陸春宇，狄義寧，黎青虹，劉 涵，劉魯峰，何麗蓮, ，李富生,,3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘蔗研究所，云南 昆明 650201；3.云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

甘蔗(Saccharum officinarumL.)是制糖、乙醇和甜味劑的主要原料，同時(shí)也是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)能源作物之一[1]，中國(guó)每年以甘蔗制作的糖占中國(guó)食糖總產(chǎn)量的80%以上[2]。近年來(lái)，因追求甘蔗增產(chǎn)而過(guò)度使用化肥和農(nóng)藥導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)區(qū)環(huán)境污染的現(xiàn)象日益突出，如何保證甘蔗產(chǎn)量并減少環(huán)境污染成了亟待解決的問(wèn)題。針對(duì)這一情況，有學(xué)者試圖通過(guò)微生物菌劑的開(kāi)發(fā)與利用解決該問(wèn)題，其中甘蔗內(nèi)生菌作為一類特殊的微生物群體受到廣泛關(guān)注。自1993 年D?BEREINER等[3]提出“diazotrophic endophytes”一詞后，大量甘蔗內(nèi)生菌被分離并報(bào)道，其主要類群有固氮螺菌屬(Azospirillum)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)[4]。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類好氧或兼性厭氧、形如桿狀的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。它不僅對(duì)人畜無(wú)害、不污染環(huán)境、繁殖速度快，而且生理活性強(qiáng)[5]，是植物內(nèi)生菌中應(yīng)用價(jià)值廣泛的一大類細(xì)菌，常用于開(kāi)發(fā)各類功能的微生物菌劑，近年來(lái)受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。常華瑜等[6]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)對(duì)宿主植物具有較好的促進(jìn)生長(zhǎng)作用；龔國(guó)利等[7]發(fā)現(xiàn)多數(shù)內(nèi)生芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物有利于宿主生長(zhǎng)，具有廣譜抑菌能力，可在農(nóng)作物生物防治和環(huán)境修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。在研究芽孢桿菌對(duì)病原菌抗病活性測(cè)定試驗(yàn)中，通常以分泌嗜鐵素含量作為評(píng)價(jià)其具有抗病活性的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)生芽孢桿菌產(chǎn)生的嗜鐵素比真菌產(chǎn)生的嗜鐵素對(duì)鐵元素的親和力強(qiáng)。因此，利用植物內(nèi)生芽孢桿菌所產(chǎn)生的鐵載體與病原真菌爭(zhēng)奪生存所需的鐵離子，可降低病原菌種群數(shù)量，間接幫助宿主植物抵御病害侵染[8]。內(nèi)生芽孢桿菌還具有溶解磷酸鹽的作用，可為宿主植物增加礦質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而促進(jìn)植物體內(nèi)的能量傳遞、細(xì)胞分裂和物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)以及根系發(fā)育，提高植物的整體抗逆性。此外，內(nèi)生芽孢桿菌還能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和纖維素酶，以降解病原真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素，瓦解病原菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致其死亡從而起到抑菌作用[9]。

本研究以前期分離儲(chǔ)存的3 株甘蔗內(nèi)生芽孢桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行廣譜抑菌活性與促生能力分析、生理生化檢測(cè)與分子生物學(xué)相關(guān)鑒定，以期為甘蔗微生物肥料的開(kāi)發(fā)提供菌株材料，也為同類研究提供一定的參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試甘蔗內(nèi)生芽孢桿菌

菌株P(guān)8 和Q2 分離自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗資源圃中的栽培種閩糖69-421 的根，菌株P(guān)7 分離自栽培種滇蔗01-58 的莖。

1.1.2 供試病原菌

供試甘蔗梢腐病病原菌串珠鐮刀菌(Fusari-um moniliforme)分離自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所資源圃；煙草炭疽病病原菌(Colletotrichum micotianaeAverna)、玉米紋枯病病原菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷莖腐病病原菌禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、玉米大斑病病原菌大斑凸臍蠕孢菌(Exserohilum turcicum)和玉米小斑病病原菌玉蜀黍離蠕孢菌(Bipolaris maydis)均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 病原菌抑制能力與促生長(zhǎng)抑菌指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1 菌株的活化

甘蔗內(nèi)生芽孢桿菌的活化：用移液槍吸取約200 μL 甘油保存的菌液，接種至LB 液體培養(yǎng)基[10]后置于恒溫?fù)u床中，設(shè)置溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，用接種環(huán)沾取細(xì)菌培養(yǎng)液在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，置于35 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

供試病原菌的活化：用無(wú)菌鑷子夾取濾紙保存的病原菌于PDA 培養(yǎng)基[10]，置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 廣譜抑菌效果測(cè)定

