谷麗嬌，黃麗鴿，盛 丹，范新陽，苗永旺

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

催乳素(prolactin，PRL)是一種蛋白類激素，其名稱最早來自于對(duì)家鴿的研究，研究發(fā)現(xiàn)家鴿的嗉囊乳是因催乳素刺激嗉囊上皮細(xì)胞增生引起的，隨后從兔腺垂體前葉分離提純得到催乳素[1]。催乳素與生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)和胎盤催乳素(placental lactogen，PL)同屬于生長(zhǎng)激素/催乳素基因家族[2]。哺乳動(dòng)物PRL 的生物學(xué)功能主要與乳腺發(fā)育、啟動(dòng)和維持泌乳及乳蛋白基因的表達(dá)有關(guān)，并對(duì)乳蛋白、乳糖和乳脂等乳成分的合成起主要調(diào)控作用，與產(chǎn)奶量和乳成分呈正相關(guān)[3]。在奶牛泌乳期間，PRL 發(fā)揮“能量遷移”作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體將肝臟、肌肉和脂肪等組織的營養(yǎng)和能量?jī)?yōu)先流向乳腺，用于乳脂和乳蛋白合成[4]。因此，PRL被列為與奶牛泌乳性狀密切相關(guān)的重要候選基因。

普通牛PRL基因定位于23 號(hào)染色體，包含5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，CDS 長(zhǎng)690 bp，編碼229 個(gè)氨基酸，1～30 位氨基酸組成信號(hào)肽[5]。有研究報(bào)道：PRL基因與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白、乳脂和乳糖含量有關(guān)[6]。WALL 等[7]給牛連續(xù)3 周注射少量催乳素后產(chǎn)奶量增加，而給泌乳奶牛注射催乳素的抑制劑溴麥角隱亭可使產(chǎn)奶量下降[8]。杜挺媛等[9]對(duì)廣西水牛PRL基因進(jìn)行克隆，其完整編碼區(qū)長(zhǎng)690 bp，編碼229 個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)存在2 個(gè)核苷酸替換位點(diǎn)，分別為c.T430C 和c.T576G。袁峰等[10-11]在檳榔江水牛PRL基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)c.C109T 和c.G192A 兩個(gè)核苷酸替換位點(diǎn)。

隨著泌乳生物學(xué)研究逐漸深入，已有研究表明Janus 激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyci，mTOR)信號(hào)通路介導(dǎo)的生物學(xué)過程與乳蛋白合成密切相關(guān)[12-14]。德宏奶水牛是在云南省德宏州通過當(dāng)?shù)氐潞晁Ｅc國外引進(jìn)的摩拉水牛和尼里拉菲水牛雜交形成的高代雜交群體，具有較高的河流型水牛血統(tǒng)(≥75%)，是進(jìn)行泌乳性狀研究的理想素材[15]。本研究以德宏奶水牛為研究對(duì)象，對(duì)水牛PRL基因進(jìn)行分離鑒定、生物信息學(xué)以及泌乳期和非泌乳期的多組織差異表達(dá)分析，旨在揭示德宏奶水牛PRL基因的理化特性和生物學(xué)功能，為深入研究水牛PRL基因的功能及其參與的信號(hào)路徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用于基因分離鑒定的樣品采自云南省德宏州芒市。選取4 頭成年健康的雌性德宏奶水牛(約4 歲，第3 胎)，其中2 頭處于泌乳高峰期(產(chǎn)后約60 d)，2 頭處于干奶期(分娩前約60 d)。水牛屠宰后對(duì)心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、瘤胃、小腸、肌肉和乳腺等組織進(jìn)行取樣，并立即保存在液氮中，直至進(jìn)一步處理。所有組織樣品進(jìn)行總RNA 的提取，用于基因分離和組織差異表達(dá)分析。所有取樣水牛的飼養(yǎng)條件一致。

1.2 總RNA 的提取和cDNA 的合成

使用RNAiso Plus 試劑盒(TaKaRa，中國大連)分離組織總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其完整性進(jìn)行檢測(cè)，用紫外可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測(cè)其濃度和純度。使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，中國大連)合成cDNA。

