龐茂楠，蔣子睿，王 印 ，羅 燕，姚學(xué)萍，楊澤曉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一種豬腸道致病性冠狀病毒，其引起的豬流行性腹瀉是一種以嚴(yán)重嘔吐、腹瀉和脫水為特征的傳染性疾病[1]。該病毒可通過(guò)消化道和呼吸道傳播；能感染各年齡段的豬，對(duì)1 周齡內(nèi)的仔豬危害最為嚴(yán)重，可造成100%死亡[2]。臨床上，PEDV 多與豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒和豬圓環(huán)病毒等病毒混合感染[3]。因此，該病在許多國(guó)家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)全球生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大威脅。

PEDV 屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)成員，為有囊膜單股正鏈RNA 病毒[4]。基因組全長(zhǎng)約28 kb，編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白[ 纖突糖蛋白(S)、基質(zhì)蛋白(M)、囊膜蛋白(E)和核蛋白(N)]、1 個(gè)輔助蛋白(ORF3)和2 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (復(fù)制酶多聚蛋白pp1a 和pp-1b)。PEDV 結(jié)構(gòu)蛋白在介導(dǎo)病毒入侵、中和抗體產(chǎn)生、病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄以及病毒組裝、出芽和拮抗宿主先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[5-7]；PEDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因表達(dá)、RNA 合成加工以及病毒粒子組裝和釋放等方面發(fā)揮著重要作用[8]。

通過(guò)將PEDV S 蛋白基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，可將PEDV 分為傳統(tǒng)PEDV 毒株和新型PEDV 毒株[9]，新型PEDV 毒株又分為S non-INDEL 型和S INDEL 型2 個(gè)亞群[10]。在生產(chǎn)中，S non-INDEL型導(dǎo)致的病死率通常更高[11]。S non-INDEL 型毒株是近年來(lái)流行的優(yōu)勢(shì)毒株，其基因變異較快，并引起抗原表位發(fā)生變化，是導(dǎo)致當(dāng)前商品化疫苗免疫效果不佳的重要原因之一。本研究病料組織采集于接種過(guò)PEDV 疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)，利用該病料進(jìn)行病毒分離鑒定、測(cè)定分離株的全基因序列并分析該毒株與疫苗株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，以期為了解PEDV 流行株的變異情況及疫苗開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣本與細(xì)胞株

15 份仔豬小腸組織樣本采自接種過(guò)PEDV 疫苗的四川某豬場(chǎng)；PEDV、TGEV (豬傳染性胃腸炎病毒)和PoRV (豬輪狀病毒)陽(yáng)性血清以及豬腎細(xì)胞(PK-15)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物

細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和氨芐青霉素(Amp)等購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；二甲基亞砜(DMSO)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、Hanks液(10×)和DL2000 Marker 購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×TaqMaster Mix 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

6 頭1 周齡哺乳仔豬(未免疫)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)合作豬場(chǎng)提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)

PEDV 檢測(cè)引物參考《豬流行性腹瀉診斷技術(shù)》(NY/T 544—2015)[12]；TGEV 和PoRV 檢 測(cè)引物參考郭容利等[13]和卓秀萍[14]的研究(表1)；根據(jù)PEDV CV777 株(登錄號(hào)：AF353511)、CH/S株(登錄號(hào)：JN547228)及DR13 株(登錄號(hào)：JQ 023161)的全基因序列，運(yùn)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)22 對(duì)引物擴(kuò)增分離株全基因組序列。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 鑒別引物序列Tab.1 The identified primers sequences

1.4 組織樣本PCR 鑒定

提取15 份組織樣本的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)《豬流行性腹瀉診斷技術(shù)》(NY/T 544—2015)[12]及 郭容利等[13]和卓秀萍[14]設(shè)計(jì)的TGEV 與PoRV 檢測(cè)方法進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，對(duì)15 份樣品中PEDV 的感染情況進(jìn)行分析。

1.5 病毒分離、純化及病毒滴度測(cè)定

1.5.1 病毒分離

取PEDV 陽(yáng)性小腸組織1 g 制成原代病毒液，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩? mL 原代病毒液接種至狀態(tài)良好的PK-15 細(xì)胞，于37 ℃孵育1 h 后吸棄病毒液，添加胰酶終質(zhì)量濃度為4 μg/mL 的維持液5 mL，待細(xì)胞病變達(dá)80%～90%時(shí)，將細(xì)胞置于液氮中凍融3 次后離心取上清作為傳代接種液。按上述方法進(jìn)行病毒傳代，并觀察細(xì)胞病變情況。