采用平板對(duì)峙法[11]，用直徑為5 mm 的打孔器在長(zhǎng)滿病原菌菌絲的PDA 培養(yǎng)基中打孔，將菌餅接入新的PDA 培養(yǎng)基中心。將活化后的甘蔗內(nèi)生菌用接種環(huán)挑取菌落接種至距病原菌中心3 cm 處，處理重復(fù)3 次，以未接種內(nèi)生芽孢桿菌為對(duì)照。置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至對(duì)照病原菌長(zhǎng)滿平板后，采用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組半徑和處理組半徑，并根據(jù)公式計(jì)算其抑菌率：抑菌率=[(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑 ]×100%。

1.2.3 菌株產(chǎn)嗜鐵素能力的測(cè)定

采用CAS 平板法[12]測(cè)定嗜鐵素活性。將活化的內(nèi)生菌株接種至CAS 培養(yǎng)基，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d，觀察內(nèi)生菌株是否能正常生長(zhǎng)，并記錄菌落直徑(d)以及周圍產(chǎn)生的黃色透明光圈直徑(D)，計(jì)算可溶性指數(shù)(D/d)?？扇苄灾笖?shù)值越大，表明菌株嗜鐵素合成能力越強(qiáng)。

采用王平等[13]的方法測(cè)定嗜鐵素相對(duì)含量。將產(chǎn)生黃色透明光圈的菌株接種于裝有50 mL MKB 液體培養(yǎng)基的100 mL 錐形瓶中，放置于恒溫?fù)u床中，設(shè)置溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)7 d，吸取培養(yǎng)基置于10 000 r/min 離心機(jī)中離心10 min，取3 mL CAS 液體培養(yǎng)基與等量的上清液混合后，在黑暗條件下反應(yīng)1 h，以不接菌株的MKB 作對(duì)照。用分光光度計(jì)在630 nm 處測(cè)定7 d 內(nèi)各處理的OD 值，處理組和對(duì)照組的吸光度分別記為As 和Ar，計(jì)算嗜鐵素的相對(duì)含量(As/Ar)。As/Ar 值越小，菌株合成嗜鐵素的能力越強(qiáng)。

1.2.4 菌株溶磷能力的測(cè)定

采用平板溶磷圈法[14-15]，將菌株接種至植酸鈣和NBRIP 固體培養(yǎng)基中，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d 后觀察內(nèi)生菌株是否能正常生長(zhǎng)，并記錄菌落直徑(d)以及周圍產(chǎn)生的透明光圈直徑(D)，計(jì)算可溶性指數(shù)(D/d)?？扇苄灾笖?shù)值越大，表明菌株對(duì)磷的利用能力越強(qiáng)。

可溶性磷含量的測(cè)定：將產(chǎn)生透明圈的菌株分別接種于植酸鈣和NBRIP 液體培養(yǎng)基中，以不接菌的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)9 d 后采用鉬藍(lán)法測(cè)定菌株溶磷量[16]。測(cè)定1～9 d 培養(yǎng)液在850 nm 處的OD 值，根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算菌株可溶性磷含量。

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配置1 mol/L K2HPO4溶液，加入去離子水稀釋成梯度為200、400、600、800 和1 000 μmol/L 的溶液。各梯度加入鉬藍(lán)法配置的染液[16]，室溫條件染色30 min，測(cè)定其在850 nm 處的OD 值。以吸光度為縱坐標(biāo)、磷濃度為橫坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 菌株纖維素酶活性測(cè)定

采用剛果紅平板法[17]。將各菌株接種于CMCNa 培養(yǎng)基中，每個(gè)平板接種3 個(gè)區(qū)域，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用1 mg/mL 剛果紅溶液染色1 h 后，加入濃度為1 mol/L 的氯化鈉溶液脫色。觀察菌株是否能正常生長(zhǎng)，并記錄菌落直徑(d)以及周圍產(chǎn)生的黃色透明光圈直徑(D)，計(jì)算可溶性指數(shù)(D/d)?？扇苄灾笖?shù)值越大，表明菌株的纖維素酶活性越強(qiáng)。

采用吳靜[18]的方法進(jìn)一步測(cè)定各菌株的酶活性。將各菌株接種于裝有50 mL CMC-Na 液體培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。取培養(yǎng)液在室溫條件下12 000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液于50 mL離心管中，加入1 mL CMC-Na 檸檬酸溶液混合，在50 ℃水浴鍋中加熱30 min，之后加入3 mL DNS 染色液混合后置于沸水加熱10 min，冷卻后加入純水補(bǔ)至25 mL，測(cè)定540 nm 處的OD 值。

