李正鵬， 蘇皖平， 楊 威， 宋虎衛(wèi)， 顧大路， 劉廷武， 羅玉明

(1.江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223300；2.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安 223001)

由禾頂囊殼小麥變種(var.)引起的小麥全蝕病，是世界上最重要的小麥根部病害，因其突出的土壤傳播特性，一直是小麥亟待解決的防治難題。該病在我國安徽省、山東省和河南省等栽培地區(qū)廣泛發(fā)生，目前主要采取化學(xué)藥劑拌種的方法進(jìn)行防治，而化學(xué)防治易引起環(huán)境污染及產(chǎn)生抗藥性。隨著人們環(huán)保、綠色意識的增強(qiáng)，利用微生物防控全蝕病已成為一條行之有效的新途徑。假單胞菌是廣泛存在于植物根際的一類微生物，常常具備顯著防治植物病害、促進(jìn)植物生長的作用。其生防機(jī)制包括產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和鐵載體或水解酶、營養(yǎng)競爭、生物膜的快速形成以及誘導(dǎo)植物抗性等。因此，本研究在前期構(gòu)建的微生物資源庫基礎(chǔ)上，以禾頂囊殼小麥變種為靶標(biāo)菌，鑒定全蝕病生防菌株Z0-j，并對其拮抗效果和代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性進(jìn)行評估，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原真菌為禾頂囊殼小麥變種，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)柯希望副教授惠贈。

供試生防細(xì)菌Z0-j，2017年11月篩選自江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室有益微生物資源庫，編號L031，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 靶標(biāo)菌：將斜面上保存的禾頂囊殼小麥變種擴(kuò)繁于PDA培養(yǎng)基上，待菌落直徑長至培養(yǎng)皿的一半時(shí)，待用。

菌株Z0-j發(fā)酵液制備：按照前期研究結(jié)果，將直徑7 mm的菌餅接種到種子發(fā)酵培養(yǎng)液(250 mL 三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量為50 mL)中，于28 ℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)2 d后，以12.8%的接種量、裝料量100 mL/250 mL，接入NA發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行二次發(fā)酵，于25 ℃、120 r/min搖床上培養(yǎng)2 d，即為發(fā)酵液原液。將發(fā)酵液原液在10 000 r/min、4 ℃下離心15 min，上清液經(jīng)0. 22 μm無菌濾膜過濾，即為無菌發(fā)酵濾液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 16S rDNA鑒定 采用細(xì)菌基因組試劑盒提取基因組DNA，用細(xì)菌通用引物27F (5′-A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G-3′)和1492R (5′-G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3′) 進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30次循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序后的序列，利用 Genbank 中的 BLAST 軟件對獲得的 16S rDNA 序列進(jìn)行同源性分析，再通過 MegaX 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株Z0-j抑菌效果測定 采用菌絲體干質(zhì)量法測定菌株Z0-j對小麥全蝕病菌的抑菌效果。將生長72 h的靶標(biāo)菌菌餅(直徑7 mm)，移至PD培養(yǎng)液中，再將不同體積的生防菌Z0-j發(fā)酵液原液和上清液加入搖瓶中，設(shè)置無菌水作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于25 ℃、110 r/min條件下培養(yǎng)，4 d后取菌絲于30 ℃條件下烘干，測定菌絲干質(zhì)量，并計(jì)算抑制效果。

1.2.4 菌株Z0-j抑菌效果的顯微觀察 利用皿內(nèi)對峙法，取受抑制后的靶標(biāo)菌菌落邊緣菌絲，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并以照片記錄受抑制菌絲形態(tài)變化。

1.2.5 菌株Z0-j對靶標(biāo)菌菌絲膜通透性的影響 采用電導(dǎo)率法進(jìn)行測定，參考郅曉燕等的方法，稍作改動。將靶標(biāo)菌菌餅接種于PD液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、110 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，將菌絲用蒸餾水沖洗3次，去除菌絲表面培養(yǎng)基及水分；分別稱取0.1 g菌絲體，加入到設(shè)置不同濃度菌株 Z0-j 發(fā)酵液的水溶液中，以蒸餾水作為空白對照。在20 ℃條件下分別測定0、0.5、1、2、4 h時(shí)處理和對照溶液的電導(dǎo)率，重復(fù)3次。根據(jù)公式計(jì)算溶液電導(dǎo)率的增幅。

電導(dǎo)率增幅=(不同時(shí)刻電導(dǎo)率-初始電導(dǎo)率)/初始電導(dǎo)率×100%。

1.2.6 代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性分析 溫度影響：無菌發(fā)酵液置于恒溫水浴鍋中處理30 min，梯度為40、60、80、100 ℃，采用皿內(nèi)對峙法測定其抑菌效果。

pH值影響：用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值分別為4、6、7、8、10、12，處理后放入 4 ℃冰箱中放置48 h，采用皿內(nèi)對峙法測定其抑菌效果。

