李變娥 孫小雪 李凌緒 羅小勇

摘要：為了進(jìn)一步明確玉米秸稈中存在的化感物質(zhì)是否具有除草活性，為有效利用該秸稈防除農(nóng)田雜草并以化感活性物質(zhì)為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)植物源除草劑提供依據(jù)。以小麥、生菜為受體植物，采用生物活性追蹤法，對(duì)玉米（壽佳益）秸稈中所含有的可抑制植物生長(zhǎng)的化感活性物質(zhì)進(jìn)行提取與分離，并測(cè)定活性物質(zhì)對(duì)稗和反枝莧幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次對(duì)玉米秸稈的60%乙醇溶液提取物進(jìn)行萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物，且乙酸乙酯相對(duì)小麥和生菜幼苗生長(zhǎng)的抑制活性顯著高于其他3個(gè)萃取相。進(jìn)而對(duì)乙酸乙酯相及其高活性餾分依次進(jìn)行柱色譜分離，得到E3-2-3、E13-2-1和E13-1這3個(gè)高活性餾分。用制備色譜對(duì)3個(gè)餾分進(jìn)一步分離，得到6種純化合物，經(jīng)鑒定分別為順式對(duì)羥基肉桂酸甲酯、反式對(duì)羥基肉桂酸甲酯、順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯、反式對(duì)羥基肉桂酸乙酯、反式對(duì)羥基肉桂酸和對(duì)羥基苯甲醛。經(jīng)測(cè)定，4種對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物（順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯未測(cè)）不僅對(duì)小麥和生菜幼苗的生長(zhǎng)具有很好的抑制活性，而且對(duì)稗和反枝莧幼苗的生長(zhǎng)也表現(xiàn)出很好的抑制活性，顯示出良好的除草潛力。對(duì)羥基苯甲醛雖然也具有一定的活性，但活性明顯低于4種對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物。研究表明，所供試玉米品種秸稈的高化感活性可能與其代謝產(chǎn)生的幾種對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物及對(duì)羥基苯甲醛有關(guān)。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈;對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物;對(duì)羥基苯甲醛;化感（除草）活性;提取分離

中圖分類(lèi)號(hào)：S451 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號(hào)：1003-935X（2021）03-0051-10

Abstract：This study aimed to clarify whether the allelopathic substances in the corn straw have herbicidal activity，and to provide the evidence for effectively using the straw to control weeds in the field and using allelopathic substances as lead compounds to develop botanical herbicides. Wheat and lettuce were used as bioassay receptor plants to guide the extraction and separation of active allelopathic substances from corn （Shoujiayi） straw that are able to inhibit plant growth. Also the effect of active substances on the seedling growth of Echinochloa crusgalli （L.） Beauv. and Amaranthus retroflexus L. was determined. Petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol were used to extract the 60% ethanol solution of corn straw successively，and petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol and water phase extracts were obtained，respectively. The inhibitory activities of ethyl acetate phase on the growth of wheat and lettuce seedlings were significantly higher than those of the other three extracts. Then，the ethyl acetate phase and its high active fractions were separated successively by column chromatography，and three high active fractions，E3-2-3，E13-1 and E13-2-1，were obtained. The three fractions were further separated by preparative chromatography and six pure compounds were obtained and identified as cis methyl p-hydroxycinnamate，trans methyl p-hydroxycinnamate，cis ethyl p-hydroxycinnamate，trans ethyl p-hydroxycinnamate，trans p-hydroxycinnamic acid and p-hydroxy benzaldehyde. Four compounds of p-hydroxycinnamic acid （cis ethyl p-hydroxycinnamate was not detected） with good herbicidal potential had good inhibitory activities not only on the growth of wheat and lettuce seedlings，but also on E. crusgalli and A. retroflexus seedlings. Activity of p-hydroxybenzaldehyde was much lower than that of the four p-hydroxycinnamic acid compounds. This indicates that the high allelopathic activity of the tested corn straw might be related to the production of several p-hydroxycinnamic acid compounds and p-hydroxybenzaldehyde.

