柳 偉，安佳琪，高 熹 ，楊 璞,3

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.國(guó)家林業(yè)和草原局，資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

蠟酯在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，具有多種重要的生物學(xué)功能，其功能多與生存環(huán)境相適應(yīng)[1]。蠟酯在植物中主要形成表皮蠟，可防止病菌和紫外線的侵害，還可以保護(hù)水分，或以高濃度的形式積累在一些種子油中[2]。動(dòng)物蠟酯具有保護(hù)作用，如工蜂用分泌的蜂蠟筑巢，為自己提供庇護(hù)場(chǎng)所；還具有防水作用，如水禽用喙將尾脂腺分泌的蠟酯涂抹在羽毛上，使羽毛光潤(rùn)防水。蠟酯也是微生物中重要的儲(chǔ)存脂類，各種細(xì)菌通過(guò)積累蠟酯將其作為主要的碳源和能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)。蠟酯具有多種功能和性質(zhì)，可作為人類生活中重要的經(jīng)濟(jì)油脂，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)，尤其是能源和化工等領(lǐng)域。

蠟酯由長(zhǎng)鏈脂肪酸與長(zhǎng)鏈醇通過(guò)酯化反應(yīng)結(jié)合形成，其合成過(guò)程較為保守[1]。脂酰輔酶A 還原酶 (fatty acyl-CoA reductase，F(xiàn)AR) 將脂酰輔酶A 還原成相應(yīng)的脂肪醇，然后與脂酰輔酶A 在蠟酯合成酶催化下形成蠟酯[3-5]。脂酰輔酶A 還原酶所催化的還原反應(yīng)依賴NADPH。序列分析表明：動(dòng)物和植物的FAR 較為保守，在N 端氨基酸有1 個(gè)長(zhǎng)度約為300 aa 的NADPH 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在C 端含有1 個(gè)Sterile 蛋白結(jié)構(gòu)域[6-7]。

已有研究表明：FAR 催化生成的脂肪醇主要參與蠟酯、甘油三酯和信息素的合成[1]。同一生物體中有多個(gè)far基因，在不同組織的表達(dá)有不同的生理功能。擬南芥far3基因在葉、莖、花和根中均有表達(dá)，參與角質(zhì)層蠟的合成[8-9]；擬南芥中far1、far4和far5在根的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，主要參與軟木脂的形成；意蜂far1基因主要在蜜蜂頭部表達(dá)，參與信息素或醚酯的合成[10]。

白蠟蟲 (Ericerus pela) 是一種有巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的資源昆蟲，在雄蟲二齡時(shí)期分泌大量白蠟。白蠟的主要成分是蠟單酯，占白蠟總量的93%～95%。在機(jī)械、化工、食品、農(nóng)林和信息技術(shù)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-12]，以白蠟為原料生產(chǎn)的高級(jí)烷醇也具有極大的藥用價(jià)值[13]。FAR 在白蠟合成中起關(guān)鍵作用，但白蠟蟲far基因家族缺少系統(tǒng)的進(jìn)化分析研究。本研究對(duì)白蠟蟲far家族基因進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行序列特征分析，同時(shí)與其他物種中參與蠟酯合成的FAR 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期為進(jìn)一步探究白蠟蟲蠟酯合成基因的特點(diǎn)與進(jìn)化奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 far 基因家族鑒定和結(jié)構(gòu)域分析

