杜福映,張花美,吳長(zhǎng)巖,陳 方,劉莉莉,趙長(zhǎng)帥,彭 健,沈 永,施燕平

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院,濟(jì)南 250101;2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250101;3.山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250101)

藥物洗脫支架在心血管領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用,將可降解材料應(yīng)用于藥物涂層,在緩釋藥物的同時(shí),改善了支架的生物相容性,降低了晚期支架內(nèi)血栓的風(fēng)險(xiǎn)[1-3],成為目前的研究熱點(diǎn)之一。

在藥物洗脫支架的研究中,藥物釋放已受到廣泛關(guān)注[4-10]。藥物釋放機(jī)理研究表明,可降解涂層中藥物的釋放主要是通過(guò)擴(kuò)散機(jī)理及聚合物降解溶蝕實(shí)現(xiàn)[8,11]。另有研究表明,可降解材料涂層可提高合金的耐腐蝕性[12-13]。此外,支架球囊擴(kuò)張過(guò)程中,涂層如有剝落,則會(huì)進(jìn)入血液,造成血管堵塞,危害極大[14]。聚合物的降解不僅影響藥物釋放行為,還對(duì)支架平臺(tái)的腐蝕及使用安全產(chǎn)生一定作用。因此,對(duì)涂層多聚物的降解情況進(jìn)行考察具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外研究多以質(zhì)量損失、相對(duì)分子質(zhì)量及其分布、力學(xué)性能及熱力學(xué)性能為研究指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)材料降解[15-17]。然而作為涂層覆于支架表面的聚合物量較低[本工作所用支架涂層聚丙交酯乙交酯(PLGA)量?jī)H為0.16 mg/支架],且支架涂層降解引起質(zhì)量、相對(duì)分子質(zhì)量及熱力學(xué)性能的變化,其準(zhǔn)確數(shù)值難以獲取。因此,建立靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的測(cè)定方法已迫在眉睫。本工作旨在對(duì)一種新型可吸收鋅合金藥物洗脫冠脈支架系統(tǒng)(以下皆簡(jiǎn)稱(chēng)支架)中聚合物涂層的體外降解性能進(jìn)行考察,采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定降解液中乙醇酸、L-乳酸的含量,并對(duì)降解過(guò)程中支架的表觀形貌進(jìn)行觀察,進(jìn)而評(píng)估藥物涂層的降解情況,為支架設(shè)計(jì)、使用提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀;Mettler Toledo XPR2型微量電子天平;SHA-C型往返水浴振蕩器;Millipore-Q 型超純水系統(tǒng);ZEISSSIGMA 300型熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM);BRUKER XFlas 6/60型能譜儀;Bright KAS-2000F型鉑金靶型離子濺射儀。

乙醇酸和L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 g·L－1,分別稱(chēng)取乙醇酸和L-乳酸對(duì)照品約10 mg,用水溶解并定容至10 mL,于4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量的乙醇酸和L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水逐級(jí)稀釋,配制成乙醇酸質(zhì)量濃度分別為1.99,9.93,19.86,39.72,59.58 mg·L－1,L-乳酸質(zhì)量濃度分別為2.92,14.60,29.20,58.39,87.59 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,分別用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8±0.2。

乙醇酸對(duì)照品的純度不小于99.0%;L-乳酸對(duì)照品的純度為90.5%;磷酸為優(yōu)級(jí)純;試驗(yàn)用水為去離子水。

支架來(lái)自某公司,PLGA 的標(biāo)示值為0.16 mg/支架。

1.2 儀器工作條件

XBridge Shield RP18 色譜柱(250 mm ×4.6 mm,3.5μm);柱溫40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm;進(jìn)樣量20 μL;流 量0.2 mL·min－1;流動(dòng)相 為20 mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8);等度洗脫。

1.3 試驗(yàn)方法

取支架5個(gè),將每個(gè)支架用尼龍繩穿過(guò)并懸吊于50 mL離心管中,用已預(yù)熱至37 ℃的10 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)將所有支架浸沒(méi)。將離心管置于37℃往返恒溫水浴振蕩器中振蕩,轉(zhuǎn)速為60 r·min－1。分別在0,7,14,21,28 d時(shí)將支架取出,超純水沖洗后,吸干表面水分后置于放有10 mL PBS(pH 7.4)的離心管中,重新放回37 ℃水浴振蕩器中,直至試驗(yàn)結(jié)束。取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)降解液,用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8±0.2,經(jīng)0.20μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC測(cè)定。

取各降解階段的支架樣品,用導(dǎo)電膠黏貼固定至SEM 樣品臺(tái)上,經(jīng)離子濺射儀噴金(鉑金)后進(jìn)行形貌觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架涂層的表征