Key words：corn straw;p-hydroxycinnamic acid compounds;p-hydroxybenzaldehyde;allelopathic （herbicidal） activity;extraction and separation

玉米（Zea mays L.）是禾本科玉蜀黍?qū)俚囊荒晟参铮俏覈?guó)重要的糧食作物和飼料作物，其種植面積和總產(chǎn)量?jī)H次于水稻和小麥，秸稈資源非常豐富，年產(chǎn)量可達(dá) 2.4 億 t[1]。筆者所在課題組前期的研究結(jié)果表明，玉米秸稈具有顯著的植物化感作用，其根、莖、葉均可顯著抑制鱧腸（Eclipta prostrata L.）、反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）、馬唐[Digitaria sanguinalis （L.） Scop.]和稗[Echinochloa crusgalli （L.） Beauv.]4種雜草幼苗胚根（種子根）的生長(zhǎng)，且以莖的活性最高，當(dāng)莖粉末與土壤按照 1 ∶ 100 的比例混合處理時(shí)可有效抑制這4種雜草幼苗的生長(zhǎng)，對(duì)株高和鮮重的抑制率均達(dá)80%以上[2]。經(jīng)對(duì)17種玉米品種不同器官的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這些品種的根、莖、葉、雄花、果皮都對(duì)生菜已發(fā)芽種子胚根的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制活性，但品種間表現(xiàn)出一定的差異[3]。一些研究表明，玉米秸稈的水浸提液對(duì)小麥（Triticum aestivum L.）[4]、黃瓜（Cucumis sativus L.）[5-6]、生菜（Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.）[6]、茄子（Solanum melongena L.）[6]、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）[7-8]、桔梗[Platycodon grandiflorus （Jacq.） A. Dc.][9]、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd）[10]和部分雜草[11]等植物種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)也都具有低促高抑的作用。利用玉米秸稈在5 400 kg/hm2處理濃度下對(duì)水稻田稗、千金子[Leptochloa chinensis（Linn.） Nees]、異型莎草（Cyperus difformis L.）、水莧菜（Ammannia baccifera L.）、鴨舌草[Monochoria vaginalis （Burm.f.） C. Presl]等雜草的防除效果最高可達(dá)到100%[12]。這些研究結(jié)果表明，玉米秸稈中可能含有可抑制植物生長(zhǎng)的化感物質(zhì)，而明確這些物質(zhì)對(duì)于解釋玉米的生態(tài)效應(yīng)、更好地制定玉米秸稈還田策略以及以這些物質(zhì)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)植物源除草劑都有重要的意義。因此，本研究利用活性追蹤法對(duì)玉米秸稈中的化感活性物質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

本研究以采自山東省青島市即墨區(qū)高盛農(nóng)場(chǎng)的玉米秸稈（壽佳益）為研究材料。于玉米收獲后采集，洗凈后置于室外自然陰干，經(jīng)粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）粉碎后，存放于6 ℃低溫冷藏種子柜中，備用。

1.2 除草活性物質(zhì)的提取分離

玉米秸稈中除草活性物質(zhì)的提取分離采用生物活性追蹤法，參照Han等的方法[13]并加以改進(jìn)。

1.2.1 提取 根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)，確定用60%乙醇溶液進(jìn)行提取。將玉米秸稈粉末用60%乙醇溶液浸泡處理提取3次，每次7 d，期間每隔8 h左右攪拌1次。合并3次提取液，經(jīng)真空抽濾（2號(hào)濾紙，Whatman）及在40 ℃溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀處理，得到提取物浸膏。

1.2.2 有機(jī)溶劑萃取 取一定量的提取物浸膏，用去離子水分散后，添加至分液漏斗，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取液。每種溶劑萃取的結(jié)束時(shí)間由薄層色譜法（TLC）色譜板的檢測(cè)結(jié)果來(lái)決定，以在紫外燈下未顯示有化合物為準(zhǔn)。將3種有機(jī)溶劑的萃取液各自合并后經(jīng)真空抽濾（2號(hào)濾紙，Whatman）及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）處理，得浸膏并稱(chēng)重。其中水相萃取液在冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥后稱(chēng)重。用瓊脂法測(cè)定各萃取物的化感活性。

