陳 斌， 曾 昆， 吳琴燕， 楊 健， 顧鑫凱

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，極易在作物生長(zhǎng)、收獲及糧食儲(chǔ)藏過程中產(chǎn)生。在我國(guó)，由于人們的傳統(tǒng)飲食規(guī)律，谷物食用比例遠(yuǎn)高過西方國(guó)家，使得真菌毒素危害十分明顯。其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是從被禾谷鐮刀菌污染的玉米中分離出的一種真菌毒素，并且是糧食作物中常見的污染毒素之一，因其能夠引起嘔吐，故又稱嘔吐毒素。DON能夠直接污染農(nóng)作物，然后通過農(nóng)作物進(jìn)入到人或動(dòng)物體內(nèi)，能夠誘發(fā)嘔吐，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)厭食、胃腸炎、腹瀉、生長(zhǎng)緩慢，甚至還會(huì)產(chǎn)生免疫抑制或血液病等。有研究表明，90%感染真菌毒素的樣本里均含有DON。我國(guó)規(guī)定谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 mg/kg，聯(lián)合國(guó)食品添加劑專家委員會(huì)規(guī)定人體對(duì)DON及其衍生物每日最大耐受攝入量為1 μg/kg。郭紅衛(wèi)等在對(duì)我國(guó)河南地區(qū)及上海市赤霉病流行年份與非流行年份小麥中鐮刀菌污染情況進(jìn)行調(diào)査時(shí)，發(fā)現(xiàn)DON含量的中位數(shù)分別為933.0、14.2 mg/kg，遠(yuǎn)高于我國(guó)規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)真菌毒素檢測(cè)以儀器分析方法為主，包括高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，盡管靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但這些儀器分析均需要專業(yè)技術(shù)人員操作，且儀器設(shè)備成本高，前處理過程復(fù)雜，不能滿足大規(guī)模樣本快速分析需求。免疫分析方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)篩查，已廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域。

免疫分析方法是基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，結(jié)合酶、熒光物質(zhì)、納米顆粒等報(bào)告分子，輸出檢測(cè)信號(hào)。憑借高效催化作用、專一性等特點(diǎn)，酶在免疫分析方法中應(yīng)用最為廣泛，為高靈敏度分析方法的構(gòu)建提供了重要元件。借助納米顆粒、聚合物、抗原-抗體、生物素-親和素等系統(tǒng)，將多個(gè)酶共同組裝在一起而形成多酶顆粒，極大增加了單位反應(yīng)單元的酶數(shù)量，提高了檢測(cè)信號(hào)值，從而達(dá)到提升檢測(cè)靈敏度的目的。納米科技的發(fā)展為多酶顆粒的制備提供了多種可能，新型的納米材料，例如納米金顆粒(AuNPs)、碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)等，具有尺寸小、比表面積大、荷載量大等優(yōu)勢(shì)，可作為酶的載體，并且這些納米材料還可較好地保存酶的催化活性，避免在苛刻條件下酶活性的喪失。筆者所在研究組前期分別合成了基于AuNPs和CNTs的多酶顆粒，發(fā)現(xiàn)以CNTs為載體的顆粒能夠荷載更多的蛋白酶分子，具有更高的催化效率，并且對(duì)于免疫分析方法靈敏度的提升更為顯著。

本研究以CNTs為載體，荷載酶蛋白分子，構(gòu)建通用型的多酶信號(hào)顆粒，建立多酶輔助信號(hào)放大的DON免疫分析方法，并對(duì)市售谷物樣本進(jìn)行檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，可為谷物中DON的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)提供有力的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊抗鼠酶標(biāo)二抗(HRP labelled Goat anti-mouse antibody，GAM-HRP)，購(gòu)自美國(guó)Jacket公司；明膠和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超高純羧基化單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)，購(gòu)自江蘇先豐納米材料科技有限公司；DON單克隆抗體以及DON包被原 OVA-DON，購(gòu)自深圳市科捷實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；其他常規(guī)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

