牟海青, 朱水芳, 徐 霞, 趙文軍*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100029; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128)

植原體與其他病原物相比發(fā)現(xiàn)較晚。1967年,日本科學(xué)家土居養(yǎng)二等首次在桑樹萎縮病中發(fā)現(xiàn)植原體[1]。近半個世紀(jì)的時間,植原體病害被誤認(rèn)為病毒病害。近年來,世界各地植原體病害大量報道,例如在中國南方廣泛分布的柑橘黃龍病一直以來被認(rèn)為是由韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter asiaticus)引起,直到2009年,蒲雪蓮等在柑橘黃龍病植株中發(fā)現(xiàn)植原體與韌皮部桿菌同時存在[2]。由于植原體目前仍不能進(jìn)行人工培養(yǎng),因此對其致病性、病害流行性、病害防治等方面研究仍處于初級階段。植原體病害對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失,各國間種苗調(diào)運以及其他農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易增加了病原傳播的風(fēng)險,在我國已經(jīng)有14種植原體被列為入境檢疫性有害生物。越來越多的植物細(xì)菌學(xué)與植物病毒學(xué)研究人員對植原體病害展開了研究。

1 植原體的病原學(xué)

植原體屬于細(xì)菌界,無細(xì)胞壁,由3層膜包被,呈現(xiàn)多態(tài)型,一般有球形、橢圓形、長桿形、梭形、帶狀等。球狀體的直徑一般在60～1 100 nm,需要在電子顯微鏡下觀察。植原體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有核糖體、螺旋絲狀物、各種代謝物質(zhì)、可溶性蛋白、rRNA及少量其他核糖核酸等,沒有細(xì)胞核,遺傳物質(zhì)為dsDNA。對四環(huán)素類抗生素敏感,而對青霉素不敏感。植原體專性寄生于植物韌皮部,主要靠吸食植物韌皮部汁液的昆蟲介體傳播,如葉蟬、茶翅蝽、飛虱、蚜蟲[3-5]等。此外,菟絲子、人工嫁接也能傳播植原體。

2 植原體的分類進(jìn)化與基因組學(xué)

植原體屬于細(xì)菌界柔膜菌綱、非醇原體科、植原體候選屬,是最小的細(xì)菌。從形態(tài)上來看,植原體不具有細(xì)胞壁,與動物菌原體十分相似,而非病毒;分析其16S rDNA同源性,植原體與非醇原體最為接近,而與動物菌原體差別較大,故推測植原體是由非醇原體進(jìn)化而來[1]。

從進(jìn)化上來看,植原體與菌原體、螺原體以及其他細(xì)菌關(guān)系較近。但植原體與螺原體、菌原體以及大腸桿菌在基因組以及合成代謝途徑方面仍存在較大的差異,如表1、2。

表1 植原體與其他細(xì)菌的基因組比較1)

表2 植原體與其他幾種細(xì)菌代謝途徑的比較1)