1.2.6 優(yōu)良抑菌指標(biāo)菌株的鑒定

生理生化特征鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]測(cè)定菌株的硝酸還原酶活性、淀粉水解、V-P 顯色、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化和革蘭氏染色等生理生化特征。

分子生物學(xué)鑒定：采用CHENG 等[20]的分子生物學(xué)鑒定方法提取內(nèi)生細(xì)菌DNA。提取16S rRNA 與GyrA基因片段，16S rRNA 基因片段采用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3'、GyrA基因片段引物采用GyrA-F：5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'和GyrAR：5'-CAAGGTAATGCTCC AGGCATTGCT-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[21]。將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離回收后交由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站上使用BLAST 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，之后采用MEGA 7.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將優(yōu)良抑菌指標(biāo)的菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，在35 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)，在接種菌株后的第2、4、6、12、24、36、48、60 和72 小時(shí)分別取樣，使用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 處的OD 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣譜抑菌效果

由表1 可知：在3 株內(nèi)生芽孢桿菌中，菌株Q2 對(duì)6 個(gè)供試病原菌都有很好的抑制效果，其中對(duì)玉米小斑病病原菌玉蜀黍離蠕孢菌的抑制率達(dá)到81.6%，對(duì)其余病原菌的抑制率均大于61%。菌株P(guān)8 對(duì)6 個(gè)供試病原菌的抑制率均大于67%，其中對(duì)禾谷莖腐病病原菌禾谷鐮孢菌的抑制率達(dá)到79.96%。菌株P(guān)7 對(duì)6 個(gè)病原菌的抑制率在60.64%～67.91%，總體弱于菌株Q2 和P8。

表1 內(nèi)生菌對(duì)6 株供試病原菌的抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of endophytic strains against six pathogenic fungi

2.2 嗜鐵素合成能力的測(cè)定

由表2 可知：3 株菌在CAS 平板上都能生長(zhǎng)并產(chǎn)生黃色透明圈，其直徑大小排序?yàn)镼2＞P7＞P8；由可溶性指數(shù)可知：各菌株產(chǎn)生嗜鐵素能力大小排序?yàn)镼2＞P8＞P7。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)初步判斷，3 株菌都具有產(chǎn)嗜鐵素的能力，需要測(cè)定各菌株的嗜鐵素相對(duì)含量，以進(jìn)一步比較3 株內(nèi)生芽孢桿菌產(chǎn)嗜鐵素能力。

表2 CAS 平板測(cè)定菌株合成嗜鐵素的能力Tab.2 Determination of ferriphiles by CAS medium

由圖1 可知：培養(yǎng)3 d 時(shí)菌株Q2 的As/Ar值最低，僅為0.34，故Q2 在3 株菌中的嗜鐵素相對(duì)含量最高；培養(yǎng)7 d 時(shí)菌株P(guān)8 的As/Ar 值為0.36，僅次于Q2；培養(yǎng)2 d 時(shí)菌株P(guān)7 的As/Ar 值為0.64，在3 株菌中嗜鐵素相對(duì)含量最低。因此，3 株菌的嗜鐵素合成能力強(qiáng)弱排序?yàn)镼2＞P8＞P7。

圖1 嗜鐵素相對(duì)含量的測(cè)定Fig.1 Determination of relative ferritin content

2.3 溶磷能力的測(cè)定

由表3 可知：3 株菌在NBRIP 培養(yǎng)基上對(duì)無(wú)機(jī)磷的利用能力(可溶性指數(shù))強(qiáng)弱排序?yàn)镼2＞P8＞P7，在植酸鈣培養(yǎng)基上對(duì)有機(jī)磷的利用能力(可溶性指數(shù))強(qiáng)弱排序?yàn)镻7＞P8＞Q2?？梢?jiàn)，菌株Q2 對(duì)無(wú)機(jī)磷的利用能力強(qiáng)于菌株P(guān)7 和P8，而菌株P(guān)7 對(duì)有機(jī)磷的利用能力強(qiáng)于菌株Q2 和P8。經(jīng)過(guò)初步比較，3 株內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)磷酸鹽的利用能力相差不大，需測(cè)定各菌株的可溶性磷含量，以進(jìn)一步比較3 株內(nèi)生芽孢桿菌的溶磷能力。

表3 菌株溶磷能力的定性測(cè)定Tab.3 Qualitative determination of phosphorus dissolving ability of strains

