歐江濤， 蔣啟程， 周刻焱， 柳 巧， 欒筱琪， 王資生， 張啟煥

(鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051)

中華絨螯蟹()俗稱河蟹，是我國特有的優(yōu)質(zhì)淡水蝦蟹養(yǎng)殖品種之一，也是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟蟹種，具有較高的營養(yǎng)價值。隨著中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化大規(guī)模高速發(fā)展，導(dǎo)致水體環(huán)境狀況急速惡化，病害頻發(fā)且愈發(fā)嚴重。其中，由螺原體引起的“顫抖病”在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中發(fā)生較為廣泛。中華絨螯蟹作為無脊椎動物主要依賴其先天免疫(包括細胞和體液免疫)發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。目前，對于中華絨螯蟹細菌感染研究報道較多，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹應(yīng)對副溶血性弧菌()、金黃色葡萄球菌()和嗜水氣單胞菌()等細菌侵染的免疫反應(yīng)中，整合素(EsIntegrin)、C型凝集素(EsCTL1和EsCTL2)、L型凝集素(ERGIC-53和VIP36)等可作為識別受體參與宿主免疫防御；其中，、、等基因是重要的免疫調(diào)控因子，發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。而關(guān)于它的分子調(diào)控機制，至今仍是研究熱點。

河蟹螺原體()屬于柔膜體綱(Mollicutes)蟲原體目(Entomoplasmatales)螺原體科(Spiroplasmataceae)螺原體屬()。螺原體是上世紀70年代被發(fā)現(xiàn)，可廣泛寄生于無脊椎動物中具有嚴重致病性的一類獨特微生物，其定植于宿主體內(nèi)，在長期與宿主共存過程中，相互構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，通過不同精細調(diào)控細菌基因表達，以適應(yīng)不同的生存環(huán)境，并對不同宿主發(fā)揮毒性作用。螺原體為中華絨螯蟹的主要病原體之一，被侵染后死亡率可達100%，近年中華絨螯蟹螺原體致使中華絨螯蟹、南美白對蝦()、日本沼蝦()和克氏原螯蝦()等甲殼經(jīng)濟動物暴發(fā)疫病發(fā)生大面積死亡，對我國水產(chǎn)經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。中華絨螯蟹螺原體通過鰓或外殼感染河蟹，并在1～5 d內(nèi)增殖于其靶細胞-血淋巴細胞，5～10 d擴散至全身器官及結(jié)締組織，最后在 10～15 d引起中華絨螯蟹附肢顫抖直至死亡。

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA分子，廣泛存在于真核細胞中，它通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對調(diào)節(jié)基因表達，其長度為19～25 nt，miRNA雖不能直接編碼蛋白質(zhì)，但miRNA在不同基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中具有重要作用。第一條miRNA被Lee等發(fā)現(xiàn)后，對于miRNA的研究引起了廣泛關(guān)注，miRNA在各種生命活動中起重要調(diào)控作用，如生長發(fā)育、生殖、免疫代謝等。目前，miRNA研究方法主要有基因芯片、RNA-seq、Northern blotting和莖環(huán)qRT-PCR等。其中，微流體芯片高通量可靠檢測miRNAs的存在和差異表達情況，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物研究中已廣泛應(yīng)用。

當前，利用微流體芯片技術(shù)系統(tǒng)鑒定與分析中華絨螯蟹螺原體感染血細胞的miRNA及其表達情況，至今仍未見報道。前期，筆者所在實驗室以正常和感染螺原體中華絨螯蟹血細胞為研究對象，進行miRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析，初步預(yù)測了血細胞免疫相關(guān)的miRNA。本研究在前期基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建中華絨螯蟹miRNA的特異微流體芯片，進一步系統(tǒng)鑒定血細胞免疫相關(guān)miRNA并檢測其表達情況，對差異表達的microRNA進行靶基因預(yù)測和功能聚類與通路分析，相關(guān)研究結(jié)果將為中華絨螯蟹該疫病的免疫防控和抗病育種提供分子信息。