1.2.3 TLC檢測(cè) TLC色譜板為硅膠薄層板（GF254，0.25 mm，青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司），以不同比例的石油醚/丙酮、乙酸乙酯/丙酮或丙酮/甲醇的混合溶液作為展開(kāi)劑，通過(guò)變換展開(kāi)劑的組成以達(dá)到最佳分離效果。將薄層板置于波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈下進(jìn)行顯示，標(biāo)注斑點(diǎn)的位置。

1.2.4 柱色譜分離 選用12 cm×80 cm的色譜柱進(jìn)行分離。稱(chēng)取200～300目的硅膠3 000 g于大燒杯中，添加石油醚至浸沒(méi)硅膠，且邊加邊攪拌，以排除氣泡。將處理后的硅膠濕法裝柱后，用石油醚跑柱1 d。稱(chēng)取40 g乙酸乙酯相浸膏于 500 mL 燒杯中，用適量丙酮溶解，加入65 g硅膠（200～300目）不斷攪拌混勻，待溶劑揮發(fā)后上柱。依次以石油醚/丙酮混合溶液（體積比分別為1 ∶ 0、50 ∶ 1、25 ∶ 1、15 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）及丙酮/甲醇混合溶液（體積比分別為 50 ∶ 1、25 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。以TLC追蹤收集各組分，合并Rf值相同組分，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，對(duì)得到的各餾分進(jìn)行稱(chēng)量并測(cè)定化感活性。選擇活性最高的餾分繼續(xù)進(jìn)行二級(jí)、三級(jí)柱色譜分離，所采用的溶劑為不同比例的石油醚/丙酮或丙酮/甲醇。

1.2.5 制備色譜分析及結(jié)構(gòu)鑒定 對(duì)分離得到的二級(jí)或三級(jí)高活性餾分利用半制備高效液相色譜儀[Waters 1525二元梯度泵，配備Waters 2487雙波紫外檢測(cè)器，美國(guó);COSMOSIL πNAP半制備色譜柱 （250 mm×10 mm），YMC-Pack ODS-A半制備色譜柱（250 mm×10 mm），日本]進(jìn)一步分離，得到純化合物。再利用核磁共振波譜儀（Varian System 500型）等對(duì)這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3 生物測(cè)定

本研究采用瓊脂法對(duì)各提取物、萃取物及單體化合物的除草（化感）活性進(jìn)行測(cè)定[2-3，14]。

1.3.1 受體植物 包括生菜（L. sativa）和小麥（T. aestivum）2種栽培植物以及稗（E. crusgalli）和反枝莧（A. retroflexus）2種雜草。其中，小麥品種為煙農(nóng)24號(hào)，由煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供;生菜品種為益農(nóng)尼加拉黑核西生菜，購(gòu)自青島市城陽(yáng)區(qū)的種子銷(xiāo)售公司;反枝莧和稗草都采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)附近未使用過(guò)除草劑的荒地。將所有的供試植物種子存放于6 ℃種子柜中保存，備用。

1.3.2 種子催芽 用2%次氯酸鈉溶液浸泡供試植物的種子10～15 min后，用蒸餾水洗滌5～6次，然后放置在器皿中在流水下沖泡6～8 h讓其吸水。將吸水后的種子洗凈并均勻擺放于鋪有廚房用紙的方盤(pán)中，添加蒸餾水至廚房用紙完全濕潤(rùn)，上蓋后置于25 ℃恒溫氣候培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，待發(fā)芽種子的胚根（種子根）長(zhǎng)到3～5 mm時(shí)備用。

1.3.3 含提取物瓊脂基質(zhì)的配制 將各階段的提取物及單體化合物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后配制成高濃度的母液。取一定量的母液加入瓊脂溶液中，配制成含提取物的瓊脂基質(zhì)，瓊脂的最終濃度均為0.5%。以含有相同DMSO的0.5%瓊脂基質(zhì)為空白對(duì)照。各處理中DMSO的含量保持一致。