1.5.2 病毒純化

將1 mL 病毒傳代接種液用DMEM 進(jìn)行5 個(gè)系列的10 倍梯度稀釋(10-1～10-5)，后接種單層PK-15 細(xì)胞，另有一孔加1 mL 維持液作空白對(duì)照。于培養(yǎng)箱孵育1 h 后吸棄傳代接種液，每孔添加2 mL 含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM (2×)覆蓋液，鋪平后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，每孔添加2 mL 含0.05%結(jié)晶紫的覆蓋液，繼續(xù)培養(yǎng)。眼觀無(wú)色斑點(diǎn)為蝕斑，鏡下觀察蝕斑具體位置，用滅菌10 μL 槍頭挑取單個(gè)蝕斑進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

為進(jìn)行分離株的RT-PCR 檢測(cè)，分別提取第3、7、10 代及純化病毒的細(xì)胞上清液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括：PremixTaq12 μL，RNase Free ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取7.5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

1.5.3 病毒滴度測(cè)定

將純化的病毒用DMEM 進(jìn)行10 個(gè)系列的10 倍梯度稀釋(10-1～10-10)，后接種于長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96 孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)8 孔，每孔接種100 μL；最后2 列接種維持液作陰性對(duì)照。將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 后觀察并記錄每孔細(xì)胞病變情況。按照Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度(TCID50)。

1.6 仔豬感染試驗(yàn)及臨床癥狀和病理學(xué)觀察

將6 頭1 周齡健康哺乳仔豬(未免疫)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3 頭。飼養(yǎng)環(huán)境相同，分別隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)組將10 mL 純化PEDV 病毒液拌料飼喂仔豬；對(duì)照組將10 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液以同樣的方式飼喂仔豬。每隔4 h 觀察仔豬臨床癥狀。將感染后死亡的仔豬剖檢，觀察各組織器官病理變化；取病變明顯的肺臟、肝臟及小腸組織制作病理切片，利用實(shí)驗(yàn)室建立的方法測(cè)定各組織器官病毒載量。

1.7 分離株的全基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

提取PEDV SNJ-P 株的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用1.3 節(jié)中設(shè)計(jì)的全基因組擴(kuò)增引物擴(kuò)增分離株全基因序列，并回收純化。將純化的DNA 片段連接到pMD19-T (simple)載體，并轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)PCR 鑒定為陽(yáng)性的菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。使用MEGA 6.0 軟件將獲得的22 條序列進(jìn)行拼接，獲得分離株全基因序列?；贜CBI 上38 株國(guó)內(nèi)外PEDV 毒株的S 蛋白基因序列信息，運(yùn)用MegAlign 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。以傳統(tǒng)疫苗株CV777 為參考，分析SNJ-P 株的各基因序列及S 蛋白氨基酸序列遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料PCR 鑒定結(jié)果

由圖1 可知：PEDV、TGEV 和PoRV 的陰性和陽(yáng)性對(duì)照均成立，陽(yáng)性對(duì)照條帶大小分別為774、554 和229 bp，與預(yù)期相符。15 份樣本中僅有1 份樣本檢測(cè)PEDV 呈陽(yáng)性，且該份樣本TGEV 和PoRV 檢測(cè)均呈陰性。PCR 鑒定出的PEDV 陽(yáng)性樣本為后續(xù)毒株的分離提供了材料。

圖1 病料RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of RT-PCR detection of disease material

2.2 病毒分離、純化及病毒滴度測(cè)定結(jié)果

由圖2 可知：病毒感染后，盲傳至第4 代開(kāi)始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)；盲傳至第7 代，細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的CPE；盲傳至第10 代，細(xì)胞產(chǎn)生CPE 的時(shí)間提前，在接毒后約12 h 即觀察到CPE 產(chǎn)生，24～36 h CPE 可達(dá)80%以上。細(xì)胞病變主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、細(xì)胞圓縮脫落、大面積溶解和細(xì)胞間隙增大等。

