28]。它們由疏水的core-forming聚合物和shell-forming聚合物(一般為帶電或親水的)組成，可被靶向或蛋白排斥基團功能化。針對血清蛋白與功能化聚合物納米顆粒的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，帶正電的氨基-納米顆粒通過靜電相互作用，對血清蛋白表現(xiàn)出增強的吸附作用，形成由多種蛋白質(zhì)成分組成的硬蛋白冠。但是親脂性物質(zhì)不斷從疏水納米顆粒中濾出，所以蛋白質(zhì)在顆粒表面的吸附明顯改變了納米顆粒的穩(wěn)定性，嚴重損害了納米顆粒的完整性。這些結(jié)果強調(diào)了表面修飾對聚合物納米顆粒形成蛋白冠的影響不容忽視，尤其在納米醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，蛋白分子的吸附可能會改變膠體藥物傳遞系統(tǒng)的完整性和時效性，進而削弱其性能[29]。所以，在納米尺度上對納米顆粒的物理化學(xué)屬性進行精確的表征對進一步推進蛋白冠研究至關(guān)重要。

1.3.2 蛋白質(zhì)的性質(zhì)

蛋白質(zhì)是由20種不同氨基酸組成的線性聚合物鏈，在適當條件下(通常是自發(fā)地)折疊成特定的具有生物活性的3D結(jié)構(gòu)，其存在很大的內(nèi)在結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使得蛋白質(zhì)具有不同的生物功能。蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性不高，數(shù)千個原子組成的小蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性只相當于幾個氫鍵[30]。而且，蛋白質(zhì)之間的熱力學(xué)穩(wěn)定性可能存在很大差異，從而影響它們在納米顆粒表面上的結(jié)構(gòu)響應(yīng)[31]。

納米顆粒暴露在生物環(huán)境中，傾向于和蛋白質(zhì)分子相互作用，形成蛋白冠。蛋白冠賦予納米顆粒獨特的生物學(xué)特性，其蛋白質(zhì)組成對納米顆粒的生物學(xué)命運起決定性作用。蛋白質(zhì)的生理行為源于其物理化學(xué)性質(zhì)，包括表面電荷、疏水性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等。有研究假設(shè)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)會影響它們與納米顆粒的相互作用，并對納米顆粒與細胞的相互作用具有決定性的影響[32]。Dhar等[33]使用不同結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)模型來研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對納米顆粒-蛋白質(zhì)界面的影響。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)的表面電荷決定了納米顆粒-蛋白質(zhì)之間一次相互作用的性質(zhì)和二次相互作用的程度，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，同時，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量對納米顆粒-蛋白質(zhì)界面的二級相互作用程度和納米蛋白復(fù)合物的分散狀態(tài)都存在顯著影響。顯然，蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性在蛋白冠形成過程中對納米顆粒-生物界面的調(diào)節(jié)起著重要作用。

1.3.3 介質(zhì)條件

蛋白質(zhì)和納米顆粒的相互作用受介質(zhì)環(huán)境的各種因素影響，如溫度、pH、鹽度和流動性等。環(huán)境pH值的變化會改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)從而影響蛋白質(zhì)與納米顆粒的結(jié)合。針對生物偶聯(lián)物在寬泛pH范圍的緩沖水溶液中的行為研究發(fā)現(xiàn)，生物偶聯(lián)物在中性和堿性溶液中是穩(wěn)定的，其在pH低于蛋白質(zhì)等電點時發(fā)生聚集，且蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)在顆粒穩(wěn)定的條件下保持不變；但當生物偶聯(lián)物聚集時，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了一些微小變化[34]。該結(jié)果表明，保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與納米顆粒相互作用的重要性，以驅(qū)動生物偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。有研究表明，輕微的溫度變化，如人類體溫隨晝夜更替的改變，會影響蛋白質(zhì)的親和力和蛋白質(zhì)-納米顆粒復(fù)合物的細胞攝取或毒性[35]。動態(tài)條件下血漿蛋白質(zhì)吸附及表面誘發(fā)血栓的研究表明，在靜態(tài)和流動條件下，聚N,N-二甲基丙烯酰胺(poly N,N-dimethylacrylamide,PDMA)修飾表面對血漿蛋白的吸附以及對血小板粘附程度均低于其他表面修飾，而且吸附蛋白冠的分布與測試條件(靜態(tài)或流動)以及聚合物表面修飾的化學(xué)特性有很強的相關(guān)性[36]。近期，有研究者考察了pH和鹽度對肌紅蛋白在二氧化硅納米顆粒上形成蛋白冠的影響[37]。結(jié)合吸附結(jié)果和肌紅蛋白的表面靜電映射，證實了在低鹽濃度下能形成單層硬蛋白冠，當鹽不斷加入后單層硬冠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄬拥挠补诤蛙浌?。進一步機理研究顯示，蛋白質(zhì)吸附行為隨pH和鹽度增加的變化主要歸因于靜電相互作用和表面電荷調(diào)節(jié)效應(yīng)的改變。所以，介質(zhì)條件對蛋白冠形成的影響研究有助于揭示蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的吸附機理。