1.3.4 幼苗的移栽 在已凝固的瓊脂基質(zhì)表面用尖嘴鑷子插5個(gè)小孔，選擇根長(zhǎng)基本一致的受體植物發(fā)芽種子，將根部由小孔插入基質(zhì)，每個(gè)燒杯5粒，重復(fù)3次，放置在紙箱內(nèi)遮光后，在植物生長(zhǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d。生長(zhǎng)箱的設(shè)置條件是光照14 h（25 ℃）和黑暗10 h（20 ℃）的不斷循環(huán)，箱內(nèi)相對(duì)濕度為60%。

1.3.5 結(jié)果測(cè)量及數(shù)據(jù)分析 將各處理的幼苗從燒杯中取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其種子根（胚根）和胚芽鞘（胚軸）的長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)量。用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算對(duì)種子根（胚根）和胚芽鞘（胚軸）的抑制率及標(biāo)準(zhǔn)誤差，用SPSS軟件分析各處理的有效中濃度（EC50）。

生長(zhǎng)量=處理后的胚根（或胚軸）長(zhǎng)-處理前的胚根（或胚軸）長(zhǎng);

抑制率=（對(duì)照生長(zhǎng)量-處理生長(zhǎng)量）/對(duì)照生長(zhǎng)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈乙醇提取物不同萃取相對(duì)小麥和生菜幼苗生長(zhǎng)的影響

用60%乙醇溶液對(duì)10 kg玉米秸稈粉末進(jìn)行提取，共得到提取物浸膏700 g。然后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)其進(jìn)行萃取，分別得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物40、65、170、215 g，計(jì)算得率分別為5.7%、9.3%、24.3%和30.7%。進(jìn)而以生菜和小麥為受體植物測(cè)定了各萃取相的抑制生長(zhǎng)活性，如圖1所示，在0.25～2.00 g/L處理濃度下，各萃取相對(duì)2種植物發(fā)芽種子胚根（種子根）的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出較高的抑制活性，4種萃取相之間，以乙酸乙酯相的活性最高，石油醚相次之，正丁醇相和水相則相對(duì)較低。生長(zhǎng)在該濃度范圍內(nèi)的胚軸（胚芽鞘），只有乙酸乙酯相萃取物表現(xiàn)出較高的活性，其他萃取相的活性相對(duì)較低，甚至在低濃度下表現(xiàn)為一定的刺激生長(zhǎng)活性。因此，選擇乙酸乙酯相進(jìn)行柱色譜分離。

2.2 乙酸乙酯相的一級(jí)柱色譜分離結(jié)果及其生物活性

對(duì)乙酸乙酯相進(jìn)行一級(jí)柱色譜分離，得到 E1～E16共16個(gè)組分，各組分的得率以E13餾分最高（17.8%），E3餾分次之（12.8%），E5餾分（1.0%）最低，其他餾分則介于E3和E5之間（表1）。各餾分在0.5 g/L處理濃度下，除E1餾分對(duì)生菜幼苗胚根和胚軸的生長(zhǎng)表現(xiàn)為輕微的刺激作用外，其余餾分對(duì)二者的生長(zhǎng)均表現(xiàn)為不同程度的抑制活性。其中，以E3餾分的活性最高，對(duì)生菜胚根（胚軸）和小麥種子根（胚芽鞘）的抑制率分別高達(dá)100%（80.70%）和80.50%（6920%）;E13餾分的次之，分別為90.30%（46.20%）和8770%（75.70%）;而E1餾分的最低，僅為-9.68%（-7.32%）和8.39%（310%）;其他餾分的活性則介于它們之間。綜合考慮各組分的得率及生物活性，選擇E3和E13這2個(gè)餾分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