圖2 PK-15 細(xì)胞接種病毒液后各代病變情況Fig.2 The pathological changes of different generations PK-15 cells after inoculation with virus fluid

由圖3 可知：接毒后12 h 細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生病變；3 d 后覆蓋含有結(jié)晶紫的覆蓋液，2～3 d 可以觀察到蝕斑，空白對(duì)照組無(wú)蝕斑產(chǎn)生。

由圖4 可知：第3、7、10 代以及純化病毒液PEDV 檢測(cè)均呈陽(yáng)性，且條帶亮度隨傳代數(shù)的增加而增大。這表明隨傳代數(shù)的增加，病毒增殖能力不斷增強(qiáng)，不斷適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。按照Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度(TCID50)為1×107.5/100 μL。

圖4 各代病毒液RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The results of RT-PCR detection in each generation of virus fluid

2.3 仔豬感染臨床癥狀和病理變化

臨床表現(xiàn)：試驗(yàn)組仔豬在感染后6 h 開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁；12 h 后陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉癥狀；30～36 h后出現(xiàn)食欲減退、水樣腹瀉、脫水及黏膜蒼白等癥狀；感染后40～48 h，3 只仔豬均死亡。對(duì)照組仔豬表現(xiàn)正常。

病理學(xué)觀察：病死仔豬消化道病變最嚴(yán)重，胃和小腸內(nèi)有未消化的乳糜，并發(fā)酵產(chǎn)生大量氣體；小腸壁薄而透明，內(nèi)充滿黃綠色水樣內(nèi)容物，氣味腥臭；腸系膜充血，腫脹嚴(yán)重；其他組織器官病變不明顯，脾臟輕微血腫，底部有淤血；肺臟輕微腫脹，右肺葉出現(xiàn)淤血點(diǎn)；心臟局部水腫；腎臟與肝臟無(wú)明顯病變。

取病變明顯的肺臟、肝臟和小腸組織制作病理切片進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：肺泡壁增厚，細(xì)胞成分增多，肺泡出現(xiàn)萎陷融合現(xiàn)象(圖5a)；局部肝細(xì)胞腫脹，肝竇變窄或消失，肝索紋理不清，含鐵血黃素沉積(圖5b)；空腸絨毛高度普遍降低，并出現(xiàn)絨毛萎縮、斷裂和脫落等現(xiàn)象(圖5c)；十二指腸絨毛高度普遍降低，嚴(yán)重萎縮(圖5d)。

圖5 病死仔豬肺臟、肝臟、空腸及十二指腸組織病理學(xué)變化(H.E，400×)Fig.5 Pathological changes of lung,liver,jejunum and duodenum in dead piglets

利用本實(shí)驗(yàn)室建立的qPCR 方法檢測(cè)病死仔豬各組織器官的病毒載量，結(jié)果表明：腸道組織病毒載量最高，為3.82×106copies/mL；其次是肺臟，為1.47×105copies/mL；心臟、肝臟、脾臟和腎臟等組織器官病毒拷貝數(shù)均較低，分別為3.03×103、1.31×104、3.00×103和1.09×103copies/mL。該毒株具有較強(qiáng)的腸道嗜性，符合PEDV 感染特點(diǎn)。以上結(jié)果表明成功分離獲得1 株P(guān)EDV 毒株，并將其命名為PEDV SNJ-P。

2.4 分離株的全基因組測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析

PEDV SNJ-P 株全基因共28 003 bp，序列已上傳NCBI，登錄號(hào)為MK702008.1。將分離株與不同地區(qū)毒株及疫苗株的S 蛋白基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果(圖6)表明：分離株屬于S non-INDEL 型，與同型的中國(guó)分離株P(guān)EDV-WS (登錄號(hào)：KM609213.1)、CH/JLDH/2016 (登錄號(hào)：MF 346935.1)和CH/HNLH/2015 (登錄號(hào)：KT199103.1)親緣關(guān)系較近，與同型的疫苗株AJ1102-F12 (登錄號(hào)：MK584552.1)和LW/L (登錄號(hào)：MK392335.1)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)疫苗株CV777 (登錄號(hào)：LT905450.1)和DR13 (登錄號(hào)：JQ023162.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 基于SNJ-P 株與參考株S 蛋白基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on S protein gene construction of SNJ-P strain and reference strain