2 蛋白冠的組成和結(jié)構(gòu)分析(Characterization of protein corona composition and structure)

蛋白冠的組成和結(jié)構(gòu)分析主要包括厚度和密度、特性和數(shù)量、排列和取向、構(gòu)象及親和力等重要參數(shù)。其中，蛋白冠的厚度和密度決定了納米-蛋白復(fù)合物的總體尺寸和優(yōu)先暴露的表面；吸附在納米顆粒表面的蛋白質(zhì)的特性和數(shù)量決定了一系列可能發(fā)生的生化反應(yīng)及其反應(yīng)強度；蛋白冠排列和取向則影響了潛在的結(jié)合域和催化域；而蛋白冠構(gòu)象影響蛋白質(zhì)的活性及其與其他生物分子的相互作用[14]。

顯然，蛋白冠組成和結(jié)構(gòu)的分析表征對于深入研究蛋白冠形成機理及預(yù)測其后續(xù)行為特征十分重要?，F(xiàn)有分析技術(shù)大致可分為兩大類：原位和非原位檢測技術(shù)。原位測量是一種具有挑戰(zhàn)性的分析蛋白冠的方法，因為分析過程中無需與周圍介質(zhì)分離，所以不影響蛋白冠的成分和動態(tài)平衡。當?shù)鞍坠谔幱谔囟ㄉ項l件下時，原位檢測技術(shù)能更直接地分析表征出蛋白冠的實時動態(tài)信息。然而，由于分析技術(shù)的瓶頸，通過原位測量獲得的信息量仍然是有限的。所以大多數(shù)研究依然通過非原位檢測技術(shù)，將蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物與未結(jié)合的游離蛋白質(zhì)分離，進而開展分析表征。

2.1 蛋白冠的原位檢測技術(shù)

原位檢測可以直接在介質(zhì)中分析吸附在納米顆粒表面的蛋白冠，從而不影響蛋白冠的成分，反映出蛋白冠最自然的狀態(tài)。但是介質(zhì)中除了與納米顆粒結(jié)合的蛋白冠外，還存在游離的蛋白質(zhì)，可能干擾分析的準確性，成為蛋白冠原位分析技術(shù)發(fā)展的瓶頸。例如，動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)可以確定樣品的表觀擴散系數(shù)，通過斯托克斯-愛因斯坦方程能計算出顆粒物水合半徑[38]，也可以通過測量時間-粒徑分布的關(guān)系反映蛋白冠穩(wěn)定性。與DLS類似，熒光相關(guān)光譜法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)可以在亞納米精度下，通過蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)計算顆粒物水合半徑，借此實現(xiàn)蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物尺寸的原位分析，用于表征蛋白冠尺寸[39-40]。與DLS相比，F(xiàn)CS只檢測熒光標記物，介質(zhì)中其他成分不會干擾熒光信號，因此不需要分離游離的蛋白質(zhì)。但FCS的缺點也非常明顯，其需要使用熒光標記的納米顆粒和蛋白質(zhì)，而引入標記可能會引發(fā)系統(tǒng)本身發(fā)生變化，從而影響蛋白冠表征結(jié)果[41]。此外，蛋白質(zhì)吸附在納米顆粒表面通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光猝滅，因此借助熒光猝滅法(fluorescence quenching,FQ)可以分析蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的相互作用[42]。