多功能酶標(biāo)儀(奧地利Infinite公司，Infinite M1000 PRO)；磁力攪拌器 (德國(guó)IKA公司，C-MAG HS4)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，5415D)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)DON的流程 在酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL適量稀釋的OVA-DON，4 ℃過夜；倒掉孔內(nèi)液體，拍干后每孔加入封閉液200 μL(PBS，0.01 mol/L，pH值7.4，含1%明膠)，37 ℃孵育2 h，倒掉孔內(nèi)液體，拍干；采用PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)將DON標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度，在每個(gè)孔中加入50 μL DON標(biāo)準(zhǔn)品，再加入 50 μL 經(jīng)過適度稀釋后的DON抗體，在37 ℃下孵育培養(yǎng)30 min；采用PBST(含0.5% Tween-20 PBS)洗滌3次并拍干，每個(gè)孔中加入100 μL適度稀釋后的GAM-HRP ，37 ℃下孵育30 min；PBST洗滌3次并拍干，后在每個(gè)孔中加入現(xiàn)場(chǎng)配制的TMB顯色液100 μL，37 ℃孵育10 min；最后每孔加入50 μL終止液(2 mol/L HSO)，并用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處吸光度。以DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的值，為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)，對(duì)應(yīng)的值，即最大值。計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC)、最低檢測(cè)限(IC)和檢測(cè)范圍(IC～I(xiàn)C)。

1.2.2 條件優(yōu)化

1.2.2.1 最適抗原抗體濃度優(yōu)化 通過使用棋盤法進(jìn)行研究，尋找抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。酶標(biāo)板每行包被不同濃度的OVA-DON，每孔加入 100 μL，4 ℃過夜；洗滌及封閉同“1.2.1”節(jié)；將DON抗體用PBS緩沖液分別稀釋至不同濃度，并依次加入至不同列孔板中，每孔100 μL，37 ℃孵育 30 min；其余洗滌、加入酶標(biāo)記物、顯色、終止等流程同“1.2.1”節(jié)。經(jīng)過試驗(yàn)，把陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照(Positive/Negative，P/N)≥2.1，且吸光度達(dá)約1.0時(shí)的抗原及一抗?jié)舛茸鳛樽罴逊磻?yīng)濃度，其中 P/N=(-)/(-)。

1.2.2.2 最適理化條件的優(yōu)化 (1)最適pH值：配制pH值分別為6.0、7.0、7.4、8.0 0.01 mol/L PBS緩沖液，采用上述緩沖液稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)平行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IC。(2)最適離子強(qiáng)度：分別配制離子強(qiáng)度為0.01、0.05、0.1、0.15、0.20 mol/L的PBS緩沖液(pH值依據(jù)上述試驗(yàn)獲得)，采用上述緩沖液稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)平行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其IC。(3)最適有機(jī)溶劑用量：分別配制含有0%、10%、20%、30%及50%甲醇的PBS緩沖液(pH值和離子強(qiáng)度依據(jù)上述試驗(yàn)獲得)，采用上述緩沖液稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)平行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其IC。

1.2.3 SWCNTs多酶信號(hào)顆粒的制備與評(píng)估

1.2.3.1 SWCNTs多酶信號(hào)顆粒的制備 0.2 mg羧基化SWCNTs，超聲懸于1 mL MES溶液中，至SWCNTs完全分散；加入一定量的GAM-HRP，4 ℃混合攪拌過夜；5 000/min離心10 min，去除上清液；將沉淀SWCNTs/GAM-HRP超聲重懸于1 mL 含有2% BSA的MES溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)SWCNT上結(jié)合的GAM-HRP用量進(jìn)行優(yōu)化，分別加入20、40、60、80 μg GAM-HRP，產(chǎn)物分別命名為SWCNTs/GAM-HRP-1、SWCNTs/GAM-HRP-2、SWCNTs/GAM-HRP-3和SWCNTs/GAM-HRP-4。