2.5 各序列片段遺傳與變異情況

SNJ-P 株與傳統(tǒng)疫苗CV777 的全基因序列比對(duì)結(jié)果表明：SNJ-P 株全基因序列堿基共發(fā)生980 處突變、16 處插入和11 處缺失，兩者的堿基變化數(shù)如表2 所示。

表2 SNJ-P 株與CV777 株基因組堿基變化數(shù)對(duì)比Tab.2 Comparison of nucleotide changes between SNJ-P strain and CV777 strain

2.6 S 蛋白氨基酸位點(diǎn)變化情況

由圖7 可知：SNJ-P 株S 蛋白基因共有4 161個(gè)堿基，與CV777 株相比其堿基存在較多變化，主要集中在S1 區(qū) (1～789 aa)，共發(fā)生271 處突變、6 處缺失和15 處插入。164～166 nt 插入TTG等3 個(gè)堿基，177～185 nt 插入AGGTGTTAA 等9 個(gè)堿基，415～417 nt 插入GAT 等3 個(gè)堿基，分別導(dǎo)致55～56 aa、59～62 aa 及139 aa 位插入氨基酸IG (異亮氨酸和甘氨酸)、QGVN (谷氨酰胺、甘氨酸、纈氨酸和天冬酰胺) 和D (天冬氨酸)。480～486 nt 缺失TGGAAA 等6 個(gè)堿基，導(dǎo)致160～162 aa 位缺失氨基酸DGK (天冬氨酸、甘氨酸和賴氨酸)。79～87 nt 由CAGTCTACT 突變?yōu)門(mén)CAGCTAAC，導(dǎo)致27～29 aa 位氨基酸由QST (谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸)變?yōu)镾AN (絲氨酸、丙氨酸和天冬酰胺) ；203～215 nt 由GCACAGGCATTGA 突變?yōu)镃TGGCCAACATCC，導(dǎo)致68～72 aa 位氨基酸由GTGIE (甘氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和谷氨酸) 變?yōu)锳GQHP (丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和脯氨酸) ；601～608 nt 位由CGCAGAAGT 突變?yōu)锳GTGGAGGT，導(dǎo)致201～203 aa 位氨基酸由SGG (絲氨酸、甘氨酸和甘氨酸)變?yōu)镽RS (精氨酸、精氨酸和絲氨酸)。其余突變位點(diǎn)均是由單堿基突變導(dǎo)致單個(gè)或2 個(gè)間斷氨基酸發(fā)生改變。S 蛋白的插入與缺失均發(fā)生在S1 區(qū)，同時(shí)S1 區(qū)有63 處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，S2 區(qū)有19 處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變。

圖7 SNJ-P 與CV777 的S 蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Comparison of amino acid sequence of S protein between SNJ-P and CV777

3 討論

豬流行性腹瀉病毒是引起仔豬腹瀉、脫水并導(dǎo)致死亡的重要病原之一，在中國(guó)豬群中傳播時(shí)間長(zhǎng)、波及范圍廣，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV 毒株的分離仍然是病毒學(xué)研究及疫苗開(kāi)發(fā)的重要內(nèi)容。該病毒毒株在細(xì)胞增殖過(guò)程中存在細(xì)胞適應(yīng)能力弱、易出現(xiàn)病毒滴度降解等問(wèn)題[15]。因此，探索能使病毒穩(wěn)定增殖的細(xì)胞系及培養(yǎng)條件，對(duì)于流行毒株的分離尤為重要。研究表明：PEDV 可在多數(shù)豬源細(xì)胞系中生長(zhǎng)，包括豬膀胱細(xì)胞[16]、豬腎細(xì)胞系[17]、豬睪丸細(xì)胞系[18]、豬肺泡巨噬細(xì)胞系[19]以及豬小腸上皮細(xì)胞系[20]等，但目前豬源細(xì)胞系分離PEDV 流行株的培養(yǎng)條件仍需進(jìn)一步探索。1988 年，HOFFMAN通過(guò)在Vero 細(xì)胞培養(yǎng)基中加入胰酶成功分離獲得1 株P(guān)EDV 毒株；隨著學(xué)者對(duì)PEDV 更加深入的研究，Vero 細(xì)胞成為分離PEDV 最常用的細(xì)胞種類(lèi)，相關(guān)的試驗(yàn)方法也趨于完善，但Vero 細(xì)胞系分離PEDV 毒株存在增殖不穩(wěn)定、滴度易降低等問(wèn)題[20]。PK-15 細(xì)胞具有生長(zhǎng)速度快、環(huán)境耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)，且可以用于體外分離PEDV 毒株[21]，但相關(guān)記錄較少，試驗(yàn)方法并不詳盡。因此，本研究嘗試建立以PK-15 細(xì)胞為基礎(chǔ)的毒株分離條件，利用PK-15 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，并在其維持培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為4 μg/mL 的胰酶，盲傳至第4 代即產(chǎn)生明顯的病變，傳至第7 代后產(chǎn)生穩(wěn)定CPE。