體外降解試驗(yàn)開(kāi)始前,對(duì)支架涂層進(jìn)行表征。按照臨床使用方法,將球囊擴(kuò)張后,取支架進(jìn)行測(cè)定、分析。結(jié)果顯示:支架涂層的可降解材料為乙醇酸、L-乳酸的開(kāi)環(huán)共聚物,乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量比為30∶70;重均分子量為1.5×105,數(shù)均分子量為0.9×105,分布系數(shù)為1.7(以聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照);PLGA 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為48.2 ℃。SEM圖像顯示支架涂層完整,未有脫落現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2 色譜行為

按儀器工作條件對(duì)乙醇酸、L-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,其色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

結(jié)果表明:乙醇酸和L-乳酸的保留時(shí)間分別為14.8,18.8 min,各色譜峰無(wú)拖尾、峰形對(duì)稱(chēng)完整,達(dá)到較好分離,專(zhuān)屬性較好;乙醇酸、L-乳酸的測(cè)定也不受其他水溶性降解產(chǎn)物干擾。在體外降解過(guò)程中,PLGA 逐漸水解為相對(duì)分子質(zhì)量更小的多聚物和寡聚物,乙醇酸、L-乳酸為其終產(chǎn)物,而相對(duì)分子質(zhì)量較大的產(chǎn)物不能溶解于降解液中,進(jìn)樣前被濾去。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明:乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積呈線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

根據(jù)3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),根據(jù)10 倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1 可知:乙醇酸的檢出限為0.50 mg·L－1,測(cè)定下限為2.00 mg·L－1;L-乳酸的檢出限為0.70 mg·L－1,測(cè)定下限為3.00 mg·L－1。

表1 線(xiàn)性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度試驗(yàn)

取空白降解樣品溶液(樣品基質(zhì)為PBS)若干份,分別加入低、中、高等3 個(gè)濃度水平的乙醇酸、L-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行處理,平行測(cè)定6 次,記錄峰面積,計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of test for precision(n＝6)

由表2可知,乙醇酸的RSD 為0.12%～2.7%,L-乳酸的RSD 為0.14%～2.5%,說(shuō)明方法具有較高的精密度,滿(mǎn)足分析要求。

2.5 回收試驗(yàn)

取空白降解樣品溶液(樣品基質(zhì)為PBS)若干份,分別加入低、中、高等3 個(gè)濃度水平的乙醇酸、L-乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行處理、測(cè)定,計(jì)算加標(biāo)回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery

由表3可知:乙醇酸的加標(biāo)回收率為99.5%～118%,L-乳酸的加標(biāo)回收率為91.6%～102%,說(shuō)明方法具有較高的準(zhǔn)確度,滿(mǎn)足分析要求。

2.6 樣品分析

2.6.1 降解液中乙醇酸、L-乳酸的測(cè)定

按儀器工作條件對(duì)降解液中乙醇酸、L-乳酸進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 降解產(chǎn)物的累積量Tab.4 Cumulative amounts of the degradation products mg

由表4可知:在降解的前7 d,降解液中乙醇酸、L-乳酸的含量低于方法的檢出限;隨后在降解液中檢出乙醇酸、L-乳酸,且累積釋放量逐漸增加,28 d內(nèi)的總量為0.902 5 mg,降解回收率約為113%,說(shuō)明支架中的聚合物涂層基本完全降解。

2.6.2 支架表觀形貌的變化

采用SEM 對(duì)降解后經(jīng)干燥的支架進(jìn)行觀察,如圖2所示,分別為支架降解0,7,14,21,28 d的SEM 圖。如圖2(a)所示,本工作所用支架涂層表面完整,光滑且無(wú)明顯缺陷。隨著降解進(jìn)行,聚合物水解為小分子并釋放到降解液中,光滑的涂層表面逐漸出現(xiàn)微小孔隙[圖2(b)],孔隙隨后變大[圖2(c)]并連成較大的洞[圖2(d)],直至完全溶蝕至降解液中[圖2(e)]。將28 d樣品放大約1萬(wàn)倍,如圖2(f)所示,聚合物涂層降解后,金屬表面形成一層薄膜,能譜分析結(jié)果顯示,除含有鋅元素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.6%)外,還含有碳、氧、鈉等元素,可能是鋅和鈉的碳氧化物薄膜,該膜能夠繼續(xù)保護(hù)鋅支架,防止支架過(guò)快腐蝕。

圖2 降解中的支架SEM 圖Fig.2 SEM images of the degrading stents

本工作采用HPLC 測(cè)定新型藥物洗脫支架涂層聚合物的降解產(chǎn)物乙醇酸、L-乳酸的含量,該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、精密度與回收率均滿(mǎn)足測(cè)定要求;同時(shí)通過(guò)SEM 直觀、形象地觀察到支架降解過(guò)程中的形貌變化,達(dá)到測(cè)定、分析新型藥物洗脫支架涂層聚合物的降解產(chǎn)物乙醇酸、L-乳酸的目的,為支架設(shè)計(jì)、使用提供了技術(shù)參考。