1.2.3.2 SWCNTs多酶信號(hào)顆粒的評(píng)估 應(yīng)用“1.2.1”節(jié)和“1.2.2”節(jié)所建立優(yōu)化后的DON間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，將其中使用的GAM-HRP替換為“1.2.3.1”節(jié)中合成不同SWCNTs/GAM-HRP，評(píng)估多酶顆粒的結(jié)合能力和信號(hào)放大效果。

1.2.4 基于多酶輔助信號(hào)放大的嘔吐毒素檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

1.2.4.1 基于多酶輔助信號(hào)放大的嘔吐毒素檢測(cè)流程 包被、封閉、DON抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合步驟與“1.2.1”節(jié)相同；加入不同濃度SWCNTs/GAM-HRP顆粒，振蕩條件下37 ℃孵育30 min；顯色、終止及讀值步驟同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4.2 條件優(yōu)化 為進(jìn)一步提升方法性能，對(duì)DON抗體的工作濃度及SWCNTs/GAM-HRP顆粒的工作濃度進(jìn)行優(yōu)化。DON抗體設(shè)置3個(gè)工作濃度(1 ∶2 000、1 ∶4 000和1 ∶6 000)，SWCNTs/GAM-HRP設(shè)置3個(gè)工作濃度(1 ∶10、1 ∶20和1 ∶40)，同時(shí)設(shè)置不同DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.0、0.1、1.0 ng/mL)及空白對(duì)照(競(jìng)爭(zhēng)步驟中，不加DON抗體以及DON標(biāo)準(zhǔn)品)。將不同濃度的DON抗體與不同濃度的SWCNTs/GAM-HRP進(jìn)行交叉匹配，選擇靈敏度最高的組合。

1.2.5 方法的性能評(píng)估

1.2.5.1 間接競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線 基于“1.2.4”節(jié)中優(yōu)化條件，按照“1.2”節(jié)中試驗(yàn)流程，分別配制DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1、2、4、8、16 ng/mL，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC)、最低檢測(cè)限(IC)和檢測(cè)范圍(IC～I(xiàn)C)。

1.2.5.2 交叉反應(yīng) 選取DON結(jié)構(gòu)類似物及不同真菌毒素(3-Ac-DON、15-Ac-DON、T-2毒素、ZEN、AFB1)做交叉反應(yīng)的測(cè)定，對(duì)本試驗(yàn)方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。交叉反應(yīng)(cross reactivity，CR)=IC(DON)/IC(類似物)×100%。

1.2.5.3 精密度 將基于多酶輔助信號(hào)放大的DON檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次，第2天再次檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

1.2.6 谷物樣本的檢測(cè)

1.2.6.1 添加回收試驗(yàn) 把大米、玉米和小麥的陰性樣品進(jìn)行粉碎，粉碎后通過20 目篩，稱取10 g，加入20 mL 20%甲醇溶液，振蕩2 min，取1 mL上清液于4 000/min離心5 min，吸取上清液，并稀釋10 倍，配制終濃度為0、1、4、8 ng/mL DON溶液，按“1.2.4.1”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)。每種添加濃度重復(fù)3次，添加回收率=(檢測(cè)濃度-本底濃度)/實(shí)際添加濃度×100%。

1.2.6.2 實(shí)際樣本檢測(cè) 在江蘇省鎮(zhèn)江市大型超市中，采購(gòu)大米、玉米和小麥樣本各5種，應(yīng)用“1.2.4.1”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的建立

ELISA方法的建立是基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，其中，包被原的濃度、抗體的濃度、反應(yīng)的條件等均會(huì)不同程度地影響方法性能，因此需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。首先，采用棋盤法對(duì)抗原和抗體的濃度進(jìn)行優(yōu)化，由表1可知，通常選擇值在1.0左右的配對(duì)濃度作為最適條件，其中，包被原1 ∶500/抗體1 ∶8 000、包被原1 ∶1 000/抗體1 ∶4 000和包被原1 ∶2 000/抗體1 ∶2 000這3組均符合此條件。其中，第1組空白值偏高，選擇包被濃度較高的一組(包被原1 ∶1 000/抗體1 ∶4 000)為最適工作濃度。

