張 瑩,趙 婷，馬 靜

(解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京100853)

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)是溶質(zhì)載體16(SLC16)家族成員，對(duì)于短鏈單羧酸鹽、激素、營養(yǎng)素和氨基酸的運(yùn)輸至關(guān)重要。MCT家族共有16個(gè)成員，分別是MCT1-14和2個(gè)鈉離子依賴的MCT成員SMCTs 1/2,SLC5A8/12。MCT 1-4 是質(zhì)子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)于糖酵解產(chǎn)物(如乳酸和丙酮酸)以及酮體(如乙酰乙酸和β-羥基丁酸)的跨膜運(yùn)輸發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。生理?xiàng)l件下MCT1-4協(xié)同形成乳酸穿梭系統(tǒng)，維持糖酵解細(xì)胞和氧化細(xì)胞之間的乳酸穩(wěn)態(tài)。從糖酵解細(xì)胞輸出的乳酸被氧化細(xì)胞吸收用于有氧代謝，例如骨骼肌中的白色糖酵解細(xì)胞和紅色氧化細(xì)胞之間以及大腦中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的乳酸穩(wěn)態(tài)[2]。研究表明MCT1/2/4參與腫瘤的代謝過程[3]，糖酵解(glycolytic)型癌細(xì)胞依靠糖酵解來適應(yīng)低氧環(huán)境，分解葡萄糖排出乳酸，而氧化型(oxidative)癌細(xì)胞則攝取糖酵解癌細(xì)胞分泌的乳酸作為能量來源，這是一種“代謝共生”現(xiàn)象，其中MCT1、4發(fā)揮最重要的作用[4]。除了直接參與代謝外，乳酸能夠作為一種信號(hào)分子刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生[5]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受[6]等。

目前針對(duì)MCT1已有相應(yīng)的抑制劑，例如AZD3965、BAY-8002和7ACC2等，其中AZD3965正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。而MCT4尚無有效的抑制劑，本文利用大腸桿菌生物合成MCT4的siRNA并初步驗(yàn)證了其抑制作用。

1 材料與方法

1.1 利用大腸桿菌表達(dá)siRNA

以大腸桿菌tRNA為支架，將MCT4siRNA前體序列插入tRNA的環(huán)形序列中，形成帶有MCT4前體發(fā)卡狀siRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，插入原核表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC純化后用于后續(xù)研究(圖1)。MCT4siRNA序列，Sense:CGAGACAACGUGACUUUAATT,Antisense:UUAAAG-UCACGUUGUCUCGTT。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780為本室保存，經(jīng)STR鑒定正確。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(GIBCO,NY,USA)和1%的青鏈霉素(GIBCO,NY,USA)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,NY,USA)中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin2000(Invitrogen，CA，USA)。

1.3 RNA分離和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)

使用總RNA試劑盒提取試劑盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA，并使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)生成互補(bǔ)DNA(cDNA)。定量RT-PCR利用SYBR Green PCR master mix(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃10min，然后95℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min循環(huán)30次，以GAPDH作為PCR產(chǎn)物定量和標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照。引物序列，MCT4-上游:5’-CAGTTCGAGGTGCTCATGG-3’，MCT4-下游:5’-ATGTAGACGTGGGTCGCATC-3’;GAPDH-上游:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’ GAPDH-下游:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。

1.4 Western blot

用RIPA裂解緩沖液(白鯊生物，合肥)制備細(xì)胞提取物，并在4℃下以13 000×g離心30 min。然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore Corporation,MA,USA)。在室溫下用5%牛奶封閉1小時(shí)后，4℃下用一抗孵育膜過夜。然后與HRP結(jié)合的二抗孵育，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞活力測(cè)定

將MCT4siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，在24、48、72及96小時(shí)后使用CCK8檢測(cè)試劑盒(Bimake，TX，USA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)。每個(gè)孔中的細(xì)胞在37℃下與10 μl CCK8工作溶液孵育2小時(shí)。使用Epoch微孔板讀取器(BIO-TEK,VT,USA)測(cè)量每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。

1.6 代謝分析

細(xì)胞經(jīng)siRNA處理后，裂解，上清使用葡萄糖分析試劑盒(Biovision,CA，USA)測(cè)定葡萄糖攝取量。用乳酸測(cè)定試劑盒(Biovision,CA，USA)檢測(cè)細(xì)胞乳酸含量。使用細(xì)胞耗氧量檢測(cè)kit細(xì)胞(BD Biosciences,San Jose,CA)的耗氧率，所有操作按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)值表示，使用GraphPadPrism v8.0軟件進(jìn)行處理。治療組與對(duì)照組之間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物合成的MCT4siRNA制備

