秦春怡，杜青平，羅宏威，林俊熙，李美君，許燕濱

廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣州 510006

金屬納米顆粒被大量使用在抗菌劑、襪子、枕頭、口罩、清潔劑和洗發(fā)水等個人護理產(chǎn)品中[1]。納米氧化鋅(ZnO-NPs)在消費產(chǎn)品使用的金屬納米顆粒中排名前3位，估計全球年產(chǎn)量在550～33 400 t之間[2]。這些工程化納米粒子的加速生產(chǎn)和使用可能導致其在環(huán)境中釋放，并促進與生態(tài)系統(tǒng)中生物和非生物成分的頻繁相互作用，具有潛在的生物毒性效應[3]。據(jù)報道，ZnO-NPs顆粒與細菌細胞壁或甲殼類動物腸道之間的緊密接觸會導致接觸區(qū)域附近的微環(huán)境發(fā)生變化，生成可能損壞細胞膜的活性氧自由基(ROS)[4]。ZnO-NPs能進入大型溞的基底質(zhì)膜和腸道肌肉中，且可與大型溞的質(zhì)膜相互作用，并能穿過上皮屏障進入大型溞細胞內(nèi)[5]。斑馬魚胚胎暴露在ZnO-NPs中，會造成胚胎孵化率降低，魚鰾缺損，引起斑馬魚的氧化應激，還會通過影響細胞發(fā)育周期過程抑制斑馬魚的正常生長發(fā)育和其他生命活動，甚至導致其死亡[6-7]。然而目前許多研究都是針對納米粒子的單一因素影響，未考慮自然水體中各種非生物因素對納米粒子的遷移轉(zhuǎn)化及生物毒性的影響。

天然有機物(natural organic matter,NOM)是在水體中廣泛存在的有機混合物，其豐富的羧基和酚羥基等官能團可作為金屬、納米顆粒和其他有機污染物結(jié)合的活性位點[8]，增強溶液中納米粒子的分散性和穩(wěn)定性[9]。水體中的NOM大部分是由腐殖酸(humic acid,HA)組成的。HA是天然水體和供水系統(tǒng)中可溶性有機物的主要成分[10]，在水體中的濃度比納米粒子的濃度高出幾個數(shù)量級，可從幾毫克到數(shù)百毫克每升[11-12]，對水體中納米粒子的遷移轉(zhuǎn)化、生物利用度和毒性起著重要作用[13]。Shang等[14]發(fā)現(xiàn)NOM的存在使細胞內(nèi)ROS生成濃度降低，從而降低MoS2NPs對大腸桿菌的光毒性。Dai等[15]證實HA可以吸附到ZnO-NPs表面，從而減輕ZnO-NPs對大型溞抗氧化系統(tǒng)的損害。Kteeba等[16]表明加入HA不僅可降低ZnO-NPs誘導的斑馬魚孵化率和存活率降低等毒性效應；而且會緩解ZnO-NPs誘導的發(fā)育毒性[17]。但目前許多研究并未對HA加入后，HA-ZnO-NPs雜化物的物化性質(zhì)改變及HA緩解ZnO-NPs致斑馬魚毒性效應的作用機理做出系統(tǒng)的解釋。

斑馬魚作為一種模式物種，其胚胎有著體積小，透明度高，易于獲取和維護以及與哺乳動物基因高度同源的優(yōu)點，被廣泛用于藥物和化學物質(zhì)的生態(tài)毒理學測試的研究中[18]。因此，本研究選用斑馬魚胚胎作為模型生物，以ZnO-NPs及HA作為研究對象，研究了斑馬魚胚胎的存活狀況，并從ZnO-NPs與HA-ZnO-NPs的物化性質(zhì)和斑馬魚胚胎抗氧化酶活性變化等方面來闡釋ZnO-NPs對斑馬魚的毒性效應及HA對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性的緩解機理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚培養(yǎng)及胚胎收集

成年斑馬魚(來自廣東省實驗動物研究所)在實驗室中馴養(yǎng)超過2個月，自循環(huán)水箱中的水溫控制在(28±2) ℃，光照周期為14 h/10 h，每日喂食2次豐年蝦。產(chǎn)卵前一天停止喂食，將健康的雌、雄魚挑出放在產(chǎn)卵盒中，第2天上午去除隔板并開啟光照，使雌雄成魚在光刺激下產(chǎn)卵受精。受精過程結(jié)束后立即收取魚卵，剔除未受精的魚卵后用培養(yǎng)液清洗胚胎。健康魚卵放在培養(yǎng)液中培育，用于實驗。

