張彥坤，楊兵坤，謝鵬飛，胡林勇，趙新全，徐世曉，孫平,*

1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003

2.中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008

塑料制品因其輕便耐腐蝕以及生產(chǎn)成本低而廣泛應用于日常生活中，尤其是2020年新型冠狀病毒在全球流行期間使用的個人防護用品，如全球每月大約使用1.290×1011個口罩和6.50×1010只手套，這些仍未得到人們重視和妥善處理的塑料制品，終將進入到自然環(huán)境中[1-3]。環(huán)境中的塑料垃圾幾乎不會自然降解，只會在物理、化學或微生物作用下分解成越來越小的碎片，人們通常將直徑<5 mm的碎片稱為微塑料[4-5]。微塑料廣泛分布于環(huán)境中的各個角落，包括最偏遠的南極與北極，珠穆朗瑪峰頂與馬里亞納海溝[6-9]。微塑料具有電負性和較大的比表面積，會吸附環(huán)境中的重金屬與有機物等污染物，增加對生物體的影響[10]。目前我國淡水中的微塑料數(shù)量約為0.55×105～3.42×107microspheres·km-2(即個·km-2，本文均使用microspheres表示微塑料個數(shù))[11]，也有學者提出水環(huán)境中的微塑料濃度為1×106microspheres·L-1[12-14]。研究表明，水中的微塑料顆?？梢员凰飻z取，通過食物鏈富集，最終到達人類體內[15]。因此，水體中存在的微塑料不容忽視。

微塑料的形狀和顏色與浮游動物相似，導致其非常容易被魚類當作食物攝入[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，攝入的微塑料會在魚類的鰓和腸道中積累，甚至通過循環(huán)系統(tǒng)積累在肝臟和大腦中[17]，對這些組織造成物理磨損等影響，導致魚類的生理生化以及行為發(fā)生改變[18]，主要表現(xiàn)為減少游泳速度和活動范圍，減弱攝食能力與攝食速度，降低能量儲備與營養(yǎng)成分，最終導致生長速度和繁殖產(chǎn)量受到影響[12,19]。此外，研究表明生物體內積累的微塑料會造成諸多影響，例如內分泌紊亂[4]、氧化損傷和神經(jīng)毒性[20]、酶活性降低[21]、腸道菌群改變[22]、細胞壞死[23]和存活率降低[24]。此外，微塑料還導致魚類代謝紊亂，主要表現(xiàn)在干擾其能量代謝[25]、糖代謝和脂代謝[26]。但不同粒徑不同濃度以及暴露時間的不同對魚類肝臟代謝的干擾可能會不同。微塑料暴露120 h會導致斑馬魚幼魚的行為和視覺基因的表達產(chǎn)生影響[27]，而暴露7 d后則會干擾斑馬魚幼魚的代謝譜，主要表現(xiàn)為能量代謝和糖脂代謝受到干擾[28]。目前微塑料的急性暴露大多是關于幼魚的研究，對成魚肝臟具體代謝機制的影響研究仍不充分，需進行相關方面的研究來補充。因此選擇成年劍尾魚暴露時間為72 h，來探討微塑料短期暴露是否對成魚肝臟造成干擾。

劍尾魚(Xiphophorushelleri)是一種小型、卵胎生和易喂養(yǎng)的花鳉科魚類，因其具備繁殖世代時間短(1～1.5個月)、易區(qū)分雌雄、對環(huán)境變化敏感和便于在實驗室條件下進行純化培養(yǎng)等特點，被用作水生實驗動物的模式生物[29]。在本研究中，將成年劍尾魚暴露在直徑5 μm不同濃度的聚苯乙烯微塑料中72 h，檢測急性暴露是否會誘導劍尾魚肝臟氧化應激和代謝失調，以探討微塑料對水生生物的潛在毒性與干擾機理，為微塑料對水生生物造成的潛在健康風險提供新的見解。在此，本研究有以下2個目的：(1) 隨著環(huán)境中塑料垃圾的劇增，未來短期內劇增的微塑料顆粒是否會加深對魚類的影響？(2) 目前微塑料暴露對魚類的已知影響是否會在肝臟代謝水平上有所體現(xiàn)？