1 材料與方法

1.1 螺原體感染中華絨螯蟹血細胞的樣品準備

中華絨螯蟹購于江蘇省南京市某養(yǎng)殖戶，(100±10) g共100只，在試驗前放置于10 L帶有循環(huán)水、紫外滅菌、充氧及控溫系統(tǒng)(26～28 ℃)中培育，通過PCR技術(shù)及負染技術(shù)證實研究所用中華絨螯蟹為螺原體陰性。試驗所用螺原體分離自患螺原體病的中華絨螯蟹，R2培養(yǎng)基中培育 48 h 備用。

2012年6月在南京師范大學(xué)將中華絨螯蟹分為對照組和試驗組，各50只，培養(yǎng)20 d備用；對照組注射100 μL R2培養(yǎng)基，試驗組注射100 μL含螺原體(培養(yǎng)至對數(shù)期)R2培養(yǎng)基。飼養(yǎng)溫度保持 28 ℃，間歇性供氧。抽取血液，采用Trizol提取法從血細胞中提取RNA，并對RNA進行質(zhì)量檢測。

1.2 中華絨螯蟹微流體芯片構(gòu)建及差異表達檢測

由表1可知，基于miRBase中收錄的中華絨螯蟹、淡水枝角水蚤()、日本對蝦()、克氏原螯蝦()4種動物共897條成熟miRNA序列作為本研究探針。采用Cy3染料標記RNA樣品，可通過檢測分析Cy3的熒光強度來尋找2組樣品差異表達的miRNAs。

在總RNA質(zhì)檢通過后，進入芯片試驗階段，由LC Science參與完成。使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。首先，減除背景值，再使用LOWESS過濾進行信號歸一化。衡量雜交結(jié)果可靠性的標準如下：(1)值<0.5；(2)探針信號值大于3倍背景值與標準偏差的和。滿足以上2點為表達檢測結(jié)果為陽性。

表1 中華絨螯蟹微流體芯片探針

1.3 差異miRNA靶基因預(yù)測及其GO和KEGG功能富集分析

通過微流體芯片檢測，可獲得正常和感染螺原體中華絨螯蟹共同表達miRNA及兩者差異表達miRNA。為了解2組中華絨螯蟹差異miRNA功能，選用分析軟件“miRanda，PITA和TargetScan”進行預(yù)測差異顯著miRNA的所有靶基因，結(jié)合三者預(yù)測結(jié)果，取交集，獲取共有靶基因。根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對靶基因進行功能分析，根據(jù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對靶基因進行Pathway分類，而得到Path way分類。

1.4 莖環(huán)RT-qPCR驗證

設(shè)計莖環(huán)引物，進行反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試驗，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR程序為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。RT-qPCR程序為：50 ℃ 2 min 95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s，39次循環(huán)。每個樣品均為3復(fù)孔，-為內(nèi)參基因，miRNA差異表達水平用2-ΔΔ方法計算。采用Primer 5.0 (ABI)進行引物設(shè)計，采用特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄，共設(shè)計9對引物，引物序列見表2。

表2 miRNA的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹血細胞miRNA的芯片鑒定與表達分析

試驗組和對照組各使用3張芯片進行檢測，每張芯片都設(shè)計多重質(zhì)控探針，保證了樣品標記和雜交試驗的質(zhì)量控制。對于正常和感染中華絨螯蟹血細胞中不同miRNA，根據(jù)芯片所產(chǎn)生的不同反應(yīng)信號，通過分析這些芯片雜交信號值，選取Signal>200及<0.05為分析基準，數(shù)據(jù)進行歸一化處理后進行-Test和Cluster分析。由圖1可知，6張芯片總共鑒定出中華絨螯蟹血細胞miRNA為303個，試驗組和對照組共表達miRNA有48個，其中，有27個表達miRNA差異顯著(<0.05)，6個表達miRNA差異極顯著(<0.01)；在這些差異表達的miRNA中，12個miRNA顯著下調(diào)，15個miRNA顯著上調(diào)(<0.05)。