由圖2a 可知：在NBRIP 液體培養(yǎng)基中，菌株Q2 的可溶性磷含量在培養(yǎng)期間逐漸上升，第9 天時(shí)最高(166.95 mg/L)；菌株P(guān)7 的可溶性磷含量呈先上升后下降最后略微上升的趨勢(shì)，在培養(yǎng)2 d 時(shí)最高(51.82 mg/L)；菌株P(guān)8 的可溶性磷含量總體表現(xiàn)為先上升后下降最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，在培養(yǎng)2 d 時(shí)最高(45.91 mg/L)。可見(jiàn)，3 株菌在NBRIP 液體培養(yǎng)基對(duì)無(wú)機(jī)磷的利用能力強(qiáng)弱排序?yàn)镼2＞P7＞P8。由圖2b 可知：在植酸鈣液體培養(yǎng)基中，菌株P(guān)7 在培養(yǎng)1 d 時(shí)的可溶性磷含量最高(65.04 mg/L)，隨后逐漸降低；菌株Q2 在培養(yǎng)3 d 時(shí)的可溶性磷含量最高(41.47 mg/L)，隨后趨于平穩(wěn)；菌株P(guān)8 在培養(yǎng)期間的可溶性磷含量較為平穩(wěn)，培養(yǎng)6 d 時(shí)的含量最高(38.87 mg/L)?？梢?jiàn)，3 株菌在植酸鈣液體培養(yǎng)基對(duì)有機(jī)磷的利用能力強(qiáng)弱排序?yàn)镻7＞Q2＞P8。

圖2 菌株的可溶性磷含量Fig.2 Soluble phosphorus content of strains

2.4 羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定

由表4 可知：3 株菌在CMC-Na 平板上對(duì)纖維素的降解能力(可溶性指數(shù))強(qiáng)弱排序?yàn)镼2＞P8＞P7。將產(chǎn)生透明圈的菌株接種至CMC-Na 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d 后測(cè)定其酶活性，結(jié)果顯示：菌株Q2、P8 和P7 的纖維素酶活性最大值分別為5.22、2.91 和1.60 U/mL，即：培養(yǎng)3 d 時(shí)各菌株的纖維素酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)镼2＞P8＞P7。

表4 菌株在CMC-Na 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)Tab.4 Growth of the strain in CMC-Na medium

2.5 優(yōu)良抑菌指標(biāo)菌株的鑒定

經(jīng)過(guò)廣譜抑菌活性分析和抑菌活性指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株Q2 在促生長(zhǎng)和抑菌活性指標(biāo)方面尤為突出，對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定。

2.5.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

Q2 在LB 培養(yǎng)基上的菌落形狀為圓形，扁平，黃色，表面粗糙。經(jīng)革蘭氏染色后呈陽(yáng)性。由表5 可知：菌株Q2 對(duì)明膠、靛基質(zhì)、接觸酶、硝酸鹽還原和V-P 等試驗(yàn)為陽(yáng)性，對(duì)淀粉水解試驗(yàn)為陰性。通過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定將該菌初步鑒定為芽孢桿菌(Bacillus)。

表5 生理生化鑒定結(jié)果Tab.5 Physiological and biochemical identification results

2.5.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株Q2 的16S rRNA 基因片段測(cè)序結(jié)果在 NCBI 上進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，結(jié)果顯示：菌株 Q2 與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)以及貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)的同源性達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3a)顯示：Q2 與Bacillus subtilisstrain QH14-11 (MT0786 11.1)的距離最近。

將菌株Q2 的GyrA基因序列測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，結(jié)果顯示：菌株 Q2 與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的GyrA基因序列最為相似，同源性達(dá) 100%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果(圖3b)顯示：菌株Q2 與Bacillus subtilisstrain SF128 DNAGyrA基因 (LK936504.1)距離最近。綜合上述結(jié)果，將菌株Q2 確定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

圖3 Q2 菌株的16S rRNA 序列(a)和GyrA 序列(b)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees constructed from 16S rRNA sequence (a) and GyrA sequence (b) of the strain Q2

2.6 菌株Q2 的生長(zhǎng)曲線

由圖4 可知：菌株Q2 在接種后4～12 h 生長(zhǎng)最為迅速；24～36 h 其生長(zhǎng)速度減慢，活菌數(shù)量逐漸達(dá)到峰值；36 h 后菌株開(kāi)始衰退，培養(yǎng)液中活菌數(shù)逐漸減少。可見(jiàn)，菌株Q2 最具活力的時(shí)期為4～36 h。

圖4 發(fā)酵液的吸光度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.4 The change trend of the absorbance of fermentation broth with time