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料與實驗用魚

本研究中使用的5 μm球形單分散綠色熒光微塑料顆粒購自天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心，微塑料基質為聚苯乙烯塑料，可以均勻分散于水中，最大激發(fā)和發(fā)射波長為470 nm和526 nm。本次實驗動物為雄性紅眼紅體劍尾魚，購于陜西紅劍魚養(yǎng)殖基地。選擇5月齡、規(guī)格相近、體表無傷痕、鱗片完整、體色鮮艷且體質健壯的紅劍尾魚作為實驗魚。正式實驗前，對劍尾魚進行為期2周的馴化，水溫(26±0.5) ℃，溶解氧≥5 mg·L-1，24 h曝氣，14 h光/10 h暗周期，每天投喂2次(上午9:00和下午17:00)，投喂的飼料為寸金牌商品飼料，每天投喂量為魚體質量的3%，每3天更換1次水。

1.2 實驗設計與組織樣本處理

實驗分為3個組，分別為對照組(無微塑料顆粒)、1×106microspheres·L-1、1×107microspheres·L-1，每組3個平行，每個平行中25條劍尾魚。暴露前配制各組微塑料溶液，并進行超聲波處理，確保微塑料顆粒均勻分布在水中，并記錄水位，每天加入曝氣后的自來水至刻度線，防止水分蒸發(fā)帶來的實驗誤差，暴露期間的環(huán)境與馴養(yǎng)時保持一致，72 h暴露后使用魚用麻醉劑進行麻醉，在超凈工作臺內用蒸餾水沖洗魚體3次后置于冰上進行解剖取肝臟，組內隨機選6條魚的肝臟混合為一個樣本，每組3個重復，置于液氮中保存，隨后進行代謝組學實驗。

代謝組學實驗開始前，取肝臟樣本在液氮中研磨，每樣稱取100 mg，加入200 μL預冷水和800 μL預冷的甲醛/乙腈(1∶1，V∶V)，混勻，冰浴中超聲60 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，于4 ℃、16 000 r·min-1離心20 min，取上清。上清在高速真空濃縮離心機揮干。質譜檢測時加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1，V∶V)復溶，于4 ℃、14 000 r·min-1離心15 min，取上清液進樣分析。

1.3 代謝物提取與液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC-MS)分析

整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中，樣品采用超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)(美國Agilent公司，Agilent 1290 Infinity LC)使用HILIC色譜柱進行分離，進樣量5 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL·min-1；色譜流動相A為水+25 mmol·L-1乙酸銨+25 mmol·L-1氨水，B為乙腈；色譜梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%乙腈；0.5～7 min，乙腈從95%線性變化至65%；7～9 min，乙腈從65%線性變化至40%；9～10 min，乙腈維持在40%；10～11.1 min，乙腈從40%線性變化至95%；11.1～16 min，乙腈維持在95%。樣本隊列中插入質控(QC)樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性。每例樣品分別采用電噴霧電離(ESI)進行正離子和負離子模式檢測。樣品經(jīng)UPLC分離后用Triple-TOF 5600質譜儀(AB SCIEX)進行質譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)預處理與代謝物識別

代謝組學原始數(shù)據(jù)經(jīng)Abf Converter轉換成abf格式，然后采用MSDIAL程序中的XCMS進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對提取得到的數(shù)據(jù)，刪除缺失值>50%的離子峰，整合正負離子峰并應用軟件SIMCA-P14.1進行模式識別，數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預處理后，將正負離子合在一起進行多維統(tǒng)計分析，包括無監(jiān)督主成分分析(PCA)，有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。代謝物結構鑒定采用精確質量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級譜圖匹配的方式，檢索Mass Bank公共數(shù)據(jù)庫。差異代謝物通過單變量分析中的差異倍數(shù)(fold change)和P值進行篩選，選擇FC>1.5或FC<0.667且P<0.05的代謝物作為差異代謝物。

2 結果(Results)