目前，流式細胞技術(shù)結(jié)合熒光標記抗體是一種原位檢測蛋白冠的中特定蛋白成分的新興技術(shù)[43]。通常，納米顆粒吸附蛋白質(zhì)后由于質(zhì)量的增加，其布朗運動也會減慢，因此可以通過納米顆粒跟蹤分析法(nanoparticle tracking analysis,NTA)測量蛋白冠尺寸的動態(tài)變化[44]。最近通過對納米顆粒標記同位素，借助核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance,NMR)測量顆粒物擴散系數(shù)，經(jīng)由顆粒物水合半徑的增加來量化納米顆粒表面吸附形成的蛋白冠，從而實現(xiàn)原位表征蛋白冠，因該方法不基于光學(xué)技術(shù)，所以可以在富含細胞等渾濁的生物體液中原位分析蛋白冠[45-47]。

2.2 蛋白冠的異位檢測技術(shù)

2.2.1 蛋白冠分離

一般來說，分離會改變吸附蛋白質(zhì)和游離蛋白質(zhì)之間的平衡，因此所有分離技術(shù)都會對蛋白冠的組成和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。在大多數(shù)分離過程中，軟蛋白冠將被去除，所以對其組成、結(jié)合方式和生物相關(guān)性知之甚少。目前，經(jīng)過分離、洗滌步驟后，仍吸附在納米顆粒上的蛋白質(zhì)在分析表征時被定義為硬蛋白冠。由于存在許多分離游離蛋白質(zhì)的方法，因此，在對硬冠和軟冠的研究中精確定義硬-軟冠邊界以及2層之間的區(qū)別存在巨大的挑戰(zhàn)[48]。有研究表明，有些蛋白質(zhì)無法用常規(guī)方法從納米顆粒表面分離，因此部分硬蛋白冠很難被全面分析。甚至有研究把這些特別緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)稱為“界面蛋白冠”[49]。

離心是將帶有蛋白冠的納米顆粒與周圍介質(zhì)分離的最常用方法，其原理是將納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物顆粒化，從而分離未結(jié)合的蛋白質(zhì)。僅僅通過第一次離心，結(jié)合松散的蛋白質(zhì)很可能仍附著在納米顆粒表面，所以樣品在相應(yīng)的緩沖液中需要經(jīng)歷多次洗滌。通過多次洗滌步驟，蛋白冠的平衡會重新調(diào)整，結(jié)合松散的蛋白質(zhì)在進行分析之前會被完全去除。迄今為止，離心可能是分離強結(jié)合蛋白質(zhì)最成熟的方法[5]。如果樣品在離心過程中穩(wěn)定，只需要通過樣品與周圍介質(zhì)的密度差異就可以分離，但在離心的過程中蛋白冠與介質(zhì)的接觸面積會因為納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉積團聚而減少，為了避免這種情況，也可以在添加蔗糖墊的條件下進行離心[50-51]，這樣可避免樣品和介質(zhì)之間的不確定接觸。離心分離的操作必須非常小心，因為高豐度的蛋白質(zhì)聚集體很容易與納米載體-蛋白質(zhì)復(fù)合物一起沉淀，可能會被誤認為是蛋白冠的一部分。磁性分離是另一種分離蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物的有效方法，但其僅適用于有磁性的納米顆粒[52-55]?；镜姆蛛x過程是通過磁鐵靠近樣品，把納米顆粒集中在磁鐵附近，從而去除上清液。通過在緩沖液中重新懸浮，重復(fù)該操作過程來洗滌樣品。離心和磁分離這2種方法有一定的相似之處，它們都依賴于重復(fù)的洗滌步驟來去除多余的蛋白質(zhì)，每次清洗樣品都會達到新的平衡，因此蛋白冠很大程度被相應(yīng)的洗滌程序所影響。