2.2 差異miRNA的靶基因預(yù)測、GO注釋和Pathway分類

由表3可知，通過利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對差異顯著的27個miRNA靶基因進行預(yù)測，結(jié)合三者數(shù)據(jù)取交集，共得78個靶基因，預(yù)測靶基因大多數(shù)為各種蛋白和酶的基因，參與調(diào)節(jié)各種生命活動，尤其是在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用的proPO、ALF-2、Peroxinectin、Relish免疫因子等。

表3 miRNA的預(yù)測靶基因

由圖2-A可知，對預(yù)測到的78個靶基因進行GO注釋，共有116個GO通路被注釋，明顯富集于24個GO，包括：蛋白水解、cAMP生物合成和鈣離子結(jié)合等；由圖2-B可知，通過KEGG注釋，發(fā)現(xiàn)63個通路被注釋，14個主要通路，包括：嘌呤代謝、趨化因子信號通路和GnRH信號通路等。

2.3 莖環(huán)RT-qPCR試驗結(jié)果

為驗證微流體芯片的檢測結(jié)果，由圖3可知，隨機選取PC-esi-137-3p、PC-esi-14-5p、PC-esi-140-5p、PC-esi-229-3p、PC-esi-262-3p、PC-esi-33-3p、PC-esi-394-5p、PC-esi-433-5p、PC-esi-69-3p這9個明顯差異表達的miRNA進行驗證，利用莖環(huán)RT-qPCR法檢測miRNA的差異表達情況。結(jié)果表明，這9個miRNA表達水平均上調(diào)，與微流體芯片結(jié)果一致。

3 討論

miRNA通過與靶標基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補，抑制mRNA表達或直接裂解mRNA，調(diào)控各種生理和病理作用。miRNA也是至今研究最廣泛的一類非編碼RNA，已被證明在調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。因此，鑒定和篩選免疫相關(guān)的miRNA，解析其在宿主與病原體中的相互關(guān)系，將在疾病防控和抗病育種中發(fā)揮重要作用。在miRNA研究中，微流體芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，微流體芯片技術(shù)是高通量、特異性和敏感性強的一種基因鑒定和差異檢測方法，在動物的生長、發(fā)育和免疫應(yīng)答等方面運用較多。李升等選用不同月齡香豬的肝臟組織RNA，與微流體芯片雜交，結(jié)果表明不同月齡肝臟miRNA的表達水平存在差異。關(guān)于水產(chǎn)動物研究，何耀東等利用微流體芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在注射自噬誘導(dǎo)劑后對蝦血淋巴中有15個miRNA明顯上調(diào)，17個miRNA明顯下調(diào)，表明相關(guān)差異表達miRNA在白斑綜合癥病毒(WSSV)侵染對蝦的過程中發(fā)揮作用?，F(xiàn)今，微流體芯片技術(shù)，因其具有微量化、快速、高通量等特點，近年來已被廣泛應(yīng)用到癌癥、微生物和營養(yǎng)等多個領(lǐng)域研究中。隨著微流體芯片的進一步廣泛應(yīng)用，將極大促進功能性調(diào)控miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定，為進一步研究免疫調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

