梁 楊 ,王小玲 ,郭 廷 ,郭禮強 ,李亞靜

(1.遷安市中醫(yī)醫(yī)院,唐山 064400;2.中華人民共和國濰坊海關,濰坊 261041)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)簡稱冠心病,是一種嚴重威脅身體健康的疾病[1]。醫(yī)師臨床診斷隱匿性CHD 患者中,患者雖然冠脈血管狹窄,但多數(shù)無明確CHD 特征因素,如心電圖、心肌酶譜均無異常,這對醫(yī)師造成極大考驗,易導致誤診或漏診,需要通過檢查冠脈CT 或冠脈造影來進一步確診,費用高且屬于有創(chuàng)檢測。

不同程度CHD 病例臨床表現(xiàn)不同,因此如何對疾病危險性進行有效評價至關重要。研究發(fā)現(xiàn),血清甘氨酸水平降低與CHD 發(fā)生風險增加獨立相關,并且不受糖尿病、高血壓以及血脂紊亂等因素的干擾[2],為CHD 診斷帶來新的思路。在心血管疾病患者中,色氨酸代謝異常會增加心血管疾病發(fā)生風險[3],血漿中色氨酸含量降低、犬尿氨酸(色氨酸代謝物)含量升高與病例死亡和心血管疾病風險增大顯著相關[4-5]。通過對色氨酸及其代謝物進行定性定量分析可以更好地研究CHD 患者的病情,因此研究CHD 患者血液中氨基酸快速靈敏的檢測方法,對醫(yī)師診斷CHD 患者病情有重要的參考意義。

目前,血漿中多種氨基酸的檢測方法主要有高效液相色譜法[6]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[1,5,8-14]。高效液相色譜法通量低,選擇性差,靈敏度達不到要求。LCMS/MS方法選擇性好,靈敏度高,檢測周期短。目前,采用LC-MS/MS 來研究CHD 病例,已經(jīng)有一定的工作基礎,但多數(shù)文獻更偏重于通過大量病例數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[5,8,10-11],而具體用什么條件的質譜方法來進行檢測,方法的靈敏度和適用性如何并未展開討論。在醫(yī)學研究領域,準確定量血漿中的氨基酸十分關鍵,可以為醫(yī)師診斷提供精準的數(shù)據(jù)支持。

本工作選擇CHD 病例血漿為研究對象,結合Qu ECh ERS前處理提取方法,提出了快速測定血漿中14 種氨基酸的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)。該方法靈敏度高、快速、穩(wěn)定、可操作性強,只需單次提取凈化就可以同時定性定量CHD 病例血漿中的14種氨基酸。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC2040/MS-8045型高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀;5810R 型離心機;Auto NE-8 型全自動氮吹儀;BYJ1-40L-AD 型超純水機;MS3 型渦旋振蕩器;ML 204型分析天平;24位水浴氮吹儀;30～300μL移液器。

單標準儲備溶液:100μg·L－1,取適量的各氨基酸,用2%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液稀釋,配制成質量濃度為100μg·L－1的單標準儲備溶液,于4 ℃儲存,存儲期為6個月。

單標準溶液:取適量單標準儲備溶液,分別用2%甲酸溶液稀釋,配制成質量濃度為1μg·L－1的單標準溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

混合標準溶液系列:取適量單標準溶液,混勻,用體積比80∶20的0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液-乙腈的混合液逐級稀釋,配制成質量濃度分別為0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,5.00,10.00,50.00,100.0,150.0,250.0,350.0μg·L－1的混合標準溶液系列,現(xiàn)用現(xiàn)配。

L-脯氨酸的純度不小于99.3%;L-色氨酸和L-精氨酸的純度均不小于99.2%;L-丙氨酸和甘氨酸的純度均不小于99.8%;L-纈氨酸和D-天冬酰胺的純度均不小于99.5%;L-蘇氨酸的純度不小于100.0%;DL-亮氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的純度均不小于99.9%;L-異亮氨酸和L-犬尿氨酸的純度均不小于98.0%;D-天冬氨酸的純度不小于98.8%。

中性氧化鋁;石墨化碳黑(GCB)、C18、N-丙基乙二胺(PSA)和氨丙基粉;甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