除了上述2種基于密度和磁性差異的分離方法，借助流體動力學(xué)尺寸差異，也可以通過色譜法和類似色譜法的技術(shù)進行分離。其中，非對稱流場流分離技術(shù)(asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)作為一種類似色譜的技術(shù)，通過流體與外場的共同作用，利用樣品擴散系數(shù)的差異以實現(xiàn)分離。AF4沒有固定相，是一種非常溫和的分離技術(shù)，適用于分離蛋白質(zhì)聚集體和蛋白質(zhì)-納米顆粒復(fù)合物等樣品[11,56-58]。目前，也存在另一種類似色譜的技術(shù)即流體動力色譜(hydrodynamic chromatography,HDC)用于蛋白冠分離，其工作原理與AF4相似，根據(jù)流體動力學(xué)尺寸分離樣品。在毛細管或填充柱內(nèi)，通過壓力驅(qū)動以拋物面流型前進，由于大分子的排斥效應(yīng)大于小分子，因此它們將更快地移動并優(yōu)先洗脫[59-60]。尺寸排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)也是分析領(lǐng)域常用的分離技術(shù)，這項技術(shù)根據(jù)樣品的流體動力學(xué)尺寸分離樣品[61-63]。這種方法的缺點是樣品和色譜柱填料之間存在剪切應(yīng)力，這不僅會增加流速，而且可能去除某些結(jié)合松散的蛋白質(zhì)，從而改變蛋白冠的組成[3]。上述3種方法均基于流體動力學(xué)尺寸差異進行分離。還有一種分離技術(shù)即毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)，其原理則是基于電荷比的大小，通過電場使樣品電泳從而進行分離，是蛋白冠分離領(lǐng)域的一項有前景的技術(shù)，分離后的復(fù)合物用于進一步分析[64-67]。與AF4和HDC相同，CE不存在固定相，是一種相對溫和的分離技術(shù)。

2.2.2 直接檢測技術(shù)

研究表明，借助透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)可以直接觀察到吸附在納米顆粒表面的蛋白冠[68-69]，從而驗證蛋白冠存在與否，但該方法不能實現(xiàn)定量分析。如果需要對吸附蛋白量進行定量分析，則可利用標準生化蛋白實現(xiàn)定量測定，比如考馬斯亮藍(Bradford)法[70-71]或二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法[72-74]。為進一步研究蛋白冠組成，蛋白質(zhì)通常需要從純化后的蛋白質(zhì)-納米顆粒復(fù)合物中分離解吸。目前，分離手段主要根據(jù)蛋白冠和納米顆粒表面互相作用的強度進行選擇，通常采用高溫、高鹽、去污劑或蛋白酶等方法。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)通過將蛋白質(zhì)凝膠圖與已知標準物質(zhì)比對，以此獲得蛋白冠組成[75-78]。SDS-PAGE具有使用廣泛、價格低廉和操作簡單等優(yōu)點，但也存在通量低、靈敏度低和偽影等缺點。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)比SDS-PAGE具有更高的通量、準確度和靈敏度，可以實現(xiàn)對蛋白冠組成成分的定量分析，其與SDS-PAGE串聯(lián)使用可同時實現(xiàn)蛋白冠的定性和定量分析[79-81]。近期研究發(fā)現(xiàn)，使用SDS-PAGE切割條帶消解后聯(lián)用LC-MS/MS的分析方法也存在一定缺陷，主要表現(xiàn)在顏色弱或基本沒顏色的蛋白質(zhì)凝膠條帶容易被忽視，而這其中可能包含著一些具有重要生理功能的蛋白[82]。此外，該方法也無法提供蛋白冠的蛋白結(jié)構(gòu)信息。傅里葉紅外光譜法(Fourier transformed infrared spectrometry,FT-IR)和圓二色譜(circular dichroism,CD)是比較常見的測量蛋白冠構(gòu)象的分析技術(shù)。FT-IR對與酰胺鍵對應(yīng)的振動帶位移和形狀變化非常敏感，可以觀察到蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化，能夠測量硫蛋白冠與納米顆粒結(jié)合隨時間的變化趨勢[17]。CD能夠確定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化[83]。表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering,SERS)可以提供金屬納米顆粒表面附近分子的結(jié)構(gòu)、組成和相互作用信息，從而實現(xiàn)對蛋白冠的表征[84]。此外，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)[85]和FQ[86]也可以檢測蛋白冠的結(jié)構(gòu)變化。