紫外線影響：100 W紫外燈下處理無菌發(fā)酵濾液0～1 h，梯度間隔為10 min，距離為60 cm，再采用皿內(nèi)對峙法測定其抑菌效果。

超聲波影響：利用100 W超聲波分別處理無菌發(fā)酵上清液20、30、40、60 min，采用皿內(nèi)對峙法測定其抑菌效果。

蛋白酶K影響：吸取1 mL無菌發(fā)酵上清液于1.5 mL離心管中，向管內(nèi)加入濃度不同的蛋白酶K，使其終濃度分別達(dá)到2、20、100 g/mL，37 ℃下水浴2 h后，采用皿內(nèi)對峙法測定其抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Z0-j分子鑒定

將拮抗菌Z0-j測序獲得的16S rDNA序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，挑選與之高度同源的序列，然后利用MegaX軟件，利用鄰接法(neighor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)?？梢钥闯?，生防菌Z0-j與銅綠假單胞菌() RTE4在同一分支，同源性最高。再結(jié)合前期形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征，最終鑒定為銅綠假單胞菌。

2.2 抑菌效果測定

菌株Z0-j對小麥全蝕菌()菌絲生長抑制72 h后，進(jìn)行菌絲干質(zhì)量測定。從圖2可以看出，處理組L50、L100的菌絲干質(zhì)量與CK存在顯著差異(<0.05)，抑菌效果分別為73.3%、87.4%，且干質(zhì)量平均值呈下降趨勢；處理Y10、Y50、Y100的菌絲干質(zhì)量與CK存在顯著差異，抑菌效果均在94%以上，且干質(zhì)量平均值也呈下降趨勢。由此可見，發(fā)酵液中活性物質(zhì)能夠顯著抑制菌絲的生長，且活性物質(zhì)含量越高，拮抗效果越好。

2.3 菌株Z0-j對靶標(biāo)菌抑制顯微觀察

顯微觀察結(jié)果(圖3)表明，對照菌絲光滑、纖細(xì)、粗細(xì)均勻、向前生長；而經(jīng)生防菌Z0-j處理 72 h 后，靶標(biāo)菌菌絲多數(shù)呈現(xiàn)畸形、粗細(xì)不一、頂端膨大、旋轉(zhuǎn)扭結(jié)；部分菌絲明顯出現(xiàn)溶解、斷裂、原生質(zhì)外滲且透明等雜亂現(xiàn)象。

2.4 菌株Z0-j對靶標(biāo)菌菌絲膜通透性的影響

由圖4可知，隨著處理時(shí)間的增加，對照組和處理組溶液的電導(dǎo)率持續(xù)增大，處理組電導(dǎo)率增幅明顯高于對照組，且隨著發(fā)酵液活性物質(zhì)濃度增多，處理組溶液電導(dǎo)率增幅也呈增大趨勢。當(dāng)添加 100 μL 發(fā)酵上清液時(shí)，處理后溶液的電導(dǎo)率平均增幅在120 min時(shí)為18.25%，當(dāng)添加100 μL發(fā)酵原液時(shí)，處理后溶液的電導(dǎo)率平均增幅在120 min時(shí)為21.14%。由此可知，菌株Z0-j可以破壞靶標(biāo)菌菌絲完整性，和顯微觀察結(jié)果一致。

2.5 不同外界因素對代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響

2.5.1 溫度對活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 用平板對峙法測量20(CK)、40、60、80、100 ℃與室溫下的活性物質(zhì)抑菌效果，結(jié)果顯示，發(fā)酵濾液的抑菌圈直徑總體呈縮小趨勢。CK與其他溫度處理相比差異顯著；高于40 ℃處理的抑菌圈直徑顯著縮?。坏?00 ℃條件下活性物質(zhì)仍有較強(qiáng)抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)到26.58 mm，說明活性物質(zhì)在高溫處理下比較穩(wěn)定(圖5)。

2.5.2 pH值對活性物質(zhì)的影響 用平板對峙法測量生防菌Z0-j活性物質(zhì)在pH值為4、6、7(CK)、8、10、12時(shí)的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)隨著pH值變化，活性物質(zhì)的抑菌作用在酸性條件下差異不顯著，在堿性條件下顯著下降，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，表明菌株Z0-j可能含有多種活性物質(zhì)，保證抑菌能力對不同pH值條件的穩(wěn)定性(圖6)。