2.3 E3和E13餾分的柱色譜分離結(jié)果及其生物活性

以不同比例的石油醚/丙酮混合溶液（體積比分別為25 ∶ 1、20 ∶ 1、15 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）為洗脫劑，通過(guò)二級(jí)柱色譜分離，從E3餾分中得到E3-1、E3-2、E3-3和E3-4共4個(gè)餾分，它們的得率分別為 17.1%、31.5%、256%和25.8%（表2）。4個(gè)餾分在0.3 g/L濃度下對(duì)小麥和生菜幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，且以E3-2餾分的抑制活性最高，對(duì)小麥種子根（胚芽鞘）和生菜胚根（胚軸）的抑制率分別達(dá)95.0%（74.5%）和100%（100%），E3-3餾分次之，分別為77.5%（45.8%）和77.1%（577%），排第三的為E3-4餾分，分別為368%（14.9%）和51.9%（31.1%），而E3-1餾分最低，分別只有19.8%（8.2%）和23.4%（113%）（表2）。綜合考慮各組分的得率及生物活性，選擇E3-2餾分進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

以不同比例的石油醚/丙酮（體積比分別為 10 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、0 ∶ 1）和丙酮/甲醇（體積比分別為10 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）為洗脫劑，通過(guò)二級(jí)柱色譜分離，從E13餾分中分離得到E13-1～E13-5共5個(gè)餾分，各餾分的得率分別為 25.7%、16.5%、14.0%、13.2%和30.6%。它們?cè)?.3 g/L濃度下對(duì)生菜和小麥幼苗生長(zhǎng)也均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性（表2）。其中，E13-1和E13-2這2個(gè)餾分對(duì)生菜胚根（胚軸）和小麥種子根（胚芽鞘）的抑制率分別達(dá)98.8%～100%（816%～84.8%）和87.0%～95.6%（787%～87.2%），而E13-3和E13-4這2個(gè)餾分盡管也對(duì)它們的胚根（種子根）的生長(zhǎng)表現(xiàn)出68.2%～851%（62.0%～76.7%）的抑制活性，但對(duì)它們胚軸（胚芽鞘）的抑制效果則相對(duì)較低，只有162%～28.5%（31.7%～49.6%）。而 E13-5 餾分的活性則較差，只對(duì)小麥種子根表現(xiàn)出522%的較高抑制活性（表2）。綜合考慮各組分的得率及生物活性，選擇E13-1和E13-2這2個(gè)餾分進(jìn)行進(jìn)一步的分離。其中，E13-1餾分直接用于制備色譜分離。

2.4 E3-2和E13-2餾分的柱色譜分離結(jié)果及其生物活性

以不同比例的石油醚/丙酮溶液（體積比分別為10 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）為洗脫劑，通過(guò)柱色譜分離，從E3-2餾分中分離得到E3-2-1、E3-2-2、E3-2-3和E3-2-4這4個(gè)餾分，它們的得率分別為21.5%、23.6%、17.8%和371%。在0.05 g/L濃度下，只有E3-2-3餾分對(duì)生菜和小麥幼苗生長(zhǎng)顯示出較高的抑制活性，對(duì)二者胚根（胚軸）和種子根（胚芽鞘）生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)75.3%（46.6%）和73.8%（328%），而其他3個(gè)餾分除E3-2-1餾分對(duì)生菜胚根顯示出70.8%的抑制活性外，其余的抑制活性均較低。因此，選擇E3-2-3餾分進(jìn)行進(jìn)一步的制備色譜分離。

以不同比例的石油醚/丙酮溶液（體積比分別為3 ∶ 1、2 ∶ 1、0 ∶ 1）和丙酮/甲醇溶液（體積比分別為3 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1）為洗脫劑，通過(guò)柱色譜分離，從E13-2餾分中分離得到E13-2-1、E13-2-2和E13-2-3這3個(gè)餾分，它們的得率分別為31.9%、42.7%和35.4%。在0.05 g/L濃度下，只有E13-2-1餾分對(duì)生菜和小麥幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出較高的抑制活性，對(duì)二者胚根（胚軸）和種子根（胚芽鞘）生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)71.8%（328%）和83.5%（72.7%），而其他3個(gè)餾分除E13-2-3餾分對(duì)生菜胚根顯示出69.3%的較高抑制活性外，其余的活性均較低。因此，選擇 E13-2-1 進(jìn)行進(jìn)一步的制備色譜分離。