1.3 水牛PRL 基因CDS 克隆及鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

以NCBI 數(shù)據(jù)庫中水牛PRL基因的mRNA 序列(EF054878.1)為參考序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增水牛PRL基因完整編碼區(qū)及用于該基因表達(dá)譜分析的引物 (F：TTCCTGGTGAAGTGTGTTTCT，R：AATGTGGGCTTAGCAGTTG，退火溫度58.8 ℃);以水牛ACTB基因序列(NM_001290932.1)設(shè)計(jì)用于半定量RT-PCR 的內(nèi)參基因引物 (F：TCTTGGTCACCTCGTCGTC，R：GGCGCGATGATCTTGAT，退火溫度60 ℃)。引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR 反應(yīng)及條件

以乳腺組織cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，2×EsTaqMaster Mix 5 μL(康為，中國北京)，模板cDNA 1 μL (50 ng/μL)和ddH2O 3.2 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、58.8 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s (35 個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增效果好的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

測(cè)序獲得的序列采用SeqMan 和EditSeq 軟件 (DNAStar Inc.，美國)進(jìn)行序列核對(duì)并輸出。經(jīng)ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)識(shí)別確定開放閱讀框，獲得德宏奶水牛PRL基因CDS 序列；以該序列作為查詢序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 同源搜索，確定所獲得序列的基因?qū)傩浴?/p>

1.4 分子特征、進(jìn)化關(guān)系和分子功能分析

為確定水牛PRL基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，將其與其他9 個(gè)物種的同源區(qū)進(jìn)行比較。?？莆锓N及鼠和人的PRL基因信息從NCBI 數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=) 下載的基因組注釋文件獲得，使用TBtools 中的GXF 功能修復(fù)PRL基因完整的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)，采用在線軟件Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/)對(duì)PRL基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。通過Megalign 輸出所有PRL 氨基酸序列的一致性?；赑RL 氨基酸序列，使用MEGA 7 軟件的最大似然法(JTT矩陣模型)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。將每個(gè)物種的PRL 序列提交到MEME (https://meme-suite.org/meme/) 網(wǎng)站進(jìn)行保守基序的下載。將所有物種的PRL 序列導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫的 Web CD-Serach (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sructure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)工具進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析。將系統(tǒng)發(fā)育樹、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果輸入到TBtools 的Gene Structure View (Advance)工具進(jìn)行結(jié)果可視化。本研究克隆獲得的德宏奶水牛PRL基因序列命名為Dehong Dairy buffalo (Dhd_buffalo)，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)具有完整CDS 的?？莆锓N主要轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比較，網(wǎng)上序列信息見表1。

表1 PRL 基因序列來源Tab.1 Sequence source of PRL gene

利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)和 Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)分別預(yù)測(cè)PRL 蛋白的理化特征，包括疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、理論分子量和等電點(diǎn)。利用在線軟件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html) 和 WISSMODEL (https://swissmodel.expasy.org/)同源建模方法分別對(duì)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 和 Prosite Scan (http://prosite.expasy.org/prosite.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位和氨基酸修飾。使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/seach/sequence-search)、Uniprot (http://www.uniprot.org/)和DAVID (http://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子功能和生物學(xué)路徑分析。

1.5 水牛PRL 基因組織差異表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR 方法，以水牛ACTB基因作為內(nèi)參 (內(nèi)參引物見1.3.1 節(jié))，檢測(cè)德宏奶水牛PRL基因在泌乳期和非泌乳期心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、瘤胃、小腸、肌肉和乳腺等11 個(gè)組織的表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與1.3.2 節(jié)的基因克隆相同。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后采用Quantity One 軟件對(duì)組織表達(dá)譜檢測(cè)膠圖進(jìn)行分析，得出相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)?；谠摂?shù)據(jù)，采用Excel 軟件構(gòu)建基因表達(dá)譜柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛PRL 的克隆與鑒定

本研究得到750 bp 的PCR 產(chǎn)物(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)獲得的序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)識(shí)別，發(fā)現(xiàn)該序列的CDS 全長(zhǎng)690 bp，編碼229 個(gè)氨基酸(圖2)。該CDS 序列與普通牛、野牛、牦牛、瘤牛、山羊、綿羊和藏羚羊PRL基因CDS 序列同源性均為99.6%，故確定所獲序列為德宏奶水牛PRL基因序列。序列分析表明：水牛PRLCDS 區(qū)序列的A、G、T 和C 堿基含量分別為25.07%、23.77%、23.33%和27.83%，G+C的含量為51.59%。