2.1 微塑料暴露后劍尾魚肝臟代謝物譜圖分析

對1×106microspheres·L-1組與對照組和1×107microspheres·L-1組與對照組之間進行PCA分析與OPLS-DA分析，判別各組間是否具有統(tǒng)計學差異，每組6個樣本。PCA分析結果顯示，1×106microspheres·L-1和1×107microspheres·L-1濃度組與對照組均未呈現(xiàn)出明顯的分散趨勢(圖1(a)和(b))，說明微塑料對肝臟代謝具有一定潛在影響。因而引入有監(jiān)督的多元統(tǒng)計分析方法，即OPLS-DA分析(圖1(c)和(d)，圖1(c)R2X=0.426,Q2=0.0558;圖1(d)R2X=0.391,Q2=0.314，R2表示模型累計方差值，反映該模型的擬合程度，Q2表示累計交叉的有效性，反映該模型的預測能力)，由于R2<0.5和Q2<0.5，模型的穩(wěn)定性較差，無法使用OPLS-DA模型進行差異代謝物的篩選，因此使用單變量分析以篩選差異代謝物，實驗中所有數(shù)據(jù)均處于95%置信區(qū)間內。

圖1 微塑料暴露后對照組與實驗組之間的PCA與OPLS-DA得分圖注：(a)和(b)代表1×106 microspheres·L-1組和1×107 microspheres·L-1與對照組之間的PCA圖，(c)和(d)代表1×106 microspheres·L-1組和1×107 microspheres·L-1組與對照組之間的OPLS-DA圖；圖中A代表對照組，B代表1×106 microspheres·L-1組，C代表1×107 microspheres·L-1組，下同。Fig.1 After the microplastics exposure,the PCA and OPLS-DA scores between the control group and the 1×106 microspheres·L-1 experimental group and the 1×107 microspheres·L-1 experimental groupNote:(a),(b) represent the PCA chart between the 1×106 microspheres·L-1 group,the 1×107 microspheres·L-1 group and the control group,(c),(d) represent the OPLS-DA chart between the 1×106 microspheres·L-1,the 1×107 microspheres·L-1 group and the control group;in the figure,A represents the control group,B represents the 1×106 microspheres·L-1 group,and C represents the 1×107 microspheres·L-1 group;the same below.

2.2 微塑料暴露后劍尾魚肝臟中差異代謝物的鑒定與篩選

在1×106microspheres·L-1組中共鑒定出585種代謝物，在1×107microspheres·L-1組中共鑒定出583種代謝物。從上述代謝物中篩選出FC>1.5或FC<0.667且P<0.05的代謝物作為顯著差異代謝物。1×106microspheres·L-1組與對照組相比，篩選出28種顯著差異代謝物，其中3種代謝物顯著上調，25種代謝物顯著下調(圖2(a))。對這28種顯著代謝物進行聚類分析，如圖3(a)所示。這28種差異代謝物中有6種代謝物在KEGG網(wǎng)站上可以查詢到對應的KEGG ID(表1)。1×107microspheres·L-1組與對照組相比，篩選出26種顯著差異代謝物，其中11種代謝物顯著上調，15種代謝物顯著下調(圖2(b))，之后對這26種顯著差異代謝物進行聚類分析，如圖3(b)所示。26種顯著差異代謝物中有8種代謝物在KEGG網(wǎng)站上可以查詢到對應的KEGG ID(表1)。

圖2 微塑料暴露后對照組與實驗組之間差異代謝物火山圖Fig. 2 The difference metabolite volcano diagram between the control group and the 1×106 microspheres·L-1 and 1×107 microspheres·L-1 experimental group

圖3 微塑料暴露后對照組與實驗組之間顯著差異物的聚類分析注：顏色尺度代表代謝物表達水平，紅色和藍色分別表示上調和下調，(a)和(b)分別代表1×106 microspheres·L-1組和1×107 microspheres·L-1組與對照組之間的聚類分析。Fig.3 Cluster analysis of significant differences between the control group and the 1×106 microspheres·L-1 and 1×107 microspheres·L-1 experimental groupNote:The color scale represents the expression level of metabolites,and red and blue indicate up-regulation and down-regulation respectively,(a) and (b) represent the cluster analysis 1×106 microspheres·L-1 group vs control group and 1×107 microspheres·L-1 group vs control group.