2.2.3 間接檢測技術(shù)

間接檢測技術(shù)通過測量蛋白冠-納米顆粒的特性變化來分析蛋白冠，例如尺寸大小、電荷、密度、質(zhì)量、吸光度和熒光等特性。通常，異位檢測技術(shù)有凝膠電泳(gel electrophoresis,GE)和差示離心沉降法(differential centrifugal sedimentation,DCS)，它們通過矩陣中蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物的移動來推斷其尺寸大小。GE主要借助外加電場實現(xiàn)帶電顆粒物在凝膠孔中遷移。當?shù)鞍坠诖嬖跁r，由于尺寸增加，蛋白冠-納米顆粒在凝膠上遷移速度減緩，導(dǎo)致顆粒物遷移速率根據(jù)尺寸/電荷比的不同而不同[87]。此外，通過重力或壓力驅(qū)動的凝膠孔(如SEC)，可以對不同尺寸的蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物進行分離。對于DCS，沉降時間是納米顆粒大小和密度的函數(shù)，基于納米顆粒的平均密度，可以確定顆粒物的水合粒徑[88-89]。所以DCS已在蛋白冠尺寸檢測中被廣泛應(yīng)用，但該技術(shù)的蛋白冠厚度的測量值通常偏低。

激光多普勒測速法(laser Doppler anemometry,LDA)和可調(diào)諧電阻脈沖傳感技術(shù)(tunable resistive pulse sensing,TRPS)可檢測顆粒物表面電荷的變化。LDA通過激光照射納米顆粒，使其向相反電荷的電極遷移，根據(jù)遷移速率檢測ζ電位，而蛋白冠會改變ζ電位，且其受納米顆粒初始電荷、蛋白質(zhì)特性和介質(zhì)pH值等因素影響[90]。ζ電位也可通過TRPS測量。TRPS是一種用于表征緩沖液、血清和血漿中ζ電位的簡單且快速的檢測方法，可檢測顆粒表面蛋白質(zhì)的變化、大小和分布等[91-92]。金屬納米顆粒在紫外-可見-近紅外光譜范圍內(nèi)具有局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)特征，納米顆粒表面蛋白冠的形成通常會導(dǎo)致等離子體峰的紅移和變寬，因此紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜被應(yīng)用于表征等離子體納米顆粒上蛋白冠的吸附。研究顯示，LSPR頻率對納米顆粒周圍環(huán)境的微小變化非常敏感[93-94]。利用UV-Vis光譜檢測可以雜化納米顆粒等離子體消光的變化，同時表征蛋白冠的關(guān)鍵參數(shù)厚度和折射率[95]。如所測納米顆粒不是等離子體，也可與表面等離子體共振(surface plasmon resonant,SPR)裝置結(jié)合進行檢測，該技術(shù)通過SPR峰角位置的變化來檢測蛋白質(zhì)與納米顆粒的結(jié)合[96]。

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance,QCM)和懸浮微通道諧振器(suspended microchannel resonator,SMR)能夠測量蛋白冠形成所引起的質(zhì)量變化，都具有很高的靈敏度。其中，QCM需要將納米顆粒固定在石英表面，記錄蛋白冠形成的質(zhì)量，實現(xiàn)對蛋白冠的定量分析[97]，而SMR則測量諧振腔內(nèi)微通道的納米顆粒懸液質(zhì)量[98]。此外，等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)能測量納米溶液在注射蛋白質(zhì)后熱量隨時間的變化，積分后構(gòu)建熱量與蛋白冠-納米顆粒復(fù)合物的摩爾比相關(guān)函數(shù)，以確定蛋白冠形成的熱力學(xué)參數(shù)，如親和常數(shù)和結(jié)合化學(xué)計量數(shù)等信息，以此作為一種補充方法，加深我們對蛋白冠-納米顆粒復(fù)合機制的理解[99]。綜上，蛋白冠結(jié)構(gòu)和組成的表征技術(shù)的總結(jié)如表1所示。