中華絨螯蟹屬于無脊椎動物，完全依賴先天免疫(包括細胞和體液免疫)，而缺乏適應(yīng)性免疫來抵御細菌和病毒等。甲殼動物血細胞是主要的免疫細胞，在宿主的先天免疫活動中起著至關(guān)重要的作用，包括識別、吞噬、黑化、細胞毒性和細胞間信號傳遞等。因此，識別和鑒定參與先天免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子(如非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄因子)至關(guān)重要。前期研究通過對正常和感染螺原體的血細胞進行高通量測序分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析，共鑒定出735個miRNA；在被螺原體侵染后，本研究發(fā)現(xiàn)228個miRNA表達量存在明顯差異，133個miRNA顯著上調(diào)，95個miRNA顯著下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，本研究選擇微流體芯片和莖環(huán)RT-qPCR技術(shù)，對細胞免疫相關(guān)miRNAs進行了進一步的篩選鑒定與驗證。由于μParaflo?微流體芯片相比于傳統(tǒng)點樣芯片具有更可靠、準確和靈活特點，本研究利用該技術(shù)鑒定出中華絨螯蟹血細胞miRNA共303個；健康組和試驗組共表達miRNA有48個，其中，差異顯著miRNA為27個(占比56.25%)；差異極顯著miRNA為6個(占比12.50%)。隨機選擇9個差異表達miRNA進行莖環(huán)RT-qPCR驗證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片檢測結(jié)果準確可靠。

近年，隨著測序成本的下降和技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNA在蝦蟹免疫調(diào)控中發(fā)揮作用的研究已較為廣泛。Ou等研究發(fā)現(xiàn)，pcl-miR-34、pcl-miR-7、PN-pcl-let-7、pcl-miR-1和pcl-miR-2b在克氏原螯蝦應(yīng)對螺原體侵染過程中發(fā)揮著積極作用，且在脊椎動物和無脊椎動物中高度保守。Bao等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-589-5p在凡納濱對蝦可調(diào)節(jié)抗WSSV免疫應(yīng)答中血藍蛋白的表達。Soo等發(fā)現(xiàn)，bta-miR-4286、dre-miR-107b 在斑節(jié)對蝦()應(yīng)對副溶血弧菌侵染過程中與對肌蛋白基因表達、鈣濃度有調(diào)控作用。本研究通過利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對差異顯著的27 個miRNA進行靶基因預(yù)測，取三者交集，共得到78個靶基因，涉及多個重要免疫通路，其中，()、()、和等多個靶基因是參與免疫調(diào)控的重要免疫因子。

酚氧化酶(proPO)系統(tǒng)是無脊椎動物先天免疫的重要組成部分之一，過氧化物酶可與proPO相關(guān)的細胞黏附因子相互作用來進行免疫調(diào)節(jié)。免疫缺陷同系物(immune deficiency homolog，IMD)信號通路是調(diào)節(jié)甲殼動物固有免疫的主要信號傳導(dǎo)途徑，而Relish是IMD信號通路中的關(guān)鍵因子，Bai等發(fā)現(xiàn)，Relish參與了中華絨螯蟹對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的免疫防御過程；Zhang等發(fā)現(xiàn)，Relish在克氏原螯蝦中能誘導(dǎo)基因的表達；絲裂原激活的蛋白激酶途徑(MAPK)能夠通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白來發(fā)揮調(diào)控功能，如細胞分化、凋亡、增殖和免疫反應(yīng)。筆者所在課題組前期運用RNA-seq測序技術(shù)，結(jié)合本研究的微流體芯片技術(shù)，全面分析了正常和感染螺原體的中華絨螯蟹血細胞mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示，許多免疫相關(guān)miRNA及其靶基因均表達顯著差異。它們參與了一些典型免疫相關(guān)途徑，包括補體和凝血級聯(lián)途徑、VEGF信號途徑、Wnt信號途徑、NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性、MAPK信號途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑和溶酶體途徑。

本研究同時通過對差異表達miRNA的靶基因進行了GO和KEGG功能分析，共注釋到116個GO通路和63個KEGG通路，主要集中于宿主的多種酶活性、代謝和免疫通路等，包括細胞免疫涉及的包囊、結(jié)節(jié)形成和吞噬作用，與體液免疫涉及的酚氧化酶激活系統(tǒng)(proPO系統(tǒng))、凝血級聯(lián)和抗菌肽(AMP)的合成等。以上研究結(jié)果可為進一步深入研究中華絨螯蟹免疫機制提供科學(xué)理論依據(jù)，為水產(chǎn)經(jīng)濟動物蝦蟹該疫病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。