PEDV 能感染各年齡段的豬，尤以1 周齡內(nèi)的仔豬病死率最高。究其原因，一方面與初生仔豬腸絨毛更新修復(fù)能力較弱有關(guān)；另一方面與初生仔豬免疫系統(tǒng)不健全、抵抗病原入侵的能力較弱有關(guān)[22]。本研究利用SNJ-P 株進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示：仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等典型臨床癥狀。病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示：小腸病毒載量最高，表明此分離毒株具有較高的腸道組織嗜性。以上研究結(jié)果與周書(shū)亭等[23]和卓秀萍等[24]的研究結(jié)果基本一致。

將分離株與不同地區(qū)毒株及疫苗株的S 蛋白基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明：分離株屬于S non-INDEL 型，與同型的中國(guó)分離株P(guān)EDV-WS、CH/JLDH/2016 和CH/HNLH/2015 親緣關(guān)系較近，與同型的疫苗株AJ1102-F12 和LW/L 親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)疫苗株CV777 和DR13 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)對(duì)SNJ-P 株與CV777 的S 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)：與CV777 相比，SNJ-P株S 蛋白S1 亞基存在多處氨基酸突變、插入和缺失等變化，導(dǎo)致SNJ-P 株相應(yīng)的抗原表位發(fā)生改變。以上結(jié)果從遺傳進(jìn)化層面說(shuō)明傳統(tǒng)毒株制備的疫苗免疫效果不佳，可能與當(dāng)前流行毒株基因組變異較快有關(guān)，從而導(dǎo)致相應(yīng)抗原表位發(fā)生改變。

目前，針對(duì)豬流行性腹瀉尚無(wú)特效藥，感染后只能通過(guò)隔離豬群或緊急免疫降低豬群的死亡率。疫苗免疫仍然是預(yù)防該病的主要措施，現(xiàn)有的疫苗主要以滅活苗和弱毒苗為主[25]。在中國(guó)，早在1999 年就開(kāi)發(fā)出針對(duì)PEDV 經(jīng)典毒株的疫苗[26]；近年來(lái)，針對(duì)S non-INDEI 型毒株的商品化疫苗不斷上市，如基于AJ1102 株的PEDV 和TGEV 二價(jià)滅活疫苗等[27]，為PEDV 的防控提供了一定的幫助。由于病毒變異較快，現(xiàn)有的疫苗保護(hù)力有限，一些規(guī)模化豬場(chǎng)通過(guò)制備自家組織滅活苗，免疫母豬產(chǎn)生抗體，仔豬通過(guò)吮吸初乳獲得抗體產(chǎn)生免疫保護(hù)，在一定程度上提高了仔豬存活率。但自家組織滅活苗同樣具有一定的局限性，如：僅針對(duì)本場(chǎng)常發(fā)毒株，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用；僅在疫情暴發(fā)后才能制備使用；疫苗制備過(guò)程不規(guī)范，易使病毒滅活不完全，導(dǎo)致豬場(chǎng)長(zhǎng)期帶毒，加大病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)等。

4 結(jié)論

本研究利用PK-15 細(xì)胞從疑似病料中成功分離獲得PEDV SNJ-P 株，該毒株與傳統(tǒng)疫苗株和S non-INDEI 型疫苗株親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，說(shuō)明當(dāng)前PEDV 毒株變異速度快，商品化疫苗無(wú)法提供有效保護(hù)。