表1 蛋白冠的結(jié)構(gòu)和組成表征技術(shù)Table 1 Techniques to examine the structure and composition of protein corona

2.3 蛋白冠的指紋特征

指紋特征通常是指借助一定的分析手段，得到可以標記蛋白冠組成特征的指標，以顯示不同蛋白冠之間的差異，從而區(qū)分不同蛋白冠。通過對指紋特征的數(shù)據(jù)進行提取和分析，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，獲得其隱含的潛在信息。目前，用于指紋特征研究的數(shù)據(jù)處理方法主要有聚類分析法、主成分分析法和相似度分析法等。

蛋白冠分子指紋的精確鑒定一般使用MS和SERS等非靶向分析技術(shù)，如通過化學(xué)和酶處理形成肽片段，然后使用SDS-PAGE、二維色譜或蛋白質(zhì)電泳聯(lián)用MS等對蛋白質(zhì)進行分離和鑒定。MS能夠進行無標記檢測，具有高通量和高靈敏度等優(yōu)點。已有研究大多關(guān)注聚乙二醇化多壁碳納米管上蛋白冠的蛋白質(zhì)指紋圖譜，基本都使用天然和變性緩沖液在不同條件下依次洗脫血漿蛋白，再采用SDS-PAGE、2D-PAGE分離和MS對蛋白冠進行蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜分析，分析鑒定出軟冠中參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的蛋白組分，以及硬冠中維持宿主穩(wěn)態(tài)的作用生物分子[100-101]。有研究利用SDS-PAGE和MS對磁赤鐵礦納米顆粒(surface active maghemite nanoparticles,SAMNs)表面選擇性吸附形成的蛋白冠進行分析和定量，發(fā)現(xiàn)SAMNs能夠選擇性吸附FALPQYLK序列的alpha(s2)-酪蛋白片段，該片段是casocidin-1肽的一部分，具有很強的抗菌活性[102]。

近期有研究者針對Gd@C82(OH)22納米顆粒分別在健康人血漿和肺癌源性血漿孵育后形成的蛋白冠進行特征分析，發(fā)現(xiàn)健康人體血漿和癌癥病人血漿中形成的蛋白冠在蛋白質(zhì)組成和數(shù)量上都存在顯著差異，表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)組指紋特征，表明蛋白冠指紋在醫(yī)學(xué)診斷方面存在潛在的應(yīng)用前景[103]。此外，利用三維SERS基底檢測生物和醫(yī)學(xué)樣品的生物分析是近年來的熱點[104]。有研究使用SERS得到多孔納米結(jié)構(gòu)與特定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)產(chǎn)物的相互作用后形成的指紋圖譜[105]。多孔Ag-Si材料SERS底物在復(fù)雜基質(zhì)中的靈敏度即使與其他先進檢測技術(shù)相比也具有足夠的優(yōu)勢(在尿、牛奶和血漿中分別為0.07、0.47和0.50 mU·mL-1)，顯示了基于SERS分析的蛋白冠指紋特征在病理早期診斷方面的應(yīng)用潛能。顯然，對蛋白冠指紋特征的深入理解和知識儲備可以為納米顆粒的設(shè)計開辟一種新的方法，即新型納米材料的創(chuàng)造性生產(chǎn)可以從識別蛋白冠的基本指紋模式和構(gòu)象開始，以實現(xiàn)預(yù)期的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

3 蛋白冠的生物效應(yīng)(Bioeffect of protein corona)

蛋白冠的形成降低了納米顆粒的表面能，賦予了納米顆粒新的生物特性。蛋白冠在納米顆粒的細胞攝入和生物分布過程中發(fā)揮重要作用，能影響納米顆粒的生物有效性、相容性和毒性[106-107]。