InertSustain AQ-C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm,1.9μm);柱溫35 ℃;進樣體積5μL;流量0.3 mL·min－1;流動相A 為體積比900∶99∶1的水-乙腈-甲酸混合液,B為體積比999∶1的乙腈-甲酸混合液。梯度洗脫程序:0～5.0 min 時,B 由25%升至45%;5.0～7.0 min 時,B 由45%升 至85%,保持1.1 min;8.1～10.0 min時,B 由85%降至25%,保持2.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;碰撞氣為氬氣;加熱氣為空氣,流量10 L·min－1;干燥氣為氮氣,流量10 L·min－1;霧化氣為氮氣,流量3 L·min－1;加熱塊溫度400 ℃;脫溶劑管(DL)溫度250 ℃;接口溫度350℃;接口電壓4 k V;多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式,最大掃描速率30 000 u·s－1。其他質譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

取抗凝后的血漿樣品2 mL,置于10 mL 具塞離心管內,加入體積比89∶10∶1 的乙腈-水-甲酸混合液4 mL,渦旋30 s,于4 ℃以轉速10 000 r·min－1離心10 min。轉移上清液4 mL至20 mL干凈玻璃試管中,加入200 mg C18和100 mg氨丙基粉,渦旋振蕩1 min,靜置分層后取2 mL 上清液于10 mL干凈玻璃試管中,接著加入4 mL甲醇混勻,放入水浴氮吹儀中氮氣吹至近干。殘渣用0.5 mL體積比80∶20的1.5%(體積分數(shù))甲酸溶液-乙腈的混合液溶解,振蕩1 min,經(jīng)0.22μm 雙系濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

氨基酸分子屬于兩性電解質,不同氨基酸結構、組成和化學性質有很大差異,如天冬氨酸等電點為2.98,精氨酸等電點為10.76。為提高質譜的離子化效率,參考文獻[5,11],考察了甲酸和乙酸對14種氨基酸響應值的影響。結果發(fā)現(xiàn),以甲酸溶液為水相時的質譜離子響應值比乙酸溶液為水相時提高80%以上。試驗進一步考察了以體積分數(shù)分別為0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%的甲酸溶液作為水相,以甲醇和乙腈分別作為有機相時對14種氨基酸響應值的影響。結果發(fā)現(xiàn),乙腈為有機相時所得14種氨基酸響應值明顯優(yōu)于甲醇,在水相中添加一定比例乙腈,可以進一步提高14種氨基酸的穩(wěn)定性,試驗最終確定以體積比900∶99∶1的水-乙腈-甲酸混合液為水相,以體積比999∶1的乙腈-甲酸混合液為有機相。

試驗考察了 ZORBAX Eclipse XDB-C18(100 mm×2.1 mm,3.5μm)、InertSustain AQ-C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm)、ACQUITY UPLC HSS-C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等3種色譜柱的分離效果。結果表明,InertSustain AQ-C18色譜柱所得檢測周期更短、分離度更好。結合上述優(yōu)化的流動相體系進行梯度洗脫,試驗最終確定的色譜條件見1.2.1節(jié)。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

氨基酸分子結構中同時包含氨基及羧基,因此在ESI＋模式下[1,4,7]和負離子(ESI－)模式下[11]均能進行離子化。試驗通過自動進樣器將100μg·L－1單標準儲備溶液單獨直接注入ESI,分別在ESI＋、ESI－模式下掃描確定各氨基酸前體離子及產(chǎn)物離子,比較兩種模式下14 種氨基酸的響應強度。結果表明,ESI＋模式下目標物的響應強度顯著比ESI－模式高,在ESI＋模式下通過自動優(yōu)化功能進一步優(yōu)化各氨基酸前體離子、產(chǎn)物離子和碰撞能量,匯總最終優(yōu)化的14種氨基酸的MRM 質譜參數(shù)見表1。在上述質譜條件下,MRM 模式下4.00μg·L－1混合標準溶液的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.3 提取凈化條件的優(yōu)化