表1 棋盤法篩選最適抗原與抗體濃度

其次，對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，包括pH值、離子強(qiáng)度以及有機(jī)溶劑含量。由圖1可知，pH值在 6.0～7.4時(shí)，值變化不大，當(dāng)pH值達(dá)8.0時(shí)，值略有增加；同時(shí)，當(dāng)pH值為7.4時(shí)，IC值最低。溶液的離子強(qiáng)度越高，值越小，而IC值隨離子強(qiáng)度增加而增加。當(dāng)離子強(qiáng)度為0.01 mol/L時(shí)，值最高而IC值最低。在實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)，需要加入有機(jī)溶劑作為提取液，因此，需要評(píng)估有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)的影響，選擇常用的甲醇進(jìn)行評(píng)估。該方法對(duì)甲醇的耐受性較好，當(dāng)甲醇濃度低于30%時(shí)，值和IC值變化不大，當(dāng)甲醇濃度達(dá)50%時(shí)，靈敏度顯著下降。最終選用0.01 mol/L PBS (pH值7.4，含20%甲醇)作為樣品溶液來稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品。

基于以上優(yōu)化條件，建立DON間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。該方法線性范圍8.85～35.17 ng/mL，IC為18.13 ng/mL，檢測(cè)限為3.12 ng/mL。

2.2 SWCNTs多酶信號(hào)顆粒的優(yōu)化

以碳納米管為載體，可荷載較多的蛋白酶顆粒放大檢測(cè)信號(hào)，還可有效保留酶的活性。由圖3可知，本研究中，將GAM-HRP偶聯(lián)在SWCNTs上，形成一種通用的信號(hào)放大探針，可適用于間接ELISA方法，用于替代傳統(tǒng)的酶標(biāo)二抗，提升靈敏度。納米材料上荷載的酶蛋白的量與方法的靈敏度直接相關(guān)，因此對(duì)GAM-HRP的用量進(jìn)行優(yōu)化。隨著GAM-HRP用量的增加(從20 μg至80 μg)，同等條件下顯色的值顯著增加。因此，后續(xù)試驗(yàn)中GAM-HRP的用量為80 μg，即采用SWCNTs/GAM-HRP-4作為信號(hào)放大元件。

2.3 基于多酶輔助信號(hào)放大的嘔吐毒素檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

引入合成的SWCNTs/GAM-HRP-4，構(gòu)建多酶輔助信號(hào)放大的嘔吐毒素檢測(cè)方法。由表2可知，由于酶促信號(hào)的放大作用，對(duì)DON抗體和多酶信號(hào)顆粒的用量再次進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)設(shè)置不同的DON標(biāo)準(zhǔn)品，幫助評(píng)估每一種條件下方法的靈敏度。選擇的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)當(dāng)DON標(biāo)準(zhǔn)品為0 ng/mL時(shí)，顯色值在1.0左右；(2)不同的DON濃度條件下，顯色呈現(xiàn)明顯的梯度為佳；(3)為避免多酶信號(hào)顆粒吸附造成的背景干擾，空白值應(yīng)盡可能小。根據(jù)以上條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng) SWCNTs/GAM-HRP-4用量較大(1 ∶10)時(shí)，整體背景值均較高(空白超過0.1)；在試驗(yàn)中，通過增加洗滌次數(shù)、提高洗液中的表面活性劑Tween-20的含量，均不能有效降低背景。SWCNTs/GAM-HRP-4用量為1 ∶20和1 ∶40時(shí)，背景值均較低。在DON抗體(1 ∶12 000)/SWCNTs/GAM-HRP-4(1 ∶20)和DON抗體(1 ∶8 000)/SWCNTs/GAM-HRP-4(1 ∶40)這2組條件，最大的值均在1.0左右，同時(shí)前一組合在不同DON濃度下，梯度變化趨勢(shì)更為明顯，靈敏度更高。因此，確定最適的DON抗體濃度為1 ∶12 000，SWCNTs/GAM-HRP-4最適濃度為1 ∶20。