植原體與菌原體一樣,基因組中缺乏一些與氨基酸合成、脂肪酸合成、三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化有關(guān)的基因。與菌原體不同的是：植原體缺乏磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)以及從 UDP-半乳糖到1-磷酸葡萄糖的代謝過程。這說明植原體具有一種特殊的糖吸收與代謝系統(tǒng)。由于植原體生活在富含營養(yǎng)的寄主的細(xì)胞質(zhì)中,所以可能會發(fā)生退化——丟失許多菌原體含有的基因,或者植原體根本就沒有這些基因,靠吸收寄主的代謝產(chǎn)物而非自身合成。植原體含有編碼蔗糖磷酸化酶類的基因,但是不完整,沒有功能。推測由于在昆蟲體中含有的蔗糖非常少,不需要此基因的表達(dá),因此在進(jìn)化過程中丟失了此基因功能。盡管植原體缺乏代謝基因,但植原體有27個基因參與轉(zhuǎn)運系統(tǒng),例如：蘋果酸酯、金屬離子與氨基酸轉(zhuǎn)運體,其中有一些基因是多拷貝的。這說明了植原體能夠轉(zhuǎn)運寄主的一些代謝產(chǎn)物。植原體在侵染過程中吸收寄主的代謝產(chǎn)物,打破了寄主的代謝平衡,從而引起一系列的癥狀表現(xiàn)。除了與轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因,植原體中還有另外一些多拷貝基因,例如：uvrD 、h f lB 、tmk、daM與 ssb(占整個基因組的18%),這些基因在其他細(xì)菌中是單拷貝的。這可能就是植原體雖然缺失一些代謝基因,但是其基因組要比另一些病原物的還要大的原因。植原體中缺乏大部分的核苷酸合成相關(guān)基因,推測植原體不能合成核苷酸而是從其寄主中吸收。植原體基因組編碼葉酸合成的有關(guān)基因,這有利于植原體的自身調(diào)節(jié)從而適應(yīng)不同的植物或昆蟲環(huán)境。有趣的是,在植原體基因組中沒有有關(guān)A TP合成的基因,植原體是第1個被發(fā)現(xiàn)的缺乏ATP合成基因的微生物。推測植原體是用一種未知的機制來吸收寄主的ATP,或者植原體所利用的ATP主要是依賴于糖酵解途徑合成。細(xì)菌中,戊糖磷酸途徑是相對保守的,使細(xì)胞合成NADPH并獲得還原能力,提供用來合成核苷酸的5-磷酸核糖。但是在植原體的基因組中卻沒有參與此途徑的基因存在[6]。

分析已測得的植原體基因組,與洋蔥黃化植原體M株系(OY-M)基因組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)翠菊黃化叢枝植原體(AYWB)含有相對較小的重復(fù)序列的基因組?；蚪M中重復(fù)的部分大都成簇分布并能在基因組中移動(potential mobile units,PMU),這些PMU是植原體特有的。與動物菌原體不同,植原體缺乏DNA重組及修飾功能,而PMU可能會起到這種重組作用[7]。

由于不能進(jìn)行人工培養(yǎng),植原體的分類與其他細(xì)菌有所不同,主要依靠16S rDNA序列、tu f基因序列、rp基因序列以及secY基因序列的同源性進(jìn)行植原體候選屬內(nèi)的組與亞組的分類[8-11]。2007年,Wei等利用軟件分析已知植原體16S rDNA序列,通過RFLP分析,將已報道的植原體分為28個組,100個亞組。并且建議,當(dāng)植原體 16S rDNA的RFLP相似系數(shù)小于0.85時,可以歸為一個新的組[12],當(dāng)植原體16S rDNA的RFLP相似系數(shù)小于或等于0.97時,可以歸為一個新的亞組[13]。目前,已有26個植原體候選種正式發(fā)表,另外有7個植原體候選種的名字已經(jīng)廣泛引用,但仍未正式描述該植原體的有關(guān)信息[14]。IRPCM(2004)植原體/螺原體工作小組規(guī)定：植原體16S rRNA基因序列與已知命名的候選種的同源性小于97.5%則可以定為一個新的候選種;此外,當(dāng)傳播介體、天然寄主以及在分子生物學(xué)上有明顯差異的植原體也可以定位一個新的候選種[15]。

植原體由非醇原體進(jìn)化而來,單細(xì)胞,較小。植原體的基因組比其他細(xì)菌小得多,約500～1 000 kb,基因組富含AT,能夠寄生于植物與昆蟲兩大生物界。植原體基因組有一個很重要的特征,基因多聚集于序列可變區(qū)(sequence-variablemosaics,SVMs),這是由來自噬菌體的可動遺傳因子周期性攻擊并發(fā)生重組的結(jié)果。植原體SVMs中存在原噬菌體基因組的殘余,推測噬菌體對于植原體的進(jìn)化起了重要作用[16]。目前已有4種植原體的基因組全序列公布,包括洋蔥黃化植原體(onion yellow s phytoplasma strain M,OY-M)、翠菊黃化植原體(aster yellow s phytoplasma strain witches’broom,AY-WB)、蘋果叢生植原體(Candidatus Phy toplasmamali strain AT)、澳大利亞植原體候選種(Candidatus Phytop lasmaaustraliense)。其基因組特征如表3。