1.2 實驗藥品的制備及表征

1.2.1 培養(yǎng)液的制備

準確稱取KCl 0.23 g、MgSO4·7H2O 4.93 g、CaCl2·2H2O 11.76 g和NaHCO32.59 g(天津市大茂化學試劑廠，分析純)。用超純水溶解并稀釋至1 L儲備。培養(yǎng)液參照文獻[7]制備，使用前取25 mL，用純水稀釋至1 L作為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液取用前充分曝氣，并調(diào)節(jié)pH值至7.8±0.2。

1.2.2 ZnO-NPs懸浮液的配制與表征

ZnO-NPs(上海麥克林公司，純度99.9%)，干燥粉末狀，粒徑為(30±10) nm。稱取ZnO-NPs 0.01 g 加入100 mL培養(yǎng)液中，攪拌并超聲(SB-5200，寧波新芝生物科技股份有限公司)30 min，獲得0.1 g·L-1的ZnO-NPs懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用，并按需要稀釋懸浮液。用納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer NANO ZS，英國Malvern)測定ZnO-NPs的分散狀況與Zeta電位值。

1.2.3 HA-ZnO-NPs雜化物的物化性質(zhì)檢測

HA(上海源葉生物公司)，干燥黑色粉末狀，用傅里葉紅外光譜儀(Nicolet IS50，美國Thermofisher)對其進行表征。0.1 g的HA粉末溶于500 mL pH 11.4的純水中，攪拌2 h。用0.45 μm的聚四氟乙烯濾膜過濾，將溶液pH調(diào)至7.8±0.2，定容至1 L后得到0.1 g·L-1的HA儲備液，用總有機碳分析儀(TOC-L CPH，日本島津)檢測得到其有機碳含量為60 mg·L-1，即HA儲備液濃度為60 mg·L-1(以碳計)。

取HA儲備液100 mL，加入ZnO-NPs粉末0.01 g，超聲30 min，攪拌24 h。3 500g離心30 min，真空抽濾泵過0.22 μm的濾膜抽濾。抽濾后用純水沖下濾膜上的粉末，冷凍干燥，得到HA與ZnO-NPs的雜化物(HA-ZnO-NPs)，并用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)表征，用納米粒度及Zeta電位分析儀測定其水動力直徑及Zeta電位值。

1.3 胚胎染毒及指標觀察

在六孔板中放置健康胚胎，每孔20枚，每組3組平行，暴露周期為0～96 hpf。用體視顯微鏡(SMZ-745T，尼康)觀察胚胎的生長狀況，并記錄存活率等指標。實驗所用稀釋液均為培養(yǎng)液，暴露實驗分為以下組別。(1)ZnO-NPs暴露：超聲處理后的ZnO-NPs懸浮液按照濃度梯度法，稀釋為1、5、10和20 mg·L-1，并以配制好的培養(yǎng)液作為對照組暴露，以探究ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的毒性影響。(2)ZnO-NPs和HA暴露：選擇20 mg·L-1的ZnO-NPs懸浮液與0、3、6、12和24 mg·L-1(以碳計)的HA對胚胎進行聯(lián)合暴露，以探究HA對ZnO-NPs毒性的緩解作用。

1.4 氧化應激酶活性測試

將收集洗凈的胚胎放入培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿100枚胚胎)，按實驗組別分別加入ZnO-NPs和HA試驗液，每個濃度設置3組平行。待暴露24 h后，每個培養(yǎng)皿取60枚左右的胚胎，加入生理鹽水中冰勻漿，8 000 r·min-1離心10 min取上清液，并按照試劑盒(南京建成工程研究所)所述試驗方法測定超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，拍照記錄，統(tǒng)計胚胎存活率等毒理學終點指標。使用SPSS 20.0進行回歸計算，得出LC50；組間比較采用單因素方差分析法(One Way ANOVA)分析，并以Tukeys做多重比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；并用Origin 8.5進行作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 ZnO-NPs與HA的相互作用的FTIR光譜圖

HA具有豐富的親水基團，易于被納米材料吸附，使得納米材料在水中穩(wěn)定性得到提高。使用傅里葉紅外光譜儀對HA、ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs的表面官能團進行檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 ZnO-NPs、HA和HA-ZnO-NPs的FTIR光譜圖注：ZnO-NPs表示納米氧化鋅；HA表示腐殖酸；HA-ZnO-NPs表示HA與ZnO-NPs的雜化物。Fig.1 FTIR spectra of ZnO-NPs,HA and HA-ZnO-NPsNote:ZnO-NPs stands for ZnO nanoparticles;HA stands for humic acid;HA-ZnO-NPs stands for mixed compound of HA and ZnO-NPs.