提取溶劑主要有甲醇-水[15]、乙腈-水[2,9,14]和甲醇-乙腈[5],本試驗結果表明,使用乙腈-水為提取溶劑時回收率較高,在提取溶劑中加入甲酸(甲酸體積占比為1%),回收率進一步提高了14.5%。人體血漿成分繁多,結構和基質復雜,試驗考察了C18、PSA、中性氧化鋁、氨丙基粉、GCB 等5 種常用Qu ECh ERS吸附劑[16-17]的凈化效果,在20.00μg·L－1混合標準溶液中分別加入50 mg Qu ECh ERS吸附劑,處理后按照儀器工作條件測定,并計算14種氨基酸的回收率,結果見表2。

由表2可知,PSA、中性氧化鋁和GCB 對部分氨基酸吸附嚴重,回收率偏低;吸附劑C18和氨丙基粉對14種氨基酸的凈化效果較好,回收率分別為92.3%～105%和90.2%～103%,其中C18可以去除血漿中的色素和甾醇,氨丙基粉可去除血漿中的激素、糖以及某些極性較強的色素。綜合考慮,為提高吸附劑的凈化效果,試驗最終選用C18和氨丙基粉為吸附劑。

表2 在不同吸附劑下14種氨基酸的回收率Tab.2 Recovery of 14 amino acids with different adsorbents

2.4 單標準儲備溶液的配制溶劑的優(yōu)化

文獻[18-20]用0.1 mol·L－1鹽酸溶液配制氨基酸標準溶液,但鹽酸溶液屬于強酸溶液,長期使用會腐蝕質譜離子源噴針、不銹鋼管路,進而導致Cl－數(shù)據(jù)偏差。因此,試驗分別以水、2%甲酸溶液和2%(體積分數(shù),下同)乙酸溶液為溶劑配制單標準儲備溶液,于4 ℃儲存,每月定期檢測,考察了單標準儲備溶液的穩(wěn)定性。結果表明:以水和2%乙酸溶液為配制溶劑時,存放6個月后各氨基酸含量平均下降15.7%和8.2%;而以2%甲酸溶液為配制溶劑時,存放6個月后各氨基酸含量無變化。因此,試驗選用2%甲酸溶液為單標準儲備溶液的配制溶劑。

2.5 標準曲線和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以氨基酸的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。所得氨基酸的線性范圍、線性回歸方程和相關系數(shù)見表3。

按10倍信噪比(S/N)計算方法的測定下限(10S/N),結果見表3。

表3 線性參數(shù)和測定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

2.6 精密度及回收試驗

在血漿基質中添加低、中、高等3個濃度水平的混合標準溶液,按照試驗方法處理,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

由表4可知,14種氨基酸在3個濃度水平下的回收率為82.3%～102%,RSD 為3.3%～12%,符合GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求的準確度和精密度要求。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 樣品分析

試驗收集CHD 住院患者血漿21例(15例男性和6例女性,年齡在46～69歲內,即為患者組),健康受試者血漿12例(6例男性和6例女性,年齡在50～63歲內,即為對照組),經(jīng)醫(yī)院審核批準,受試者在采血前均已被告知本次研究目的和內容,并簽署知情同意書,檢測結果見表5。檢測時稀釋至線性范圍內。

由表5可知,患者組數(shù)據(jù)中,脯氨酸、精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的測定結果高于對照組數(shù)據(jù),而其他氨基酸含量均不同程度降低,說明CHD 患者和健康人群相比,其體內氨基酸含量會因疾病產(chǎn)生變化。通過對比患者不同檢測時期氨基酸含量的變化,以及和正常人群氨基酸含量的差異,從而對患者病情進行推斷。文獻[1]通過多元統(tǒng)計分析提出了預測CHD 的算法模型,方程式y(tǒng)＝1.483×ρ鳥氨酸/瓜氨酸－20.623,為CHD 疾病的診斷和預測提供了新的思路,本工作建立的方法為準確定性定量氨基酸、開展CHD 疾病預測課題研究提供技術支持。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of the samples

本工作借助QuEChERS 前處理凈化技術,結合HPLC-MS/MS提出了快速測定CHD 患者血漿中14種氨基酸含量的方法。該方法準確、快速、簡便、靈敏度高、實用性強,可以滿足對CHD 患者血漿中氨基酸精準定量的檢測要求,對醫(yī)師判斷、治療管理和生理評估病情具有輔助診斷的意義。