表1 不同濃度微塑料暴露后劍尾魚肝臟中的顯著性差異代謝物Table 1 Significantly different metabolites in the liver of swordtail fish after exposure to different concentrations of microplastics

2.3 微塑料暴露后劍尾魚肝臟中差異代謝物的代謝途徑分析

為了解微塑料暴露對劍尾魚肝臟代謝通路的影響，將篩選出具有代謝通路的顯著差異代謝物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫中進行代謝通路富集，在1×106microspheres·L-1組中，共富集出16條代謝通路，在1×107microspheres·L-1組中，富集出19條代謝通路，在這里，選取富集排名前10位的代謝通路制作成氣泡圖(圖4)，在1×106microspheres·L-1組中排名前10位的代謝通路分別是硫胺素代謝、硫代謝、氧化磷酸化、溶酶體、谷胱甘肽代謝、半乳糖代謝、藥物代謝、β-丙氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、心肌細胞中腎上腺素能信號(圖4(a))。在1×107microspheres·L-1組中富集排名前10位的代謝通路分別是硫代謝、鞘脂代謝、初級膽酸汁生物合成、泛酸與輔酶A的生物合成、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、半乳糖代謝、咖啡因代謝、丁酸代謝和β-丙氨酸代謝(圖4(b))。

圖4 各實驗組顯著差異物的代謝通路富集分析圖注：(a) 在1×106 microspheres·L-1組中富集前10位的代謝通路，(b) 在1×107 microspheres·L-1組中富集前10位的代謝通路，每個圖形為一個代謝通路，縱坐標代表通路名稱，橫坐標表示富集率，公式為(富集率=代謝物數(shù)量/代謝物總數(shù)量)，圖形越大表示差異代謝物的數(shù)目越多；顏色表示富集的顯著性即P值，紅色越深表示該通路越顯著富集，右側顏色梯度表示P值。Fig.4 Metabolic pathway enrichment of differential metabolitesNote:(a) The top 10 metabolic pathways enriched in the 1×106 microspheres·L-1 group,(b) The top 10 metabolic pathways enriched in the 1×107 microspheres·L-1 group;each dot figure is a metabolic pathway,and the ordinate represents the name of the pathway;the abscissa represents the rich factor,and the formula is (Rich factor = Metabolite count/Pathway pop hits);the larger the dot,the larger the number of different metabolites;the color indicates the significance of enrichment,that is,the P value;the darker the red,the more the pathway is significantly enriched,and the color gradient on the right represents the P value.

3 討論(Discussion)

隨著塑料垃圾的劇增，環(huán)境中的微塑料數(shù)量將會隨之劇增，已有研究表明微塑料會對水生生物造成諸多不良影響。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)即便是72 h的微塑料暴露同樣對劍尾魚肝臟的代謝水平造成影響。