FAR 的結(jié)構(gòu)域信息下載自Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)，再利用HMMER 3.0 在白蠟蟲蛋白庫(kù)搜索含有far基因結(jié)構(gòu)域的序列。為避免基因組注釋有遺漏的far基因，從Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)下載FAR 蛋白序列，在白蠟蟲轉(zhuǎn)錄組蛋白庫(kù)中進(jìn)行本地BLAST 搜索，由此獲得白蠟蟲轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)的FAR。結(jié)合白蠟蟲轉(zhuǎn)錄組注釋信息，將這些FAR 對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本在白蠟蟲基因組序列上進(jìn)行本地BLAST 搜索，獲得的序列作為far候選基因。此外，在Nr (nonredundant protein sequence)、Nt (nucleotide sequence)和Swissport 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為FAR 的基因組預(yù)測(cè)基因同樣作為far候選基因。將以上far候選基因上傳到CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，得到2 種序列，一種包含2 個(gè)完整的FAR 結(jié)構(gòu)域(即NADB Rossmann 結(jié)構(gòu)域和FAR C 結(jié)構(gòu)域)，另一種僅含有1 個(gè)FAR 結(jié)構(gòu)域，對(duì)這些序列進(jìn)行在線BLAST 分析，2 種方法都注釋為FAR 的基因保留作為最終的候選far家族基因。

1.2 白蠟蟲far 基因保守基序、基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列屬性分析

利用在線網(wǎng)站MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)[14]對(duì)白蠟蟲FAR 蛋白保守基序進(jìn)行分析，基序的最大數(shù)值設(shè)為15，基序的長(zhǎng)度設(shè)置介于6～200 之間，其他參數(shù)使用默認(rèn)參數(shù)。對(duì)得到的保守基序使用CDD 進(jìn)行功能注釋；使用在線網(wǎng)站GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/)[15]分析內(nèi)含子和外顯子；使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)在線工具[16]對(duì)篩選的白蠟蟲FAR 蛋白序列進(jìn)行等電點(diǎn)和蛋白分子量等屬性分析。

1.3 白蠟蟲far 基因染色體定位

將far基因在scaffold 上進(jìn)行定位，得到起始位置信息，使用在線網(wǎng)站MapGene2Chrom web v2 (http://mg2c.iask.in/mg2c v2.0/)[17]將所有白蠟蟲far基因在染色體上的物理位置繪制成圖。單個(gè)染色體寬度設(shè)置為100 px，染色體邊界寬度為2 px，其他參數(shù)設(shè)置保持默認(rèn)值。

1.4 白蠟蟲far 基因的共線性Circos 分析

使用Mauve 2.3.0 軟件對(duì)白蠟蟲far基因進(jìn)行共線性分析，參數(shù)和視圖使用默認(rèn)值。得到far基因的共線性區(qū)域，連接共線性較好的far基因；利用Circos 對(duì)共線性結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用ClustalX 軟件對(duì)白蠟蟲far基因氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，然后將得到的結(jié)果導(dǎo)入MEGA 6.0 軟件，使用鄰接法(Bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[18]；使用ClustalX 軟件對(duì)不同物種的FAR (表1)進(jìn)行多序列比對(duì)，在MEGA 6.0 中采用最大似然法(Bootstrap=500)繪制不同物種FAR蛋白進(jìn)化樹[19-20]。其中，擬南芥、西德蒙木和小鼠的FAR 來(lái)自NCBI；意蜂、果蠅、豌豆蚜和扶桑綿粉蚧的昆蟲FAR 來(lái)自昆蟲基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)InsectBase (http://www.insect-genome.com/)。

表1 物種的FAR 信息Tab.1 FAR information for species

1.6 不同物種的far 基因共線性分析

為了進(jìn)一步檢測(cè)白蠟蟲far基因與其他物種far基因[21-23]的共線關(guān)系，采用Mauve 2.3.0 軟件進(jìn)行共線性分析。參數(shù)設(shè)置和視圖樣式同1.4 節(jié)。

1.7 不同物種的FAR 相似性統(tǒng)計(jì)分析

為了探討不同物種間FAR 序列的相似性，利用在線BLAST 計(jì)算每2 對(duì)FAR 序列之間的相似性，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果導(dǎo)入在線網(wǎng)站Heatmapper (ht-tp://www.heatmapper.ca/expression/)，氨基酸與高、中、低值的相似性以紅、白、綠三色表示，并根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蠟蟲far 基因家族鑒定

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組注釋信息，197 條序列注釋為far基因。利用197 個(gè)候選基因的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行基因分析。一些基因被發(fā)現(xiàn)是同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本在scaffold 中的位置，共鑒定出17 個(gè)基因。