3.1 減緩納米顆粒的生物毒性

迄今，已有許多研究證實蛋白冠的包覆能減緩納米顆粒的生物毒性。比如，氧化石墨烯在1%胎牛血清中孵育時，其對人體細胞具有明顯的毒害作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性的細胞毒性；但當氧化石墨烯在10%胎牛血清中孵育時，其對人體細胞的毒性顯著降低[108]。機理研究證實氧化石墨烯的細胞毒性主要源于細胞膜和氧化石墨烯納米片之間的直接相互作用，導(dǎo)致細胞膜的物理損傷。當氧化石墨烯在較高濃度的胎牛血清中孵育時，由于氧化石墨烯具有極高的蛋白質(zhì)吸附能力，使得其表面形成蛋白冠，阻斷了氧化石墨烯與細胞膜的直接接觸(圖2)，從而降低對細胞膜的損傷?？梢?，蛋白冠能夠通過阻斷納米顆粒與細胞膜的接觸或滲透，得以減緩納米顆粒的生物毒性[109]。

此外，研究表明蛋白冠也可以降低細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生(圖2)。研究人員利用食源性納米顆粒(food-borne nanoparticles,FNPs)作為模式納米顆粒，通過人血清白蛋白孵育使納米顆粒表面形成蛋白冠，發(fā)現(xiàn)蛋白冠緩解了FNPs誘導(dǎo)的HepG-2和正常大鼠腎(normal rat kidney,NRK)細胞中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛和過氧化氫酶等氧化應(yīng)激，證實了蛋白冠能降低FNPs引起的HepG-2和NRK細胞的線粒體膜電位和ROS的產(chǎn)生量，進而減緩FNPs的細胞毒性[110]。蛋白冠還可以通過減少細胞對納米顆粒的吸收來減緩細胞毒性。比如，銀納米顆粒吸附血清蛋白形成蛋白冠，可顯著降低小鼠胚胎成纖維細胞對銀納米顆粒的攝入，減緩其細胞毒性[111]。

3.2 增強納米顆粒的生物毒性

研究表明，單壁碳納米管可引發(fā)細胞增殖率降低、加快細胞衰老和死亡等毒性作用，當單壁碳納米管表面形成硬蛋白冠后，其長期毒性增強[112]。進一步機理研究顯示，碳納米管表面形成的硬冠包含調(diào)節(jié)蛋白，能夠抑制細胞的增殖。也有研究表明，在磁場作用下超順磁鐵氧化物納米顆粒(superparamagnetic iron oxides,SPIOs)表面形成的蛋白冠會導(dǎo)致細胞攝入更大量的納米顆粒，引起細胞毒性增強[113]。SPIOs的細胞毒性機制一般與攝取量和ROS含量有關(guān)[114]，研究顯示蛋白冠中載體蛋白含量的增加導(dǎo)致細胞對SPIOs攝取量的增加，進而引起細胞內(nèi)ROS含量增加(圖2)。然而，當猝滅細胞體系中的ROS后，細胞活性并沒有顯著提高，表明ROS水平的增加與觀察到的細胞活性降低并無直接關(guān)系，可能還存在其他由SPIOs攝入量增加導(dǎo)致細胞毒性增強的替代機制。綜上，蛋白冠的“雙刃劍”生物效應(yīng)的示例及潛在作用機制示意圖如圖2所示。