2.5 E3-2-3、E13-2-1和E13-1餾分的制備色譜分離、鑒定結(jié)果

利用半制備高效液相色譜儀對(duì)E3-2-3、E13-2-1和E13-1這3個(gè)餾分進(jìn)行進(jìn)一步分離，從 E3-2-3餾分（421 mg）中分離純化出5個(gè)化合物，即qn-1（13.1 mg）、qn-3-1（2.0 mg）、qn-4 （50.0 mg）、qn-5-1（1.4 mg）、qn-6（113.8 mg）;從E13-2-1餾分（57.9 mg）中分離純化出2個(gè)化合物，即qn-3-1 （2.0 mg）和 qn-4（5.8 mg）;從E13-1餾分（153.8 mg）中分離純化出1個(gè)化合物，即qn-9（17.5 mg）。其中，E3-2-3的分離條件為47%（體積比）甲醇水溶液，YMC-ODS半制備柱（250 mm×10 mm），4 mL/min 洗脫， 5個(gè)化合物的保留時(shí)間（tR） 分別為7.2、17.7、19.5、30.7、36.3 min;E13-2-1的分離條件為35%（體積比）甲醇水溶液，YMC-ODS半制備柱（250 mm×10 mm），4 mL/min洗脫，qn-3-1和qn-4 2個(gè)化合物的tR分別為31.0、36.5 min;E13-1的分離條件為20%（體積比）乙腈-酸水（酸水：在水中加入0.5‰的三氟乙酸），πNAP半制備柱（250 mm×10 mm），流速為 4 mL/min，得到化合物qn-9的tR為14.0 min。

利用核磁共振波譜儀，對(duì)這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分別確定為對(duì)羥基苯甲醛（qn-1）、順式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-3-1）、反式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-4）、順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-5-1）、反式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-6）和反式對(duì)羥基肉桂酸（qn-9）。它們的C、H信號(hào)歸屬如下：對(duì)羥基苯甲醛（qn-1）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：9.71（1H，s，—CHO），7.73（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），6.87（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：192.8（CO），165.5（C-4），133.4（C-1），130.1（C-2，6），117.0（C-1）。順式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-3-1）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD） δ：7.62（2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6），6.85（1H，d，J=12.8 Hz，H-7），6.75（2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5），5.7 （1H，d，J=12.8 Hz，H-8），3.70（3H，s，—CH3）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD） δ：1688（CO），160.0（C-4），145.0（C-7），133.6（C-2，6），127.5（C-1），116.3（C-8），115.8（C-3，5），51.7（—CH3）。反式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-4）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD） δ：7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.33（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.71（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），6.20（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.65 （3H，s，OCH3）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD） δ：169.7（CO），161.3（C-4），146.5（C-7），131.1（C-2，6），127.0（C-1），116.8（C-3，5），114.8（C-8），52.0（—CH3）。順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-5-1）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD） δ：760（ 2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.84（1H，d，J=12.8 Hz，H-7），6.74 （2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），5.75 （1H，d，J=12.8 Hz，H-8），4.16 （2H，q，J=7.2 Hz，H-10） 1.25 （3H，t，J=7.2 Hz，H-11）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD） δ：168.4（CO），160.0（C-4），144.7（C-7），133.5（C-2，6），127.7（C-1），116.9（C-8），115.8（C-3，5），61.2（C-10），14.5（C-11）。反式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-6）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD） δ：7.35（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.18（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.59 （2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），6.04 （1H，d，J=160 Hz，H-8），3.95 （2H，q，J=7.2 Hz，H-10） 1.05（3H，t，J=7.2 Hz，H-11）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD） δ：169.2（CO），161.0（C-4），146.2（C-7），131.0（C-2，6），127.0（C-1），116.7（C-3，5），115.2（C-8），61.4（C-10），14.6（C-11）。反式對(duì)羥基肉桂酸（qn-9）：1H-NMR（500 MHz，CD3OD） δ：7.53（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），7.37（ 2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.73（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），6.21 （1H，d，J=15.9 Hz，H-8）;13C-NMR（125 MHz，CD3OD） δ：171.1（CO），161.1（C-4），146.6（C-7），131.1（C-2，6），127.2（C-1），116.8（C-3，5），115.6（C-8）。