2.2 HA-ZnO-NPs的穩(wěn)定性分析

動態(tài)光散射是通過測量樣品散射光強的變化來分析樣品顆粒大小和穩(wěn)定性信息的一種技術，常應用于表征懸浮液中納米顆粒的尺寸。對不同濃度的ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs進行Zeta電位及DLS測試，結(jié)果如圖2所示。

研究證實Zeta電位絕對值的大小與懸浮液的穩(wěn)定性和分散性相關，當Zeta電位絕對值>30 mV時認為懸浮液具有良好的穩(wěn)定性[21]。ZnO-NPs的Zeta電位值均為負值，表明ZnO-NPs帶有一定的弱負電荷。由圖2(a)可知，懸浮液的Zeta電位絕對值隨著ZnO-NPs濃度的增加而減少，且Zeta電位絕對值均低于22 mV。這表明ZnO-NPs懸浮液穩(wěn)定性較差。從懸浮液中ZnO-NPs的水動力直徑可見，隨著ZnO-NPs濃度增大，其水動力直徑增大，表明ZnO-NPs在溶液中有聚集傾向，呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系。聚集到一定程度懸浮液的穩(wěn)定性降低，這與Zeta電位的結(jié)果一致。

由圖2(b)可知，在20 mg·L-1的ZnO-NPs中加入HA后，ZnO-NPs表面負電荷增加，懸浮液Zeta電位絕對值均增大，且隨著HA濃度增大Zeta電位絕對值增大。當HA濃度>3 mg·L-1時，各組的Zeta電位絕對值均>30 mV。從水動力直徑與HA濃度之間的關系可見，隨著HA濃度增大，懸浮液顆粒物的水動力直徑減少。由結(jié)果可知，在ZnO-NPs溶液中加入HA后，懸浮液中大顆粒數(shù)量減少，Zeta電位絕對值增大，ZnO-NPs的分散性良好，表明HA增加了ZnO-NPs懸浮液的穩(wěn)定性。

圖2 不同暴露組水動力直徑與Zeta電位變化注：(a) ZnO-NPs；(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA。Fig.2 Hydrodynamic diameters and Zeta potential change of different exposure groupsNote:(a) ZnO-NPs;(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA.

2.3 ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的存活率的影響

用不同濃度的ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs對斑馬魚胚胎進行暴露，96 hpf內(nèi)的存活率如圖3所示。

由圖3(a)可知，ZnO-NPs對斑馬魚胚胎暴露染毒后，胚胎的存活率隨著ZnO-NPs的濃度升高而下降，且暴露時間越長，胚胎存活率越低。根據(jù)概率單位法計算得到，ZnO-NPs對斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)約為3.86 mg·L-1。除1 mg·L-1組外，各實驗組96 hpf的胚胎存活率均低于40%，與對照組相比，有顯著的統(tǒng)計學下降(P<0.01)，尤其ZnO-NPs為20 mg·L-1處理組的胚胎96 hpf存活率僅3%左右。由圖3(b)可知，在ZnO-NPs中加入HA后，斑馬魚胚胎存活率升高，且在相同ZnO-NPs(20 mg·L-1)的處理下，斑馬魚的存活率隨著HA濃度增高而增高。在HA濃度達到6 mg·L-1以上，各實驗組的96 hpf胚胎存活率高于80%，當24 mg·L-1時，斑馬魚胚胎存活率幾乎與對照組相當。這表明HA對ZnO-NPs引起的胚胎存活率影響有一定的緩解作用。

圖3 不同濃度組斑馬魚胚胎存活率注：(a) ZnO-NPs，(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA；*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.3 Survival rate of zebrafish exposed to different concentrations of ZnO-NPs and HANote:(a) ZnO-NPs,(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA;*represents P<0.05,**represents P<0.01.