根據(jù)基因組預(yù)測(cè)基因的注釋信息，26 條序列注釋為far基因。與轉(zhuǎn)錄組得到的序列進(jìn)行比對(duì)，在白蠟蟲far基因家族中有30 個(gè)far基因；其中有22 個(gè)具有2 個(gè)完整的結(jié)構(gòu)域和合適的序列長(zhǎng)度，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 保守基序、基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列分析

對(duì)15 個(gè)保守基序(圖1)進(jìn)行分析，MEME分析結(jié)果顯示：基序1～6、9、12 和14 屬于NADB Rossmann 結(jié)構(gòu)域，基序7、8、10 和13 屬于FAR C 結(jié)構(gòu)域。CDD 分析結(jié)果顯示：基序1～4、9 和14 屬于NADB Rossmann 結(jié)構(gòu)域，基序8 和13 屬于FAR C 結(jié)構(gòu)域。MEME 分析與CDD 分析結(jié)果基本一致。此外，基序11 和15 位于域間區(qū)域，所有FAR 都包含基序11 或15，但二者并不同時(shí)存在于1 個(gè)FAR 中。

圖1 白蠟蟲FAR 保守基序分析Fig.1 Conserved motif analysis of FAR in Ericerus pela

白蠟蟲far基因有6～11 個(gè)外顯子、5～10 個(gè)內(nèi)含子。外顯子平均長(zhǎng)度為145～225 bp，內(nèi)含子平均長(zhǎng)度為777～7 098 bp。Epfar-5包含10 個(gè)內(nèi)含子和11 個(gè)外顯子，數(shù)量最多(圖2)。在22 條白蠟蟲FAR 中，氨基酸序列長(zhǎng)度為467～587 aa，僅有FAR-19 的等電點(diǎn)小于7。

圖2 白蠟蟲far 基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of the far genes in E.pela

2.3 白蠟蟲far 基因染色體定位

圖3 顯示：22 個(gè)far基因分布在16 個(gè)重疊群(contig)上，contig113 的far基因最多(4 個(gè))，其次 是contig1166 (3 個(gè))，即contig113 和1 166 有far基因簇；contig683 有2 個(gè)far基因；其余13 個(gè)contig 上各有1 個(gè)far基因。

圖3 白蠟蟲far 基因在基因組上的分布Fig.3 Genomic distribution of the far genes of E.pela

2.4 白蠟蟲far 基因的共線性Circos 分析

由圖4 可知：22 個(gè)far基因共有11 個(gè)共線性模塊。其中，far6 號(hào)基因與其他far基因有最多的共線性模塊，與far5、9、13、18 號(hào)基因都有連線。far9 號(hào)有3 個(gè)連線。far2 號(hào)和27 號(hào)各有2 個(gè)連線。其余5 個(gè)基因只有1 個(gè)連線。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖5 可知：白蠟蟲的22 個(gè)far基因聚為2 類。第1 類有12 個(gè)far基因，聚為4 組；第2類有9 個(gè)far基因，聚為2 組。由圖6 可知：不同物種的FAR 大多按所屬物種的親緣關(guān)系聚為3 類。白蠟蟲的FAR 主要在第1 類，豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的FAR 主要在第2 類，扶桑綿粉蚧(Phenacoccus solenopsis)的FAR 在第1、2 類中都有分布，第1 類中的FAR 基本與白蠟蟲聚在一起。

圖5 白蠟蟲FAR 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of FAR in E.pela

圖6 8 個(gè)物種的FAR 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of FAR in eight species

2.6 不同物種的far 基因共線性分析

由圖7 可知：白蠟蟲與扶桑綿粉蚧的共線性最好，二者之間的共線性連線最多，共線性模塊覆蓋率最高。白蠟蟲far基因與小鼠、意蜂、豌豆蚜和黑腹果蠅far基因的共線性較差，共線性連線較少，共線性模塊覆蓋率較低。白蠟蟲far基因與擬南芥和西德蒙木的far基因共線關(guān)系最差，幾乎沒(méi)有共線性連線。