6種化合物的結(jié)構(gòu)式如圖2所示，從左向右依次分別為對(duì)羥基苯甲醛（qn-1）、順式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-3-1）、反式對(duì)羥基肉桂酸甲酯（qn-4）、順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-5-1）、反式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（qn-6）以及反式對(duì)羥基肉桂酸（qn-9）。

2.6 分離物的生物活性

經(jīng)過(guò)對(duì)除順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯（未購(gòu)得）外其余5種化合物的除草活性的測(cè)定，從獲得的有效中濃度（EC50）來(lái)分析，發(fā)現(xiàn)它們均對(duì)小麥和生菜幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的抑制活性，并表現(xiàn)出以下趨勢(shì)：一是對(duì)胚根（種子根）的抑制活性明顯低于對(duì)胚軸（胚芽鞘）的抑制活性;二是對(duì)生菜的抑制活性低于對(duì)小麥的抑制活性;三是對(duì)羥基苯甲醛除對(duì)小麥胚根的活性較高外，其余的均明顯低于其他4種化合物（表4）。

從表5可以看出，4種對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物在0.025 g/L濃度下，對(duì)反枝莧和稗幼苗的生長(zhǎng)也具有明顯的抑制作用。其中，對(duì)反枝莧胚根和胚軸的抑制率分別達(dá)82.0%～86.3%、53.8%～626%，對(duì)稗種子根和胚芽鞘的抑制率分別為562%～86.7%、19.6%～45.4%。而對(duì)羥基苯甲醛的抑制效果明顯較低，抑制率只有20%左右。

3 結(jié)論與討論

植物化感作用是指植物體所分泌的次生代謝產(chǎn)物對(duì)其周邊其他植物所產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制或生長(zhǎng)促進(jìn)作用，包括對(duì)其自身生長(zhǎng)的影響[15]。植物化感作用普遍存在于自然界的所有植物中[15]，但不同的植物乃至不同的植物器官所具有的植物化感作用有很大的差異[3，15-17]。說(shuō)明不同的植物種類(lèi)在生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可能在種類(lèi)和數(shù)量上都存在較大的差異，即使是同一種植物，其不同的器官所合成或積累的化感物質(zhì)在數(shù)量上有較大的不同，不同品種間也一樣。

Rice在1984年根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異把植物中的化感物質(zhì)分成以下幾類(lèi)：酚類(lèi)、類(lèi)萜類(lèi)、脂肪族醇、醛、酮、酸及內(nèi)酯、多炔、苯醌、復(fù)醌和蒽醌、香豆素類(lèi)、芳香酸及其衍生物、類(lèi)黃酮、丹寧、甾類(lèi)化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等[15]。本研究從玉米秸稈中分離出的活性物質(zhì)順式（或反式）對(duì)羥基肉桂酸甲酯、順式（或反式）對(duì)羥基肉桂酸乙酯、反式對(duì)羥基肉桂酸等肉桂酸類(lèi)化合物均屬于肉桂酸的衍生物，是植物的有機(jī)酸或酯，而對(duì)羥基苯甲醛屬于醛類(lèi)化合物。本研究結(jié)果表明，幾種對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)化合物（除順式對(duì)羥基肉桂酸乙酯待測(cè)定外）及對(duì)羥基苯甲醛對(duì)小麥、生菜、稗和反枝莧發(fā)芽種子胚根（種子根）的生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用，對(duì)胚軸（胚芽鞘）生長(zhǎng)雖然也表現(xiàn)出一定的抑制活性，但所需的濃度相對(duì)較高。