將MCT4的siRNA前體插入tRNA骨架后形成tRNA-siRNA結(jié)構(gòu)，命名為Bio-siMCT4 ，設(shè)計(jì)及生產(chǎn)流程如圖1所示。Bio-siMCT4在大腸桿菌合成后經(jīng)HPLC純化可以獲得高純度的 siRNA(圖2)，產(chǎn)量為1.6 mg/L。

圖1 生物合成的MCT4siRNA制備流程

圖2 生物合成的MCT4siRNA純化

2.2 生物合成的MCT4 siRNA能有效抑制MCT4的表達(dá)

Bio-siMCT4轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)MCT4的表達(dá)，RT-PCR和Western blot顯示Bio-siMCT4能有效降低 MCT4的核酸和蛋白水平，與化學(xué)合成的siRNA相比具有更高的效率(圖3)。

圖3 Bio-siMCT4對(duì)MCT4的抑制作用

2.3 生物合成的MCT4 siRNA抑制卵巢癌細(xì)胞的糖酵解及細(xì)胞增殖作用

將MCT4siRNA轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞中，檢測(cè)葡萄糖攝取、糖酵解速率、乳酸生成以及細(xì)胞耗氧量，以評(píng)估卵巢癌細(xì)胞的糖酵解及氧化磷酸化水平。結(jié)果顯示生物及化學(xué)合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌細(xì)胞的糖酵解，促進(jìn)細(xì)胞的氧化磷酸化，但是生物合成的siRNA效果更好(圖4)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明生物及化學(xué)合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，生物合成的siRNA效果更好(圖5)。

圖4 Bio-siMCT4對(duì)卵巢癌細(xì)胞糖酵解的抑制作用

圖5 Bio-siMCT4對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用

3 討論

核酸藥物是重要的一類生物藥物，能夠作用于基因、轉(zhuǎn)錄本、蛋白質(zhì)、小分子，特別是對(duì)于傳統(tǒng)藥物難以成藥的靶點(diǎn)具有重要的價(jià)值。RNA藥物種類主要有mRNA、小RNA、反義核酸及RNA適配體等。mRNA疫苗在新型冠狀病毒的防疫中發(fā)揮了極為重要的作用[7]，其也可以通過編碼治療蛋白抗原用以免疫細(xì)胞治療。小RNA包括siRNA、MiRNA，與反義核酸作用類似，主要用于抑制致病性RNA活性。RNA適配體能夠結(jié)合蛋白質(zhì)，發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白活性的作用。Pegaptanib作為結(jié)合VEGF的RNA適配體在2004年獲批上市用于治療老年濕性黃斑變性(Neovascular AMD)，是第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的核酸藥物[8]。此后靶向ApoB100、肌萎縮蛋白dystrophin51外顯子、脊髓性肌萎縮致病基因SMN2及TTR基因用于高脂血癥(HoFH)、假性肥大型肌營養(yǎng)不良(DMD)、脊髓性肌萎縮癥(SMA)及hATTR淀粉樣變性的寡核苷酸藥物Mipomersen[9]、Eteplirse[10]、Nusinersen[11]和Inotersen[12]獲批上市。隨著siRNA技術(shù)的發(fā)展，siRNA藥物也得到迅速發(fā)展，目前已有三種siRNA藥物獲得FDA批準(zhǔn)，分別是靶向羥基酸氧化酶1(HAO1)治療原發(fā)性高草酸尿癥1型(PH1)的Lumasiran[13]，靶向氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)用于治療急性肝卟啉癥(AHP)的Givosiran[14]以及靶向TTR基因用于治療hATTR淀粉樣變性的Patisiran[15]。

核酸藥物在早期并不為人們所重視，主要原因是RNA藥物成本高、容易降解，半衰期短。小RNA及寡核苷酸藥物通常是化學(xué)合成，通過堿基修飾提高藥物的穩(wěn)定性，利用納米材料提高其半衰期及靶向性。生物合成的小RNA技術(shù)將小RNA前體插入核糖體tRNA支架中，在大腸桿菌表達(dá)，由于tRNA在大腸桿菌表達(dá)豐度極高，可以高效表達(dá)小RNA前體。tRNA-siRNA進(jìn)入細(xì)胞后siRNA前體經(jīng)切割形成活性RNA從而發(fā)揮作用。與化學(xué)合成的siRNA相比，生物合成的siRNA成本極低，未經(jīng)過體外修飾，活性更好，具有良好的應(yīng)用前景[16]。本實(shí)驗(yàn)選擇卵巢癌的MCT4作為藥物靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)、表達(dá)合成了針對(duì)該分子的生物合成的siRNA，結(jié)果顯示Bio-siMCT4能夠顯著抑制MCT4在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，并顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的糖酵解水平和細(xì)胞增殖。與化學(xué)合成的siRNA相比，Bio-siMCT4具有更好的活性。實(shí)驗(yàn)表明，生物合成的MCT4siRNA對(duì)于卵巢癌細(xì)胞具有良好的治療作用，具有新RNA藥物的成藥潛質(zhì)。