3 討論

本研究比較了3 株內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)6 株供試病原菌的廣譜抑菌效果，結(jié)果顯示：菌株Q2 和P8 的抑菌效果相差不大，2 株菌的綜合抑菌能力強(qiáng)于P7，其中Q2 對(duì)玉蜀黍離蠕孢菌(B.maydis)的抑制效果最佳，為81.60%。試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了3 株菌的嗜鐵素合成能力、溶磷能力和纖維素酶活性等促生長(zhǎng)抑菌指標(biāo)。

在嗜鐵素合成能力方面，Q2 的嗜鐵素合成能力強(qiáng)于P8 和P7，且明顯強(qiáng)于P7。一般認(rèn)為As/Ar 值低于0.5 的菌株嗜鐵素合成能力較強(qiáng)[13]，如陳孝利[22]從紫花苜蓿分離的內(nèi)生菌Y22 在培養(yǎng)2 d 后的As/Ar 值為0.521，而本研究菌株Q2 培養(yǎng)2 d 時(shí)的As/Ar 值為0.51，相比之下Q2 的嗜鐵素合成能力略顯優(yōu)勢(shì)；培養(yǎng)3 d 時(shí)Q2 的As/Ar值達(dá)到0.34，因此，菌株Q2 在嗜鐵素合成能力方面有很好的潛力。

在磷酸鹽利用能力方面，以有機(jī)磷為磷源的植酸鈣液體培養(yǎng)基中菌株Q2 處理的可溶性磷含量與菌株P(guān)8 和P7 處理相差不大，而以無(wú)機(jī)磷為磷源的NBRIP 液體培養(yǎng)基中菌株Q2 處理的可溶性磷含量在培養(yǎng)7～9 d 內(nèi)持續(xù)增加，含量明顯高于P8 和P7 處理。但該試驗(yàn)對(duì)菌株溶磷能力的探討并沒(méi)有隨培養(yǎng)時(shí)間記錄各菌株發(fā)酵液的pH 值，而微生物解磷機(jī)制十分復(fù)雜，主要是有機(jī)酸、植酸酶以及磷酸酯酶的作用降低pH，提高對(duì)磷的利用，增加有效磷的含量[23]，因此，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討pH 值的變化及影響機(jī)制。

在纖維素酶活性測(cè)定的試驗(yàn)中，Q2 的纖維素酶活性為5.22 U/mL，在3 株菌中最高，而菌株Q2 產(chǎn)酶的最適條件仍需進(jìn)一步研究，纖維素酶需要底物誘導(dǎo)才能產(chǎn)生，且容易被菌株利用的碳源反而會(huì)抑制纖維素酶合成，如經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化的青霉屬W-B23 的纖維素酶活性為3.79 U/mL，未經(jīng)優(yōu)化的纖維素酶活性為2.23 U/mL[18]?；赒2 在纖維素酶活性方面的潛力，本研究中菌株Q2 的產(chǎn)酶最適條件有待進(jìn)一步發(fā)掘與優(yōu)化。

菌株Q2 經(jīng)生理及生物學(xué)鑒定后確定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，該菌是一種嗜溫、好氧、能產(chǎn)生芽孢的桿狀細(xì)菌，其生理特征多樣，在自然界中分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，不僅對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，還能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力?？莶菅挎邨U菌的強(qiáng)定植能力和適應(yīng)能力使其在營(yíng)養(yǎng)獲取、物理位點(diǎn)和生態(tài)位點(diǎn)有巨大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[24]。枯草芽孢桿的營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)繁殖較快。因此，以枯草芽孢桿菌為菌種的菌劑加工簡(jiǎn)便，且活菌數(shù)高[25]。研究發(fā)現(xiàn)：枯草芽孢桿菌還能利用不具備致病性或致病能力弱的病原物來(lái)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[26]。目前對(duì)生防菌的研究主要集中于實(shí)驗(yàn)室，由于菌株對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)能力有差異，其實(shí)際促生抗病效果還需要經(jīng)過(guò)盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)驗(yàn)證。基于菌株Q2 在目前試驗(yàn)階段的抑菌效果和促生長(zhǎng)指標(biāo)，該菌有一定的研究?jī)r(jià)值，可對(duì)其抑菌功能及相關(guān)機(jī)理進(jìn)一步展開(kāi)試驗(yàn)分析。

4 結(jié)論

經(jīng)廣譜抑菌試驗(yàn)及抑菌活性指標(biāo)測(cè)定，菌株Q2 在抑菌促生長(zhǎng)方面表現(xiàn)最佳；經(jīng)生理及生物學(xué)鑒定后確定Q2 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌的嗜鐵素、溶磷和纖維素酶活性高，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗病促生長(zhǎng)生物菌劑的潛力。