圖7 白蠟蟲與擬南芥和扶桑綿粉蚧的far 基因共線性分析Fig.7 Synteny analysis of far genes among E.pela,Arabidopsis thaliana and Phenacoccus solenopsis

2.7 不同物種的FAR 相似性

由圖8 可知：不同物種的FAR 的氨基酸相似性在25%～60%，高相似性 (50%～60%) 的FAR蛋白主要來(lái)自同一物種。擬南芥和西德蒙木的FAR 相似性約為50%；不同昆蟲體內(nèi)FAR 蛋白的相似性大多不高 (25%～40%)；具有泌蠟功能的FAR 氨基酸與其他物種的FAR 相似性僅為25%～40%。

圖8 不同物種的FAR 相似性熱圖Fig.8 Heat maps of FAR similarity of different eight species

3 討論

脂酰輔酶A 還原酶是生物體內(nèi)蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵酶之一，在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在。截至目前，蠟質(zhì)合成途徑以及關(guān)鍵酶的研究較少，僅有少部分植物(擬南芥和希蒙德木等)[24]、動(dòng)物(小鼠和鵝等)[25-26]和昆蟲(褐飛虱和巢蛾等)[27-29]開(kāi)展了FAR 的功能研究。隨著研究工作的深入展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)far基因在昆蟲基因組中一般以基因家族存在，如對(duì)褐飛虱far基因家族進(jìn)行了功能分析[30]。本研究基于白蠟蟲的全基因組數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)其far基因家族進(jìn)行鑒定，獲得30 個(gè)far候選基因，多數(shù)含有NADB_Rossmann 結(jié)構(gòu)域和FAR C 結(jié)構(gòu)域；氨基酸普遍等電點(diǎn)大多在7 以上，說(shuō)明其可能多在弱堿性環(huán)境發(fā)揮作用。

基因家族成員可以緊密排列在一起，形成1 個(gè)基因簇(一般認(rèn)為200 kb 的核苷酸單位中含有3 個(gè)以上基因的基因群)[31]，更多的家族基因分布在同一染色體的不同部位，或者分散于不同的染色體，具有各自不同的表達(dá)調(diào)控模式。對(duì)白蠟蟲far基因的染色體分布和基因重復(fù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)2 個(gè)基因簇，其中的11 對(duì)基因有一定的共線性。白蠟蟲far基因家族僅有2 個(gè)基因簇，其他基因大多存在于不同contig 上。這些成簇排列的far基因可能由基因復(fù)制產(chǎn)生，具有共線性的far基因可能有相同的起源?；蛟诎紫炏xfar基因家族成員內(nèi)分布相似，在白蠟蟲FAR 的NJ 樹中，含有基序11 的聚為一小支，表明含有相同基序的FAR 序列或者功能可能更相似。

不同物種的FAR 氨基酸相似性分析表明：多數(shù)相似性高的FAR 都是同一物種或親緣關(guān)系近的物種。同屬泌蠟功能相關(guān)的FAR 在相同物種間相似性高，在不同物種間相似性低。不同物種的FAR 進(jìn)化分析表明：同物種的FAR 大多聚在一起，親緣關(guān)系近的聚為1 小支。系統(tǒng)進(jìn)化的分析結(jié)果與共線性分析的結(jié)果一致，從共線性分析來(lái)看，白蠟蟲與親緣關(guān)系最近的扶桑綿粉蚧的far基因有更多的共線性連線，而與擬南芥的far基因共線性連線非常少。

4 結(jié)論

本研究獲得30 個(gè)白蠟蟲far基因候選基因，其中22 個(gè)具有完整的結(jié)構(gòu)域。序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：這些基因存在很多保守基序，基因之間共11 個(gè)共線性模塊，聚類為2 大支，不同物種之間的FAR 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該研究為了解白蠟蟲far基因的功能分化提供了參考。