2.4 HA對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎表面附著情況的影響

對ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs培養(yǎng)液中斑馬魚胚胎的表面結(jié)構(gòu)進行顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，暴露在ZnO-NPs懸浮液中的斑馬魚胚胎(圖4(a)～4(c))表面絨毛膜上附著了許多團聚物，這些團聚物隨著時間的增長而有所增多，在48 hpf的胚胎絨毛膜上各實驗組幾乎都發(fā)現(xiàn)了附著超過1 μm的團聚物。而在HA-ZnO-NPs處理組中，懸浮液中ZnO-NPs分布均勻，在斑馬魚胚胎的表面也未看見明顯的團聚物附著(圖4(d)～4(f))，在48 hpf后的斑馬魚胚胎表面絨毛膜上只有少量的聚集粒子。在劉倩等[22]的研究中，發(fā)現(xiàn)ZnO-NPs在大型溞表面的附著，并造成了大型溞體表的損傷。納米顆粒在生物體表面的粘附對其毒性起著至關重要的作用[23]。在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，胚胎尚未從絨毛膜中孵化，主要沉于容器的底部。由于ZnO-NPs在水中的易沉聚特性導致了納米顆粒團聚物在容器底部聚集，增加了胚胎與納米顆粒的接觸概率，增強了其毒性。在加入HA后，ZnO-NPs的Zeta電位絕對值升高至30 mV以上，且水動力直徑減少，表明納米顆粒在水中變得更穩(wěn)定，聚集現(xiàn)象減少，從而減少了納米顆粒在胚胎表面的附著。

圖4 ZnO-NPs在斑馬魚胚胎表面的附著注：(a)～(c) ZnO-NPs 10 mg·L-1；(d)～(f) HA (24 mg·L-1)+ZnO-NPs (20 mg·L-1)。Fig.4 ZnO-NPs adhere on embryo surface of zebrafishNote:(a)～(c) ZnO-NPs 10 mg·L-1;(d)～(f) HA (24 mg·L-1)+ZnO-NPs (20 mg·L-1).

2.5 HA對ZnO-NPs導致的胚胎發(fā)育氧化應激的緩解作用

金屬氧化物納米顆粒通常會誘導生物體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS若不及時清除，會導致生物體氧化損傷[24]。據(jù)報道，ZnO-NPs除了因在斑馬魚胚胎表面聚集而導致胚胎毒性外，對生物體的另一毒性機制主要是導致生物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生[25]。通常，細胞中ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中，抗氧化酶(CAT、SOD等)對清除體內(nèi)自由基、維持ROS的平衡和激活生物體氧化應激起著重要的作用[26]。因此對ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs暴露條件下斑馬魚胚胎的CAT與SOD酶活性進行測定，結(jié)果如圖5所示。

由圖5(a)可知，暴露于ZnO-NPs處理的各組中斑馬魚胚胎體內(nèi)CAT和SOD酶活性均升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。CAT與SOD均在10 mg·L-1的ZnO-NPs組中酶活性最高。與對照組相比，5、10和20 mg·L-1的ZnO-NPs實驗組呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。由圖5(b)可知，在加入HA的實驗組中，與20 mg·L-1ZnO-NPs處理組相比，CAT和SOD酶活性水平隨HA濃度增加呈下降趨勢，在HA為12 mg·L-1和24 mg·L-1的實驗組中，CAT與SOD酶活水平回落，與對照組相比，無顯著性差異。從實際應用角度出發(fā)，12 mg·L-1的HA為最佳處理濃度。

圖5 斑馬魚胚胎暴露于ZnO-NPs(a)和HA-ZnO-NPs(b)的過氧化氫酶(CAT)與超氧化物歧化酶(SOD)活性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.5 Catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities of zebrafish exposed to ZnO-NPs (a) and HA-ZnO-NPs (b)Note:*represents P<0.05,**represents P<0.01.

3 討論(Discussion)

水體中廣泛存在的天然有機物，如HA，含有豐富的羧基和酚羥基等官能團，可與進入水體的各種污染物發(fā)生反應。關于金屬納米粒子與水體中HA反應及作用機理尚不清晰。據(jù)報道，自然界中存在的HA對納米粒子的遷移轉(zhuǎn)化途徑有著不可忽視的影響，這些影響往往改變了納米粒子的物理化學性質(zhì)，從而導致其對水生生物的毒性影響發(fā)生改變。本研究證實ZnO-NPs在水中極不穩(wěn)定，易團聚成大顆粒。在ZnO-NPs懸浮液中加入HA后，懸浮液中大顆粒數(shù)量減少，Zeta電位絕對值增大，水動力直徑減少，增加了ZnO-NPs的穩(wěn)定性。

