許 卓,楊壽君,石洪峰,王月英,平澤惠理

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.日本東京順天堂大學老人疾患研究中心)

肌少癥(sarcopenia)又稱“肌肉減少癥”，由Rosenberg于1989年首次命名。國際肌少癥工作組將肌少癥定義為與增齡相關的進行性、全身肌量減少和(或)肌強度下降或肌肉生理功能減退[1]。大量研究表明，老年人群骨折與肌量減少、肌力下降、跌倒增加、骨量減低密切關聯(lián)。對患者生活質量及生存時間均造成嚴重影響，已成為威脅公眾健康的重要疾病之一。

細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)為肌肉衛(wèi)星細胞再生、增殖、分化提供重要的細胞外環(huán)境[2]，基底膜蛋白聚糖(perlecan)作為細胞外基質主要的硫酸肝素類蛋白聚糖之一，廣泛存在于神經(jīng)肌肉接合部，在肌肉細胞增殖過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用[3-4]。肌肉生長抑制素(myostatin)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)分別作為肌肉增殖的抑制因子和促進因子在肌肉再生、增殖、分化過程中具有重要調控作用[5-6]。本研究旨在觀察perlecan對肌肉萎縮相關分子myostatin和IGF-1表達的影響，為明確perlecan在調節(jié)肌肉衛(wèi)星細胞增殖中的作用及機制提供證據(jù)，并為治療肌少癥提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 肌肉衛(wèi)星細胞培養(yǎng)及perlecan因子添加

采用Hashimoto等[7]介紹的單一肌纖維提取技術，從12周齡C57小鼠腓腸肌中培養(yǎng)原代肌衛(wèi)星細胞，用含2%馬血清(Invitrogen)和0.05%雞胚提取物(MP Biomedicals)的DMEM (Invitrogen)處理90%融合度的成肌細胞11天備用(見圖1)。然后將肌衛(wèi)星細胞分為實驗組和對照組，實驗組添加20ng /ml的perlecan因子，對照組添加同等劑量的正常培養(yǎng)液，同時進行30 min培養(yǎng)。

1.2 總蛋白提取

將perlecan刺激反應30 min后的兩組肌衛(wèi)星細胞回收制備提取物，緩沖液包括50 mM Tris(pH 7.6)，0.5%脫氧膽酸鈉，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。勻漿在4℃，10,000 ×g離心15 min，收集收集上清液用于Western blot分析。

1.3 Weston blot分析

檢測總蛋白樣本中Myostatin(1∶100)和其下游通路的smad2/3以及phospho-smad2；IGF-1和其下游通路的Akt以及抗磷酸化Akt蛋白的水平。采用蛋白定量試劑盒(Pierce BCA蛋白測定試劑盒);然后用合適的勻漿緩沖液將樣品稀釋到相同的濃度。用SDS-PAGE分離含24 μg總蛋白的樣品，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。轉移后，用Ponceau S染色，在白光下用化學發(fā)光探測器(Amersham Imager 600)掃描后，用含0.1% Tween-20的tris緩沖鹽水對膜進行脫色，用5%脫脂牛奶在相同的緩沖液中室溫封閉1小時。然后沖洗膜，在4℃下與一抗孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶結合的抗小鼠抗體在室溫下孵育1小時。免疫檢測采用化學發(fā)光試劑和化學發(fā)光探測器(Amersham成像儀600)。用ImageJ軟件[8]測量捕獲圖像中的波段強度。使用了以下抗體：抗myostatin(1∶100)、抗TGF-β抗體(1∶500)，抗smad2/3抗體(1∶1000)、抗phospho-smad2抗體(Ser465/467)(1∶100)；抗IGF-1(1∶200)、抗Akt抗體(1∶1000)、抗磷酸化Akt抗體(1∶1000)。

1.4 定量RT-PCR檢測

根據(jù)試劑盒說明書使用TRIzol試劑(Invitrogen)分別從實驗組和對照組的肌肉衛(wèi)星細胞中分離總RNA。1.5 μg總RNA，采用MMLV逆轉錄酶和oligo(dT)引物[9]生成cDNA，利用ABI PRISM 7500型快速序列檢測系統(tǒng)進行實時定量擴增，反應總體系為25 μl，并進行定量PCR樣本分析，以GAPDH作為內參。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 肌衛(wèi)星細胞形態(tài)學觀察

按照單一肌纖維提純法進行肌肉衛(wèi)星細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)第5天時可見衛(wèi)星細胞中呈梭形的細胞已貼壁生長，呈圓形細胞尚未貼壁(圖1A)。第7天時可見衛(wèi)星細胞基本已經(jīng)貼壁生長，并開始融合(圖1B)。第9天時培養(yǎng)細胞進一步增粗、變長，開始融合且呈方向性生長(圖1C)。第11天時細胞進一步融合形成許多長的肌管(圖1D)。