在對劍尾魚肝臟的代謝物的測定中，發(fā)現(xiàn)1×106microspheres·L-1組中篩選出的代謝物主要包括糖類和氨基酸等6種代謝物，共涉及16條代謝通路。表達水平受到干擾的代謝物主要是關于細胞能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝、炎癥反應和氧化應激反應。在1×107microspheres·L-1組中，篩選出8種代謝物涉及19條代謝通路，這些代謝物主要是關于能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝、炎癥反應、氧化應激、脂代謝和神經(jīng)毒性。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)微塑料會誘導代謝失衡，例如，微塑料會誘導與氧化應激[29-31]、能量代謝與糖代謝[20,32]、氨基酸和脂代謝[26,33]有關代謝物的代謝圖譜發(fā)生改變。在本實驗中，1×106microspheres·L-1組中的二苯亞砜和亞精胺，1×107microspheres·L-1組中的膽紅素、黃嘌呤、?；撬岷蚻-5-氧脯氨酸這些均屬于抗氧化應激類代謝物，說明微塑料暴露對劍尾魚肝臟產(chǎn)生了氧化應激，這一結果在抗氧化酶活性測定的結果中也有所體現(xiàn)。此外，1×106microspheres·L-1組中D-甘露糖、1-磷酸葡萄糖、腎上腺素和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，1×107microspheres·L-1組中的蘋果酸、1-磷酸葡萄糖和?；撬徇@些物質均屬于能量代謝與糖代謝，據(jù)此推測微塑料對劍尾魚肝臟中的糖代謝與能量代謝造成了干擾，微塑料干擾糖代謝與能量代謝主要有3種原因，第1種是Ory等[34]在研究中發(fā)現(xiàn)的水體中的微塑料被魚類誤食，占據(jù)了消化系統(tǒng)中原有食物的空間，然后微塑料以“假糞”的形式排出體外，間接造成了饑餓營養(yǎng)不良的現(xiàn)象。第2種是Yin等[12]研究發(fā)現(xiàn)微塑料導致了魚類行為發(fā)生改變，減少了攝食量，進而影響了營養(yǎng)儲備與能量代謝。第3種是微塑料改變了魚類的腸道微生物，最終導致了能量代謝發(fā)生改變[28]。這里我們更傾向于第1種解釋，因為在本研究結果中發(fā)現(xiàn)，1×106microspheres·L-1組中1-磷酸葡萄糖在肝臟中顯著下調，但是在1×107microspheres·L-1組中的表達變?yōu)轱@著上調(P<0.01)，這有可能是1×107microspheres·L-1組中劍尾魚過多誤食了微塑料，導致短時間饑餓現(xiàn)象，激活了葡萄糖合成基因的表達，進而導致肝臟中1-磷酸葡萄糖表達顯著上調[35]，但是仍需進一步實驗來進行驗證我們的猜測。值得注意的是，在1×107microspheres·L-1組中?；撬岷虳-泛酸這2種代謝物受到干擾，牛磺酸在肝臟中的主要作用是與膽汁酸結合形成脂肪吸收所必須的牛黃膽酸[36]，而D-泛酸(維生素B5)屬于維生素代謝，是生物體內合成輔酶A的原料，而輔酶A是動物糖代謝、蛋白質代謝與脂代謝必不可少的物質[37]，牛磺酸與D-泛酸代謝受到干擾或許會間接干擾劍尾魚肝臟的脂代謝。此外發(fā)現(xiàn)1×107microspheres·L-1組中的L-絲氨酸顯著下調，L-絲氨酸屬于絲氨酸代謝中的代謝物，而L-絲氨酸可能與?；撬釋︴庺~體內神經(jīng)元的保護有關[38]，另有研究表明L-絲氨酸缺乏會導致神經(jīng)毒性[39]，從代謝物角度推測，微塑料可能會通過L-絲氨酸的下調引起神經(jīng)毒性，但是已有的研究表明，微塑料造成脂質氧化與干擾乙酰膽堿酶是誘導神經(jīng)毒性的原因[20,32]。因此仍需進一步驗證微塑料導致L-絲氨酸的下調是否會導致神經(jīng)毒性。

本研究對不同濃度微塑料暴露72 h后的劍尾魚肝臟中抗氧化酶活性與代謝物進行測定，發(fā)現(xiàn)微塑料干擾了劍尾魚肝臟中抗氧化酶活性。從生物信息學角度對劍尾魚肝臟中顯著差異代謝物分析發(fā)現(xiàn)，1×106microspheres·L-1的微塑料干擾了劍尾魚肝臟中的能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝、炎癥反應和氧化應激反應。1×107microspheres·L-1的微塑料干擾了劍尾魚的能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝、炎癥反應、氧化應激、脂代謝并有可能引起劍尾魚神經(jīng)毒性。根據(jù)篩選出的差異代謝物的數(shù)量以及富集到的代謝通路數(shù)量可以看出，1×107microspheres·L-1的微塑料對劍尾魚肝臟造成了更嚴重的干擾。因此，環(huán)境中增加的塑料垃圾更應引起人們的重視并加以治理。