盡管有學(xué)者已經(jīng)從玉米秸稈中分離得到多種具有化感活性的有機(jī)酸（己酸、丁酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯甲酸、苯乙酸、咖啡酸、香草酸、水楊酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、鄰-香豆酸、鄰-羥基苯乙酸、水楊醛、4-苯基丁酸、3-苯基-2-丙烯酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、8-十八烯酸、4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲酸）以及鄰苯二甲酸二丁酯、5-氯-6-甲氧基-2-苯丙惡唑啉酮（CI-MBOA）、6-甲氧基-2-苯丙惡唑啉酮（MBOA）和2，4-二羥基-1，4-苯并惡嗪-3-酮（DIBOA） 等化合物[18]，但本研究首次從玉米秸稈中分離得到順式（或反式）對(duì)羥基肉桂酸甲酯、順式（或反式）對(duì)羥基肉桂酸乙酯、反式對(duì)羥基肉桂酸和對(duì)羥基苯甲醛，并確認(rèn)了它們的化感（除草）活性，其中4種肉桂酸類(lèi)化合物的活性明顯高于對(duì)羥基苯甲醛。

對(duì)羥基肉桂酸，別稱(chēng)4-羥基肉桂酸、對(duì)羥基苯丙烯酸，是一種具有抗氧化性質(zhì)的羥基衍生物，因可以減少致癌物質(zhì)亞硝胺的形成，故具有減少患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的作用[19]。它是一些醫(yī)藥合成的中間體，在農(nóng)藥行業(yè)用于生產(chǎn)植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、長(zhǎng)效殺菌劑和果蔬保鮮防腐劑[20]。由于該物質(zhì)是木質(zhì)纖維素的主要成分，因此廣泛存在于植物中[21-22]。對(duì)羥基肉桂酸甲酯或乙酯作為對(duì)羥基肉桂酸的酯類(lèi)化合物，前者既可作為合成抗腎上腺素藥艾司洛爾的中間體[23]，也被應(yīng)用于制作觸摸屏和高端光纖材料[24]。后者具有抗氧化、抗炎、降脂等生物活性功能，可用于開(kāi)發(fā)藥物或保健食品[25]。這些化合物除了在玉米秸稈中大量存在外，還被分離自玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）[26]、梔子（Gardenia jasminoides Ellis）[27]、甘蔗（Saccharum officinarum L.）[28]、毛竹筍[Phyllostachys edulis （Carr.） Lehaie][29]、川西千里光（Senecio solidagineus Hand.-Mazz）[30]、山核桃（Juglans mandshurica Maxim.）[31]、攀枝鉤藤（Uncaria scandens Smith.）[32]、麗江蚤綴（Arenaria oreophila Hook.）[33]和扛板歸根（Polygonum perfoliatum L.）[34]等多種植物。而對(duì)羥基苯甲醛是有機(jī)合成和精細(xì)化工合成的重要中間體，用途非常廣泛，可用于香料、醫(yī)藥、農(nóng)藥合成等諸多方面[35]，在植物中也廣泛存在[13，26，29]。

由于上述化合物對(duì)供試植物種子胚根（種子根）生長(zhǎng)具有很好的抑制活性，表現(xiàn)出可開(kāi)發(fā)為除草劑的良好前景。一方面需要在研究幾種化合物協(xié)同效應(yīng)的基礎(chǔ)上，明確其作用原理，通過(guò)制劑的研發(fā)，探討其作為除草劑的應(yīng)用前景;另一方面，以這些化合物為先導(dǎo)化合物，在進(jìn)一步引入官能團(tuán)的基礎(chǔ)上，尋找活性更高的物質(zhì)。正是鑒于這些化合物的植物源屬性，發(fā)揮其仿生和易于在環(huán)境中分解代謝的特性，有利于開(kāi)發(fā)出對(duì)環(huán)境友好的新型除草劑。

致謝：制備色譜及核磁共振階段的化合物分離鑒定委托中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院朱偉明教授實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在此表示衷心的感謝。

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