圖1 德宏奶水牛PRL 基因RT-PCR 產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR product of Dehong dairy buffalo PRL gene

圖2 本研究獲得的德宏奶水牛PRL 基因CDS 區(qū)序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.2 Complete CDS of Dehong dairy buffalo PRL gene and its encoded amino acid sequence in this study

2.2 分子特征、進(jìn)化關(guān)系和分子功能

2.2.1PRL基因結(jié)構(gòu)

由圖3 和表2 可知：在?？莆锓N中，每個(gè)?？莆锓N的PRL基因CDS 長(zhǎng)度相同，外顯子2、外顯子3 和外顯子4 的長(zhǎng)度相同，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的位置不相同，5′UTR 和3′UTR 的長(zhǎng)度不同，外顯子1 和外顯子5 的長(zhǎng)度也不同。所有?？莆锓N含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子。

圖3 PRL 基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)Fig.3 The structure of PRL transitional region

表2 水牛與其他物種PRL 結(jié)構(gòu)信息Tab.2 Structural information of PRL in buffalo and other species

2.2.2 PRL 蛋白的理化特征

由表3 可知：德宏奶水牛PRL 蛋白與其他?？莆锓NPRL 的基本理化特征相似性較高。德宏奶水牛PRL 蛋白為親水的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)表明：德宏奶水牛PRL 蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，含有1 個(gè)位于N 端1～30 的信號(hào)肽，成熟肽由之后的199 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。

表3 PRL 蛋白基本理化特征Tab.3 Basic physicochemical characteristics of PRL protein

2.2.3 水牛PRL 功能修飾位點(diǎn)

對(duì)德宏奶水牛PRL 蛋白功能修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：PRL 蛋白中潛在的功能修飾位點(diǎn)有5 種(表4)。

表4 水牛PRL 的功能修飾位點(diǎn)Tab.4 Function modification sites in buffalo PRL

2.2.4 基序、保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系

由圖4 可知：水牛與其他牛科物種的PRL 氨基酸序列一致性達(dá)97.4%以上。

圖4 水牛與本研究其他9 個(gè)物種間PRL 的氨基酸序列一致性Fig.4 The consistency of PRL amino acid sequences between buffalo and other nine species in this study

對(duì)9 種哺乳動(dòng)物的PRL 氨基酸序列基序和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)顯示：?？莆锓N含有7 個(gè)基序，分別為motif1～motif7，人含有8 個(gè)基序，分別為motif1～motif5、motif7～motif9。水牛與其他?？莆锓N及人均含有1 個(gè)prolactin_like 保守結(jié)構(gòu)域。?？莆锓N的prolactin_like 結(jié)構(gòu)域(AA32～229)由motif1～motif4 和motif6～motif7組成，人的proactin_like 結(jié)構(gòu)域(AA30～228)由motif1～motif4 和motif7～motif9 組成。水牛PRL 和其他?？莆锓N存在相同的基序和保守結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)?？莆锓N的結(jié)構(gòu)域起始位置均為AA32～229，說明?？莆锓NPRL 蛋白之間功能相似。

圖5 水牛與本研究其他9 個(gè)物種 PRL 的系統(tǒng)發(fā)育樹、基序構(gòu)成和保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Phylogenetic tree,motif composition and conserved domain based on the PRL sequences of buffalo and other nine species in this study

基于PRL 氨基酸序列構(gòu)建水牛及其他9 個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖5)顯示：水牛與其他?？莆锓N聚在一起。

2.2.5 PRL 二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成和三級(jí)結(jié)構(gòu)

德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成如圖6 所示。水牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折疊和無規(guī)卷曲含量分別為56.77%、1.75%、1.75%和39.74%，普通牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折疊和無規(guī)卷曲含量分別為59.39%、2.18%、3.06%和35.37%。德宏奶水牛和普通牛PRL 與模板大鼠PRL (3 npz.1.A)的序列一致性均為73.87%，覆蓋率均為87%，覆蓋區(qū)域也均為AA31～229，其保守結(jié)構(gòu)域(AA32～229)完全在覆蓋區(qū)域，德宏奶水牛PRL 的三級(jí)結(jié)構(gòu)與普通牛的極其相似(圖7)。

圖6 德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of the secondary structure composition of PRL protein in Dehong dairy buffalo and cattle