表3 4種植原體的基因組特征比較

3 植原體的危害與致病機理

植原體病害主要引起植物叢枝、黃化、綠變、花變?nèi)~、矮縮等癥狀,造成植株果實小、不結(jié)果,嚴(yán)重時可以引起植株枯死[3]。國際上已經(jīng)報道的植原體病害千余種,我國報道的相關(guān)植原體病害有百余種,危害嚴(yán)重的主要有棗瘋病、泡桐叢枝病和桑萎縮病等,受植原體侵染后木材與果實的產(chǎn)量、質(zhì)量明顯下降,長期以來給經(jīng)濟(jì)作物造成了巨大的危害。植原體病害在世界范圍內(nèi)越來越嚴(yán)重地危害著各國的經(jīng)濟(jì)作物,尤其是在葡萄、蘋果、桃、梨、杏、馬鈴薯等等水果或糧食作物上引發(fā)的病害,嚴(yán)重影響了各國之間的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易。因此,隨著新的植原體病害的不斷報道,各國也加強了對于植原體病害傳入本國的預(yù)警與防范。2006年,加拿大食品檢疫局(CFIA)啟動了針對葡萄黃化植原體的調(diào)查行動。同年10月20日,證實在大不列顛哥倫比亞省的葡萄園中發(fā)生葡萄黃化植原體(Boisnoir phytop lasMa)。據(jù)調(diào)查,此染病葡萄種苗為2006年從法國進(jìn)口,共約2000株[17]。2007年在安大略省的調(diào)查結(jié)果表明,2株來自法國的葡萄植株受到葡萄黃化植原體侵染,導(dǎo)致Bois noir病害[18]。葡萄黃化病嚴(yán)重影響了釀造葡萄酒的產(chǎn)量與質(zhì)量,是一種葡萄園毀滅性病害。

與病毒相比,植原體基因組較大,因此分析植原體的致病機理難度較大。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)測定,受16Sr-B亞組植原體侵染后除蟲菊組培苗中的除蟲菊酯含量明顯下降[19]。目前,多數(shù)專家認(rèn)為植原體的侵染干擾了植物的激素水平、碳水化合物的替代途徑、光合作用等,導(dǎo)致了癥狀的發(fā)生。受白蠟樹黃化植原體侵染后,長春花葉片光合作用中最大羧化率與非環(huán)式電子傳遞均受到抑制[20]。受植原體侵染后的葡萄葉片中光合色素、可溶性蛋白、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶以及光合作用均受到抑制,光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)受到嚴(yán)重影響,而光合系統(tǒng)I(PSⅠ)略受影響[21]。受植原體侵染后長春花葉片中苯基丙酸類合成途徑與萜類吲哚生物堿途徑大大增加,同時蔗糖、葡萄糖、綠原酸、開鏈馬錢子甙(secologanin)等含量顯著增加。推測植原體侵染后植物葉片失綠很可能是由糖類的積累造成,因為糖類的積累可以抑制光合作用相關(guān)基因的表達(dá)[22]。通過分析轉(zhuǎn)錄組的差異,Boisnoir植原體侵染葡萄后,碳水化合物代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào),而光合作用相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制,與激素合成、代謝、調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)也發(fā)生了明顯的變化[23]。HPLC分析發(fā)病與健康泡桐內(nèi)源激素和酚類物質(zhì)含量,發(fā)現(xiàn)病株游離IAA含量明顯低于健康植株,并且IAA含量與鄰苯二酚含量呈顯著的正相關(guān)。而細(xì)胞分裂素(Z+ZR,iPA)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)含量變化不明顯[24]。