圖1 肌衛(wèi)星細胞形態(tài)學觀察

2.2 在肌衛(wèi)星細胞中，檢測myostatin和IGF-1及相關下游信號的蛋白免疫印記

2.2.1通過蛋白免疫檢測發(fā)現(xiàn)，perlecan添加組肌肉萎縮促進因子myostatin蛋白質表達量較對照組上升57%，肌肉萎縮抑制因子IGF-1蛋白質表達量較對照組下降31%，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示perlecan對肌肉萎縮相關因子myostatin及IGF-1表達具有顯著影響作用(見圖2)。

圖2 肌衛(wèi)星細胞Myostatin和IGF-1蛋白免疫印跡定量檢測(*P<0.05)

2.2.2對照組和添加組分別用10 ng/ml的Myostatin處理30 min。通過抗磷酸化Smad2 (Ser465/467)抗體免疫印跡分析激活的Smad2。用抗Smad2/3抗體復制相同的印跡。Myostatin在對照組和添加組中都能激活Smad信號，而在添加組中，Myostatin下游信號通路的Smad2磷酸化出現(xiàn)過度表達37%，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3)。

圖3 肌衛(wèi)星細胞中Smad信號通路磷酸化表達(*P<0.05)

2.2.3對照組和添加組用20 ng/ml的IGF-1處理30 min。通過抗磷酸化Akt抗體免疫印跡分析激活的Akt。用抗Smad2/3抗體復制相同的印跡。IGF-1在對照組和添加組中都能激活Akt信號通路，而在perlecan添加組中，發(fā)現(xiàn)IGF-1下游信號通路的Akt磷酸化表達水平降低63%，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4)。

圖4 肌衛(wèi)星細胞中Akt信號通路磷酸化表達(*P<0.05)

2.3 定量RT-PCR分析

通過定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，perlecan添加組和對照組myostatin和IGF-1的mRNA表達變化情況(圖5)。結果顯示，perlecan添加組肌肉萎縮促進因子myostatin的mRNA表達量較對照組上升13%，肌肉萎縮抑制因子IGF-1表達量較對照組下降9%，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖5)。

圖5 肌衛(wèi)星細胞Myostatin及IGF-1定量PCR檢測結果比較(*P<0.05)

3 討論

目前隨著社會的不斷老齡化，由于肌少癥造成的肌肉力量減弱，身體動態(tài)平衡和靜態(tài)平衡能力下降等臨床表現(xiàn)較常見，病理表現(xiàn)為肌肉體積縮小，肌纖維變細或消失。通常肌肉組織依靠肌肉細胞促進因子和抑制因子的相互制約協(xié)調維持其動態(tài)平衡，而這種平衡受到細胞外基質等微環(huán)境內的多種自分泌或旁分泌因子調節(jié)，其中perlecan作為細胞外基質的重要組成分子，因其廣泛存在于神經(jīng)肌肉結合部而在防治肌肉萎縮方面受到廣泛關注。

Perlecan是細胞外基質中硫酸肝素類蛋白聚糖之一，由核心蛋白和四條硫酸肝素(heparan sulfate，HS)側鏈組成，其核心蛋白含5個功能區(qū)，N 端附著有3條長的HS側鏈，核心蛋白功能區(qū)上還有一個HS側鏈的附著位點，可以通過四條硫酸肝素側鏈與相關細胞因子結合，從而影響細胞因子表達[10]。Perlecan作為一種穩(wěn)定基質結構和細胞-基質相互作用的黏合劑，能介導生長因子信號對細胞增生和分化的作用[11]。本實驗在體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細胞并添加Perlecan因子，經(jīng)蛋白免疫印跡定量分析及PCR檢測發(fā)現(xiàn)，添加perlecan因子能促使肌肉衛(wèi)星細胞中myostatin含量升高，同時使其下游Smad信號通路的磷酸化水平過表達。能夠使IGF-1含量降低，同時降低了其下游AKT信號通路的磷酸化表達水平。表明perlecan因子可能與肌肉萎縮促進因子myostatin呈正相關作用，與肌肉萎縮抑制因子IGF-1呈負相關作用，從而使perlecan在肌肉衛(wèi)星細胞增殖過程中起到重要的調控作用。

另外，Ning L等研究表明[12]，perlecan缺乏導致p70S6k和Akt磷酸化水平降低，AMPKα磷酸化水平升高，并且通過激活mTORC1通路抑制自噬過程，而這種自噬反應可能成為增強骨骼肌萎縮治療療效的新靶點。Satoshi等研究發(fā)現(xiàn)[13]，在去神經(jīng)支配過程中，perlecan通過激活FoxO信號和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，促進nNOS離域，刺激蛋白質降解和肌肉萎縮。這些研究都為perlecan因子在應用治療肌少癥方面提供了新的思路。

綜上所述，本研究結果表明perlecan因子對myostatin及IGF-1表達具有調控作用，其調節(jié)機制可能是其核心蛋白功能區(qū)上一個HS側鏈的附著位點上，通過四條硫酸肝素側鏈與myostatin和IGF-1兩個細胞因子相結合，從而影響細胞因子的表達。