表2 DON抗體和多酶信號(hào)顆粒的用量?jī)?yōu)化

基于以上優(yōu)化后的反應(yīng)條件，建立了基于多酶輔助信號(hào)放大的DON標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，該方法的線性范圍為0.93～9.40 ng/mL，IC為 3.93 ng/mL，檢測(cè)限為0.63 ng/mL。相對(duì)于間接競(jìng)爭(zhēng)ELSA方法，本方法的靈敏度提高約5倍(3.12 ng/mL 至0.63 ng/mL)。在對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化的過程中，發(fā)現(xiàn)在同樣的包被濃度條件下，基于多酶輔助信號(hào)放大的ELISA方法中抗體的用量(1 ∶12 000)遠(yuǎn)小于間接競(jìng)爭(zhēng)ELSA方法(1 ∶4 000)。在與同樣濃度的包被原和標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合時(shí)，抗體越少，越容易被標(biāo)準(zhǔn)品完全抑制，顯示出更高的靈敏度；但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致與包被原結(jié)合減少，信號(hào)強(qiáng)度降低，因此通過SWCNTs/GAM-HRP有效信號(hào)放大，保障了信號(hào)強(qiáng)度，使得靈敏度顯著增加。與已報(bào)道的DON免疫分析方法相比(靈敏度分別為9.83 ng/mL、1.0 ng/mL、2.97 ng/mL)，所建立的新方法具有較好的靈敏度，能夠滿足食品中DON檢測(cè)的要求。

交叉反應(yīng)結(jié)果見圖5。由圖5可知，所建立的新方法僅與3-Ac-DON有較弱的交叉反應(yīng)(4.4%)，與 15-Ac-DON、T-2、ZEN、OTA和AFB1無明顯的交叉反應(yīng)，這表示本方法具有良好的特異性。由表3可知，本方法的批內(nèi)差在3.67%～9.09%，平均值為7.27%；批間差在4.72%～13.78%，平均值為9.57%。批內(nèi)差和批間差均小于15%，表明該方法具有較高的精密度。

2.4 谷物樣本的檢測(cè)

為評(píng)價(jià)新構(gòu)建方法的實(shí)際應(yīng)用性，對(duì)大米、小麥和玉米3種谷物的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表4可知，方法回收率在87.65%～114.50%之間，這個(gè)數(shù)據(jù)表明新方法在實(shí)際谷物樣品DON的檢測(cè)中具有較高的準(zhǔn)確性。于7月在鎮(zhèn)江市吉麥隆及大潤(rùn)發(fā)超市中采集了大米、小麥和玉米樣品各5個(gè)，采用建立的新方法進(jìn)行檢測(cè)。由表5可知，15個(gè)樣本中DON檢出濃度在

表3 ELISA方法的批內(nèi)和批間差異

表4 基于多酶輔助信號(hào)放大的DON檢測(cè)方法添加回收試驗(yàn)

3 結(jié)論

新型納米材料的發(fā)展為免疫分析方法中信號(hào)放大策略提供了新的契機(jī)。本研究以SMWCNTs為載體，荷載GAM-HRP，構(gòu)建通用型的多酶信號(hào)顆粒，建立了多酶輔助信號(hào)放大的嘔吐毒素免疫分析方法；相較于間接競(jìng)爭(zhēng)ELSA方法，該方法的靈敏度提高了約5倍(3.12 ng/mL至0.63 ng/mL)；同時(shí)具有良好的特異性、準(zhǔn)確性。對(duì)大米、小麥和玉米加標(biāo)試驗(yàn)顯示，回收率在87.65%～114.50%之間；在15個(gè)谷物樣本中DON檢出濃度在

表5 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果