圖2 蛋白冠的“雙刃劍”生物效應(yīng)注：(a)和(b)分別代表蛋白冠形成前后不同納米顆粒對于人表皮角質(zhì)形成細胞的細胞膜和細胞質(zhì)毒性，數(shù)據(jù)總結(jié)自Monteiro-Riviere等[115]的工作；其中1、2、3和4代表不同類型納米顆粒，1代表20 nm檸檬酸銀，2代表110 nm檸檬酸銀，3代表20 nm二氧化硅修飾的銀顆粒，4代表120 nm二氧化硅修飾的銀顆粒；(c) 蛋白冠影響納米顆粒引起的細胞毒性強弱的機制[110]。Fig.2 The “double-edged sword”effect of protein coronasNote:(a) and (b) respectively represent the membranal and cytoplasmic toxicity of different nanoparticles to human epidermal keratinocyte before and after the formation of protein coronas;the data are collected from previous study[115];1,2,3 and 4 represent different types of nanoparticles,1 represents 20 nm citrate silver,2 represents 110 nm citrate silver,3 represents 20 nm silica-coated silver,and 4 represents 120 nm silica-coated silver;(c) mechanism of protein coronas affecting the cytotoxicity induced by nanoparticles[110].

3.3 蛋白冠的潛在醫(yī)藥應(yīng)用

納米給藥系統(tǒng)在疾病靶向治療方面具有強大的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)藥物相比，納米給藥系統(tǒng)可增加藥物的溶解度和生物相容性，減少游離藥物的脫靶副作用。然而納米給藥系統(tǒng)仍存在一些缺點，包括納米顆粒的低效率傳遞和潛在的長期毒性，這些都制約了其在臨床的應(yīng)用。近些年研究發(fā)現(xiàn)蛋白冠的持久性和動力學(xué)特性可能具有醫(yī)藥應(yīng)用價值[116]。比如，內(nèi)吞體和溶酶體的酸性和酶促環(huán)境可能在體內(nèi)外調(diào)節(jié)蛋白冠，通過合成對pH和溫度敏感的“智能”聚合物或包含隱形部分的共聚物或具有多層聚合物的納米顆粒，可能有利于控制藥物釋放[117-118]。蛋白冠也可以通過自組裝來裝載藥物[119]。比如，通過改變生理微環(huán)境的局部pH值和離子強度可以使聚合物具有特定的剛性，而線狀或拉絲狀聚合物與球狀蛋白質(zhì)之間的相互作用也可能會影響結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白冠的物理化學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)的動態(tài)調(diào)節(jié)有助于調(diào)控蛋白冠修飾的納米給藥系統(tǒng)，減少靶向藥物的受損，以實現(xiàn)生物體內(nèi)靶向藥物在到達目標之前的穩(wěn)定性以及后續(xù)的藥物緩釋。因此，開發(fā)新型納米顆粒結(jié)構(gòu)，吸附特定的內(nèi)源性生物分子到納米顆粒表面形成蛋白冠，從而提高靶向性和藥物傳遞仍然將是醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域的重要研究課題。

4 結(jié)論及展望(Summary and perspective)

綜上所述，本文重點對蛋白冠的形成機理、蛋白冠組成及結(jié)構(gòu)的分析表征和蛋白冠的生物效應(yīng)進行了歸納總結(jié)。目前，針對蛋白冠的研究非常寬泛，從軟-硬蛋白冠的分析，到納米顆粒物理化學(xué)特性對蛋白冠結(jié)構(gòu)組成的影響，從蛋白冠影響納米顆粒生物效應(yīng)的分子機制，到蛋白冠納米靶向載藥體系的設(shè)計與應(yīng)用，都顯示了蛋白冠對納米顆粒歸趨和功能的重要作用。盡管在以上方面取得了一些進展，但對蛋白冠與顆粒物介導(dǎo)的生理疾病之間是否存在潛在的關(guān)系尚不清楚，尤其是納米顆粒急性毒性階段的蛋白冠組成動態(tài)變化與代謝通路相關(guān)蛋白的瞬時失穩(wěn)是否存在相互關(guān)系。如果無法填補這些知識空缺，就很難深入地了解納米顆粒的健康風(fēng)險，以及創(chuàng)新性地設(shè)計出新型納米靶向載藥系統(tǒng)以實現(xiàn)精準醫(yī)療。此外，基于現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)，建立健全相對完善的蛋白冠指紋特征數(shù)據(jù)庫和模型，嘗試開展更多與蛋白代謝相關(guān)的代謝冠研究，預(yù)測納米顆粒的生物學(xué)效應(yīng)，并嘗試服務(wù)于臨床病例診斷。