圖7 德宏奶水牛和普通牛PRL 成熟肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of the mature peptide of Dehong dairy buffalo and cattle PRL

2.3 水牛PRL 的生物學(xué)過程和分子功能

預(yù)測(cè)表明：德宏奶水牛PRL 為分泌到細(xì)胞膜外的蛋白，屬于生長(zhǎng)激素/催乳素家庭成員。其參與負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡(GO：0001973)、肽激素分泌(GO：0030072)、正調(diào)控脂肪酸合成(GO：00457-23)和正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)(GO：0010628)的生物學(xué)過程；其分子功能主要是激素激活(GO：00-05179)和與催乳素受體結(jié)合(GO：0005148)；其參與的路徑是細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用(GO：0007267)、神經(jīng)活性配體與受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路(GO：0014068)、JAK-STAT信號(hào)通路(GO：0046427)和催乳素信號(hào)通路。

2.4 水牛PRL 組織差異表達(dá)分析

由圖8 可知：PRL基因在所檢測(cè)的2 個(gè)時(shí)期的11 個(gè)德宏奶水牛組織中均有表達(dá)。其中，PRL基因在非泌乳期的脾臟中表達(dá)量最高，其次是肝臟和肌肉；在泌乳期的乳腺中表達(dá)量較高。PRL基因在肺臟、乳腺、瘤胃、小腦和小腸中的表達(dá)表現(xiàn)為泌乳期高于非泌乳期；在脾臟、肝臟、心臟、大腦、肌肉和腎臟中的表達(dá)則相反。

圖8 德宏奶水牛PRL 基因組織差異表達(dá)Fig.8 Tissue differential expression of the PRL gene in Dehong dairy buffalo

3 討論

本研究對(duì)德宏奶水牛PRL基因進(jìn)行了分離鑒定，確定其PRL基因CDS 序列長(zhǎng)690 bp，編碼1 個(gè)由229 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽。PRL 蛋白屬于生長(zhǎng)激素/催乳素家族，本研究發(fā)現(xiàn)其含有1 個(gè)prolactin_like 結(jié)構(gòu)域(AA32～229)。含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白主要功能為正調(diào)控動(dòng)物泌乳。有研究表明：雞和斑馬魚的prolactin_like 是催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)的替代配體，prolactin_like 可以通過PRLR 在許多靶組織中發(fā)揮自分泌或旁分泌作用[17-18]。德宏奶水牛PRL基因的結(jié)構(gòu)與其他?？莆锓N相似，其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和三級(jí)結(jié)構(gòu)與普通牛也有很高的相似性。PRL 蛋白的基序和保守結(jié)構(gòu)域在牛科物種之間高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：德宏奶水牛與其他?？莆锓N聚為一類，揭示它們之間的PRL 功能更相似?；谒RL基因轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)、其編碼蛋白基序和保守結(jié)構(gòu)域分析，揭示PRL 在水牛與其他?？莆锓N中的功能一致。

