劉立杰，銀 英，白立立，張小陸，霍新龍，于曉麟，顧 濤，賈洪菊，張 雙，華海俠

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島066000)

放射治療是肺癌患者的主要治療手段之一，可以提高腫瘤的局部控制率。但由于肺是射線敏感器官，其組織細(xì)胞容易受到輻射的損壞[1]從而可以引發(fā)放射性肺損傷(RILI)。RILI的發(fā)病機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、肺泡及內(nèi)皮細(xì)胞損傷等有關(guān)[2]。在體外研究中，細(xì)胞外組蛋白可損傷內(nèi)皮細(xì)胞[3]、刺激細(xì)胞因子的釋放[4]，并可以誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的形成和髓過(guò)氧化物酶的釋放。因此，推測(cè)細(xì)胞外組蛋白可能作為促炎介質(zhì)在RILI的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。本研究擬通過(guò)收集接受胸部放療的肺癌患者并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，測(cè)定細(xì)胞外組蛋白及相關(guān)炎癥因子以分析其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月-2020年12月在本院首次診斷并進(jìn)行放射治療的75例Ⅰ-ⅢB期肺癌患者進(jìn)行分析。男性41例，女性34例，年齡45-72歲，中位年齡58歲。按組織病理類型分類：49例NSCLC，26例SCLC。按患者臨床TNM分期分類：19例Ⅰ-Ⅱ期，22例ⅢA期，34例ⅢB期。入組患者中36例進(jìn)行同步或序貫化療。本研究獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理證實(shí)臨床分期為Ⅰ-Ⅲ期的原發(fā)性肺癌患者。(2)此前未接受過(guò)胸部手術(shù)、放療或化學(xué)藥物治療。(3)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>6個(gè)月。(4)卡氏功能狀態(tài)(KPS)評(píng)分≥70分。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)放療未完成或者放療中未按照規(guī)定安排(5F/W)進(jìn)行治療的患者。(2)隨訪時(shí)間未滿6個(gè)月或者死亡者。(3)KPS評(píng)分<70分。

1.2 放射治療

所有入組患者放療前已完成病史采集和體格檢查，行血常規(guī)、肝腎功能等檢驗(yàn)已確定無(wú)放療禁忌。將患者經(jīng)CT模擬定位后的圖像傳輸至瓦里安治療系統(tǒng)，醫(yī)師在CT定位圖像上使用肺窗及縱隔窗逐層勾畫靶區(qū)，放療方式采用調(diào)強(qiáng)放射治療，放療劑量54Gy-66Gy，中位劑量60Gy。處方劑量2Gy/次，1次/日，5次/周。

1.3 方法

于放療前1天、放療后第1天，第1、3、5周時(shí)抽取患者空腹外周靜脈全血3-5 ml，4℃靜止低溫冷藏于EDTA 抗凝管中。樣本處理：標(biāo)本采集1 h內(nèi)，3 000 r/min離心10 min。后將上清液提取至Eppendorf管內(nèi)，-80℃冰箱保存。

采用ELISA方法測(cè)定血清細(xì)胞外組蛋白水平，采用化學(xué)比色法檢測(cè)血清髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，采用ELISA方法測(cè)定血清LDH含量，采用Luminex方法測(cè)定血清中多項(xiàng)細(xì)胞因子。細(xì)胞外組蛋白ELISA測(cè)定試劑盒及MPO、LDH試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；Luminex檢測(cè)系列細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自美國(guó)Affymetrix eBioscience。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

常規(guī)培養(yǎng)人肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)和人單核細(xì)胞系(U937)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合度之后，將RILI組患者放療后1周血清按50%的比例添加，溫育培養(yǎng)24小時(shí)后取細(xì)胞上清液檢測(cè)LDH和炎癥因子。同時(shí)，一組細(xì)胞給予特異性抗組蛋白H4抗體(20 μg/ml)進(jìn)行干預(yù)。

1.5 RILI評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

按照美國(guó)放射治療腫瘤協(xié)作組(RTOG)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)，根據(jù)臨床癥狀、胸部X線片、胸部CT和肺功能喪失進(jìn)行評(píng)分，分成0-Ⅴ級(jí)。評(píng)分包括三個(gè)主觀量表和兩個(gè)客觀量表。主觀評(píng)分包括咳嗽、呼吸困難和胸痛。客觀量表包括胸部X線片和胸部CT以及肺功能測(cè)試。Ⅰ級(jí)及以上即定義為RILI。

1.6 隨訪及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組資料比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用中位數(shù)及四分位數(shù)表示，應(yīng)用秩和檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RILI發(fā)生率情況

75例肺癌患者中，發(fā)生RILI 17例，發(fā)生率為22.67%。17例RILI患者的發(fā)生時(shí)間為放射治療后1-6個(gè)月，中位時(shí)間為3.5個(gè)月。

2.2 肺癌患者放療后細(xì)胞外組蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化

與非RILI組相比，RILI組患者各時(shí)間點(diǎn)血清細(xì)胞外組蛋白水平(μg/ml) 總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨時(shí)間變化，細(xì)胞外組蛋白水平逐漸升高，1w達(dá)高峰(52.34±1.03) μg/ml，3w、5w保持高水平。見圖1。

圖1 RILI組、非RILI組不同時(shí)間血清細(xì)胞外組蛋白水平變化

2.3 肺癌患者放療后LDH、MPO水平的動(dòng)態(tài)變化

與非RILI組相比，RILI組患者各時(shí)間點(diǎn)LDH活性(U/L)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨時(shí)間變化，LDH活性在放療后1 d即開始升高(178.75±1.07)U/L，1w、3w、5w繼續(xù)保持在高水平。見圖2。