由于植原體不能進(jìn)行人工培養(yǎng),基因組編碼幾百個基因,因此找出致病基因不是一項容易的工作。多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌是通過TTSS分泌系統(tǒng)分泌毒性因子改變植物的正常生理系統(tǒng)、降低植物的免疫力。植原體基因組中缺乏TTSS分泌系統(tǒng)相關(guān)基因,但可以通過Sec轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將細(xì)胞內(nèi)的蛋白運輸出植原體細(xì)胞外。分泌到植物細(xì)胞質(zhì)中的植原體蛋白很有可能是引起植物發(fā)病的致病因子。Hoshi等分析洋蔥黃化植原體基因組,并在本生煙與擬南芥中表達(dá)分泌蛋白,發(fā)現(xiàn) TENGU蛋白是洋蔥黃化植原體引起植物叢枝與矮縮的一個致病因子[25]。TENGU是一個較小的蛋白,成熟的 TENGU蛋白僅有38個氨基酸,不僅存在植物的韌皮部,而且能夠分布到植物的其他細(xì)胞中。TENGU蛋白能夠引起植物中生長素有關(guān)基因表達(dá)下調(diào),推測通過抑制生長素信號與生長素合成致使植物表現(xiàn)叢枝與矮縮的癥狀[25]。

此外,有文獻(xiàn)報道,受植原體侵染后,葡萄、榆樹等植株中的內(nèi)生菌群落發(fā)生了明顯的變化[26-27]。

4 植原體病害的防控

抗生素類藥物是目前治療植原體病害最常用的藥物。植原體細(xì)胞無細(xì)胞壁,僅由3層膜包被,對青霉素等抗生素不敏感,但能被四環(huán)素族抗生素所抑制,如金霉素、土霉素和脫甲基氯四環(huán)素[3]。生長素類物質(zhì)3-吲哚丁酸(IBA)與IAA加入培養(yǎng)基中,可以使發(fā)病長春花癥狀消失,且IBA的作用效果較好。IBA與IAA能夠去除發(fā)病長春花組培苗中的HYDB植原體,但不能完全去除長春花組培苗的EY-C與SA-I植原體[28-29]。在利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)防治植原體病害方面,將抗菌肽shiva-1基因轉(zhuǎn)入泡桐后,泡桐表現(xiàn)明顯的抗叢枝病性狀[30]。植原體病害主要靠昆蟲介體、人工嫁接、菟絲子等途徑傳播,因此通過阻斷傳播途徑也是一種很好的防治途徑。

近年來,受植原體侵染植株表現(xiàn)癥狀后一段時間癥狀又消失的現(xiàn)象引起了研究人員的興趣。2004-2006年,在弗留利-威尼斯-朱利亞地區(qū)的19個葡萄園中發(fā)現(xiàn)有葡萄黃化癥狀恢復(fù)現(xiàn)象。第1年恢復(fù)50%,第2年恢復(fù)70%,第3年基本上全部恢復(fù)[31]。在蘋果叢生病中同樣存在發(fā)病植株恢復(fù)健康的現(xiàn)象,并且蘋果樹冠未檢測到植原體,僅在根部能檢測到植原體存在。通過比較健康、發(fā)病、恢復(fù)的蘋果植株中過氧化氫(H 2O2)、過氧化氫酶、還原型谷胱甘肽等含量的變化,恢復(fù)健康的植株中過氧化氫、還原型谷胱甘肽含量較高,過氧化氫酶含量較低。說明在恢復(fù)健康的植株中氧化劑清除系統(tǒng)活性降低,引起過氧化氫的積累,過多的過氧化氫可以與病原物的毒性因子發(fā)生作用[32]。

隨著對植原體的研究增多,越來越多的由植原體引起的重要農(nóng)作物病害被報道,并且研究工作也不斷深入,包括基因組測序致病性機理研究等,對植原體引起的寄主植物病變與癥狀的表現(xiàn)機理有了初步認(rèn)識。植原體引起植物發(fā)病癥狀的原因可以歸為：引起激素的紊亂、與寄主植物碳水化合物代謝途徑的互作、抑制寄主防衛(wèi)系統(tǒng)活性、分泌毒性因子等。對于植原體病害的防治,除四環(huán)素類抗生素及IBA等生長素類物質(zhì)的應(yīng)用有較明顯效果外,目前仍未發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的藥物。

有關(guān)發(fā)病蘋果與葡萄植株恢復(fù)健康的現(xiàn)象,推測內(nèi)生菌起了關(guān)鍵作用;已發(fā)現(xiàn)榆樹、葡萄等感病植株與抗病植株在內(nèi)生菌群落上有較大差異。通過研究,植物內(nèi)生菌落的差異會給今后的植原體病害防治與控制提供啟發(fā)與依據(jù)。

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