研究發(fā)現(xiàn)：乳蛋白合成的2 條主要信號(hào)通路為JAK-STAT 通路和磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(sphatidylinositol 3-kinase-AKT serine/threonine kinase-mammalian target of rapamyci，PI3K-AKT-mTOR)信號(hào)通路[19]。本研究預(yù)測(cè)顯示：PRL 參與了JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 信號(hào)通路。JAK2-STAT 信號(hào)通路是在催乳素作用下酪蛋白合成轉(zhuǎn)錄水平的重要途徑之一[20]。PRL 通過與PRLR 結(jié)合，啟動(dòng)JAK-STAT信號(hào)途徑并激活反式作用因子STAT，使STAT作用于乳蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的靶序列，啟動(dòng)或增強(qiáng)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)[21-22]。在牛乳腺組織中，PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路控制著乳蛋白相關(guān)基因的翻譯。催乳素也可以調(diào)節(jié)PI3K-AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，添加催乳素后 PI3K 的p85 亞基、PRLR的p95 亞基及胰島素受體底物1 (insulin receptor substrate 1，IRS1)的p185 亞基的酪氨酸磷酸化增加，使PI3K 和IRS1 共同與PRLR結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)節(jié)乳腺功能的作用[14]。本研究預(yù)測(cè)水牛PRL 蛋白正調(diào)控脂肪酸合成的生物學(xué)過程。研究表明：催乳素可極顯著提高牛乳腺組織中與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)量[23]，與本研究的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)：PRL 能激活奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的 JAK2-STAT5 信號(hào)通路，進(jìn)而提高乳脂和乳蛋白的合成[24]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在淋巴瘤細(xì)胞中添加PRL 可激活 PI3K-AKT 通路，被激活的AKT 能調(diào)節(jié)與蛋白和脂類代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子活性，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和mTOR 等，進(jìn)而參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成[25]。本研究揭示水牛PRL 蛋白與其他?？莆锓N的PRL 蛋白功能相似，推測(cè)水牛PRL 在JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 乳蛋白信號(hào)通路及乳脂合成過程中發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)成熟的必要步驟是翻譯后的修飾加工，而磷酸化修飾對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用，磷酸化修飾與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等過程相關(guān)[26]。酪氨酸激酶介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與PI3K-Akt 和JAK-STAT 通路，在細(xì)胞的代謝、分裂、分化、生物功能和死亡過程中起著重要作用[27]。酪蛋白激酶Ⅱ作為參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子，通過對(duì)底物的磷酸化作用而影響細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和加工以及細(xì)胞凋亡[28]。N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)是一種蛋白質(zhì)脂質(zhì)修飾位點(diǎn)，它在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)靶向內(nèi)膜和質(zhì)膜系統(tǒng)中起著重要作用[29]。本研究也預(yù)測(cè)到了這些修飾位點(diǎn)，但其在德宏奶水牛PRL 蛋白中的功能還有待研究。

研究表明：PRL在垂體、乳腺、淋巴、大腦、卵巢、腎臟和脾臟等組織中表達(dá)[30]。本研究所檢測(cè)的德宏奶水牛泌乳期和非泌乳期11 個(gè)組織中均有PRL表達(dá)，說明該基因在多種組織中發(fā)揮作用。在本研究中，PRL基因在小腸中的表達(dá)量表現(xiàn)為泌乳期高于非泌乳期。在大鼠哺乳期誘導(dǎo)小腸中PRL的升高可增加腸道對(duì)鈣的吸收，進(jìn)而滿足胎兒生長(zhǎng)和母鼠產(chǎn)奶的鈣需求[31]。還有研究報(bào)道：PRL基因在大鼠乳腺中表達(dá)，且持續(xù)整個(gè)泌乳期，在斷奶早期PRL基因的表達(dá)開始下降，乳腺上皮細(xì)胞開始退化[32]。體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的研究表明：添加催乳素可以促進(jìn)β-酪蛋白基因表達(dá)及β-酪蛋白合成[33]。缺少PRL基因可導(dǎo)致產(chǎn)奶量持續(xù)降低，乳腺泌乳細(xì)胞數(shù)量可在48 h 內(nèi)減少20%～25%[34]。PRL在泌乳期乳腺中的表達(dá)量顯著高于非泌乳期，表明該基因在泌乳期乳腺組織中發(fā)揮重要作用。在泌乳期PRL 表達(dá)水平變化激活STAT5a 及其信號(hào)途徑，結(jié)果是降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡并提高乳蛋白合成[35]。有研究顯示：用催乳素處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，在催乳素質(zhì)量濃度為200 μg/L 時(shí)能顯著提高AKT、mTOR、糖體蛋白S6 激酶1、真核細(xì)胞翻譯起始因子和β-酪蛋白的表達(dá)量[36]。PRL參與了JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 乳蛋白合成信號(hào)通路，推測(cè)德宏奶水牛PRL基因可能參與泌乳期乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白的合成。

4 結(jié)論

德宏奶水牛PRL基因CDS 長(zhǎng)690 bp，編碼1 個(gè)由229 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，是含有1 個(gè)prolactin_like 結(jié)構(gòu)域的膜外分泌蛋白。水牛PRL的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的理化特征、結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域與其他?？莆锓N的一致性很高，說明PRL 的功能在水牛與其他?？莆锓N間高度保守。水牛PRL 無跨膜結(jié)構(gòu)，含有1 個(gè)信號(hào)肽，其作為胞外蛋白與PRLR 結(jié)合發(fā)揮作用。PRL在水牛包括乳腺在內(nèi)的多個(gè)組織中都有表達(dá)，推測(cè)該基因可能通過JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路參與德宏奶水牛的泌乳過程。