2.5.3 紫外線對活性物質(zhì)的影響 由圖7可知，經(jīng)不同時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)紫外線處理后，Z0-j發(fā)酵濾液的抑菌作用出現(xiàn)了顯著差異。未經(jīng)紫外線照射處理的發(fā)酵濾液的抑菌作用最大，抑菌圈直徑為29.76 mm，紫外線照射處理后，抑菌圈直徑有所縮小，但從照射時(shí)長在20 min以上后，仍保持有27.82 mm的抑菌圈直徑，且各處理間沒有顯著差異。說明發(fā)酵液活性性物在紫外線條件下抑菌作用比較穩(wěn)定。

2.5.4 超聲波對活性物質(zhì)的影響 由圖8可知，隨著超聲波處理時(shí)間(20、30、40、60 min)的延長，未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為29.03 mm，處理的抑菌圈對比對照顯著縮小，但至少仍有27.62 mm的直徑，且各個(gè)處理間無顯著差異。說明該活性物質(zhì)對超聲波有較好的耐受性。

2.5.5 蛋白酶對活性物質(zhì)的影響 用平板對峙法測量了生防菌Z0-j活性物質(zhì)經(jīng)蛋白酶K處理后的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)各處理的活性物質(zhì)的抑菌圈直徑逐漸減小，存在顯著差異。蛋白酶K濃度為2 g/L處理時(shí)，抑菌效果與對照之間無顯著差異：蛋白酶K濃度逐漸提高到20 、100 g/L時(shí)，抑菌能力顯著降低，但抑菌圈直徑仍有25.70 mm。由此可見，活性物質(zhì)中可能含有某些酶類物質(zhì)，但發(fā)酵液活性物質(zhì)整體對蛋白酶K表現(xiàn)出良好的耐受性(圖9)。

3 討論與結(jié)論

小麥全蝕病是小麥生產(chǎn)過程中的重大病害，本研究鑒定和評估了內(nèi)生細(xì)菌Z0-j及其對小麥全蝕病菌的生防潛力，證明了內(nèi)生細(xì)菌Z0-j為銅綠假單胞菌()，對靶小麥全蝕病菌拮抗效果顯著，能夠引致靶標(biāo)菌菌絲畸形、頂端膨大、原生質(zhì)外滲、細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，甚至菌絲死亡。同時(shí)，菌株Z0-j活性物質(zhì)對溫度、pH值、紫外光照、超聲波以及蛋白酶等外界因素有良好的耐受性，表明內(nèi)生細(xì)菌Z0-j是一株對小麥全蝕病具備良好開發(fā)潛力的生防菌株。

研究表明，活躍在植物根際的假單胞菌一方面產(chǎn)生活性物質(zhì)或改善礦質(zhì)營養(yǎng)直接促進(jìn)植物生長，另一方面產(chǎn)生代謝物質(zhì)或競爭作用抑制或阻礙病原微生物的侵染。假單胞菌產(chǎn)生的鐵載體通過競爭病原菌的鐵營養(yǎng)而占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位，拮抗物質(zhì)如吩嗪酸(PCA)、硝吡咯菌素(Prn)、2，4-二乙酰滕黃酚(Ph1)、藤黃綠膿菌素(Plt)、環(huán)狀脂多肽等通過抑制孢子萌發(fā)、裂解真菌菌絲等途徑抑制病原真菌生長發(fā)育，多種低分子量揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)亦抑制菌絲生長、產(chǎn)孢、萌發(fā)等，水解酶如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶可以溶解真菌的細(xì)胞壁，甚至一些吩嗪類和VOCs物質(zhì)還參與植物系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)。本研究中的生防假單胞菌Z0-j能夠顯著抑制靶標(biāo)菌小麥全蝕菌()的生長，在不同影響因素條件下表現(xiàn)的抑制效果有所差異，證明活性物質(zhì)中有多種抑菌物質(zhì)，且包含一些能被蛋白酶K影響的酶類活性物質(zhì)。

一直以來，生防假單胞菌被認(rèn)為是一種有效、環(huán)保、可持續(xù)的化學(xué)殺菌劑替代品。然而，對于成千上萬被報(bào)道的潛在生防資源而言，僅有極少數(shù)被開發(fā)應(yīng)用，其主要原因就是野外條件下生物資源的穩(wěn)定性不佳，進(jìn)而影響其商業(yè)化程度。因此，生防菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性是其作為生防制劑、生物肥料、植物生長調(diào)節(jié)因子等發(fā)揮有效作用的關(guān)鍵因素。本研究中生防假單胞菌Z0-j發(fā)酵液中的活性物質(zhì)在溫度、pH值、紫外線、超聲波、蛋白酶K等影響下，依然表現(xiàn)出良好的抑菌能力，顯示出對外界環(huán)境的耐受性，說明該菌株是一株對小麥全蝕病有開發(fā)潛力的生防菌株。