以不同濃度的ZnO-NPs對斑馬魚胚胎進行暴露后，斑馬魚胚胎的存活率與ZnO-NPs的濃度存在

一定的劑量-效應關系。經(jīng)計算ZnO-NPs對斑馬魚的LC50約為3.86 mg·L-1。20 mg·L-1的ZnO-NPs處理下胚胎96 hpf存活率僅3%左右。斑馬魚胚胎暴露于ZnO-NPs中，還誘發(fā)了一系列發(fā)育畸形效應，如尾部畸形、脊柱彎曲等，這與Nasrallah等[27]和Suriyaprabha等[28]的研究結(jié)果相似。這表明ZnO-NPs對斑馬魚胚胎具有早期階段發(fā)育毒性。以不同濃度的HA加入20 mg·L-1的ZnO-NPs懸浮液中，隨著HA濃度(0～24 mg·L-1)的升高，斑馬魚的存活率升高，當HA濃度>6 mg·L-1，胚胎96 hpf的存活率高于80%。這表明HA可以降低ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的毒性。Kteeba等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同種類的NOM中，HA對納米粒子致斑馬魚胚胎毒性的緩解作用最明顯。為進一步探討HA緩解ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性作用的機理，本研究通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ZnO-NPs的實驗組中斑馬魚胚胎絨毛膜表面均附著了許多ZnO-NPs的團聚體。納米顆粒的粘附不僅會造成生物有機體的表體損傷，還會堵塞斑馬魚胚胎絨毛膜表面的孔隙，使胚胎內(nèi)部環(huán)境的氧濃度降低[29]。斑馬魚胚胎絨毛膜的孔隙直徑為0.7 μm左右[30]，這便使得水動力直徑<0.7 μm的ZnO-NPs與HA-ZnO-NPs粒子都有機會通過胚胎絨毛膜的孔隙進入胚胎內(nèi)部。但是斑馬魚胚胎的絨毛膜具有化學反應活性，可以調(diào)控納米粒子進入胚胎的方式[31]，所以不能簡單地視其為胚胎外層的物理屏障。納米粒子附著在胚胎絨毛膜上，會對斑馬魚胚胎絨毛膜造成損傷，進而破壞絨毛膜的調(diào)控能力[29]。而加入HA之后，斑馬魚胚胎絨毛膜表面團聚體明顯減少，這與Zeta電位和水動力直徑的研究結(jié)果一致，表明HA的加入使ZnO-NPs穩(wěn)定地分散在懸浮液中，減少了其團聚并沉積到容器底部的幾率，進一步減少了沉在容器底部的斑馬魚胚胎與ZnO-NPs的接觸。HA減少了納米粒子在胚胎絨毛膜表面的粘附，則減輕了ZnO-NPs對絨毛膜的損傷，從而使納米粒子的生物利用率降低，毒性得到緩解[32]。

在前期研究中，ZnO-NPs會誘導生物體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS[33]，導致斑馬魚胚胎的抗氧化酶活性的增加[22]。ROS的增加會對有機體造成傷害，而SOD和CAT是維持體內(nèi)氧化還原平衡的關鍵抗氧化酶。SOD將體內(nèi)增加的ROS歧化為過氧化氫，再由CAT催化過氧化氫，降解或還原為水和氧分子[34]。本研究中，ZnO-NPs各實驗組均提高了斑馬魚胚胎的SOD、CAT酶活，除1 mg·L-1的ZnO-NPs實驗組外，各組酶活性與對照組相比均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，這表明ZnO-NPs激發(fā)了斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化應激。HA的加入可以使CAT與SOD酶活性水平回落，在加入12 mg·L-1與24 mg·L-1HA的實驗組中，斑馬魚體內(nèi)的CAT與SOD酶活性水平與對照組相比均無顯著性差異；此時，HA的濃度雖成倍增加，但斑馬魚體內(nèi)的抗氧化酶活性水平無顯著差異，所以從實際應用角度考慮，12 mg·L-1的HA為最佳處理濃度。當ZnO-NPs導致機體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS時，生物體內(nèi)CAT與SOD酶活性會升高，以清除過量的ROS[19]。而HA可以作為抗氧化劑與細胞內(nèi)ROS發(fā)生反應，顯著降低生物有機體內(nèi)的自由基水平，使生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)恢復平衡[29]，因此，氧化應激的SOD與CAT活性逐漸恢復正常，這與Zhang等[19]的研究結(jié)果一致。

總之，懸浮液中HA的存在對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性有一定的緩解作用，在研究納米粒子的生物毒性時，除考慮濃度的累積效應外，還應把環(huán)境中的其他生態(tài)因子的影響納入考慮，進行全面評估，可避免對其在環(huán)境中的潛在毒性造成過高或過低的評價。