圖2 RILI組、非RILI組不同時(shí)間LDH活性變化規(guī)律

與非RILI組相比，RILI組患者各時(shí)間點(diǎn) MPO活性(U/L)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨時(shí)間變化，MPO活性逐漸升高，3w達(dá)高峰(50.24±0.35)U/L，5w仍持續(xù)較高水平(圖3)。

圖3 RILI組、非RILI組不同時(shí)間MPO活性變化規(guī)律

2.4 肺癌患者放療后細(xì)胞因子水平的動(dòng)態(tài)變化

與非RILI組相比，RILI組患者6種細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1和TNF-α)水平(pg/ml)均升高，并且在1-5w達(dá)高峰，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 RILI組、非RILI組不同時(shí)間6種細(xì)胞因子水平變化

2.5 細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)炎性損傷的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將放療前患者血清作為對(duì)照組，放療組LDH活性(U/L)明顯升高(238.03±1.02)U/L；與放療組相比，抗體干預(yù)組LDH活性則明顯降低(136.73±1.17)U/L，但仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 特異性抗組蛋白中和抗體拮抗放療后患者血清對(duì)人肺上皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)

與對(duì)照組相比，放療組6種細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1和TNF-α)水平(pg/ml)顯著升高；與放療組相比，抗體干預(yù)組細(xì)胞因子水平則顯著降低，但仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 特異性組蛋白中和抗體拮抗放療后患者血清對(duì)人U937細(xì)胞的細(xì)胞因子生成影響

3 討論

RILI是肺癌患者放射治療中常見的劑量限制性并發(fā)癥，早期主要表現(xiàn)為放射性肺炎，晚期則表現(xiàn)為不可逆肺纖維化[6]。盡管近年來(lái)放療技術(shù)在不斷進(jìn)步，但RILI在肺癌放療患者中的發(fā)病率仍高達(dá)5%-25%，兼其防治措施有限，已經(jīng)成為了放射劑量區(qū)域、腫瘤控制率等的限制性因素，是影響患者治療效果及預(yù)后的重要因素，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者死亡[7-9]。在RILI復(fù)雜多樣的發(fā)病機(jī)制中，炎癥占有重要地位。射線可通過(guò)細(xì)胞凋亡、壞死等引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[10]，從而激活細(xì)胞外損傷相關(guān)分子模式(DAMP)分子的釋放。DAMP分子在體內(nèi)積聚并活化天然免疫細(xì)胞，引發(fā)不同的模式識(shí)別受體，如Toll樣受體和炎癥因子，繼而導(dǎo)致炎癥[11]。經(jīng)射線照射后受損的上皮細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子[12]，這些因子在受輻射的肺組織中放大炎癥反應(yīng)并觸發(fā)成纖維細(xì)胞活化與增殖，從而導(dǎo)致膠原沉積及慢性纖維化[13-14]。

組蛋白是高度保守的核內(nèi)堿性陽(yáng)離子蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)含量豐富且恒定，主要包括5種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4[15]。組蛋白在染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激狀態(tài)時(shí),免疫細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以檢測(cè)到組蛋白，其以一種細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的方式從活化的免疫細(xì)胞中釋放,該網(wǎng)是由中性粒細(xì)胞染色體成分和其他的抗菌蛋白所構(gòu)成的纖維,發(fā)揮到捕獲與降解入侵微生物的作用[17]。但是，逐漸增多的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)可以形成一種免疫細(xì)胞死亡的方式,該獨(dú)特的方式被稱為“NETosis”[18]。另外,細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)降解，核內(nèi)組蛋白也可以被釋放至細(xì)胞外成為細(xì)胞外組蛋白[19]，通常和吞噬作用受損有關(guān)[20]。研究表明，細(xì)胞外組蛋白直接具有細(xì)胞毒性[21]或作為DAMP分子通過(guò)刺激免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等)，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)[3，22]。因此，本研究旨在探討細(xì)胞外組蛋白與放療相關(guān)炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。

在本研究中，觀察到放療后患者血清細(xì)胞外組蛋白水平明顯增加，同時(shí)出現(xiàn)免疫細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子及MPO水平升高均提示了放療后肺癌患者細(xì)胞外組蛋白與免疫細(xì)胞活化及大多數(shù)炎性細(xì)胞因子之間存在的明確的相關(guān)性。這與之前公布的數(shù)據(jù)一致[23]。此外，通過(guò)研究進(jìn)一步闡述細(xì)胞外組蛋白的病理作用，結(jié)果提示放療后患者血清能直接誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷和促進(jìn)U937細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞外組蛋白相關(guān)炎性細(xì)胞因子顯著增加；而特異性抗組蛋白H4抗體則可以明顯抑制這一損傷效應(yīng)，從而證實(shí)了細(xì)胞外組蛋白與放療相關(guān)的全身性炎癥之間的因果關(guān)系?；谘芯坑^察，可以得出RILI的可能發(fā)病機(jī)制：放療導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡和免疫細(xì)胞活化，從而釋放細(xì)胞外組蛋白，進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)炎性損傷。近年來(lái)，以細(xì)胞外組蛋白為靶點(diǎn)的保護(hù)措施亦是研究熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，特異性抗組蛋白H3、H4抗體[4，24],組蛋白阻斷劑如活化蛋白C[25]及肝素[26]可以有效拮抗細(xì)胞外組蛋白的毒性作用?？梢?，若能將細(xì)胞外組蛋白阻斷，中和或降解其細(xì)胞毒性作用，將有望從更深層面控制炎癥的發(fā)生發(fā)展，為臨床探索開辟一個(gè)新的方向。

總之，本研究結(jié)果揭示了細(xì)胞外組蛋白與全身性炎癥之間的關(guān)系。細(xì)胞外組蛋白可以作為反映放療相關(guān)系統(tǒng)性炎癥的生物標(biāo)志物。