陳科 ，洪瀟 ，馮彥超 ，應(yīng)偉 ，李文菠 ，李釗 ，趙敬兵 ，汪杰 ，周國俊 ，冷政偉

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川南充 637000；2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤干細胞研究中心

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，惡性程度極高，5 年總生存率不足8%［1］。胰腺癌起病隱匿，早期發(fā)現(xiàn)率極低，確診時多處于中晚期進展階段，失去根治性手術(shù)機會。目前全世界胰腺癌的診治現(xiàn)狀不容樂觀，手術(shù)聯(lián)合輔助化療是目前可切除胰腺癌的最有效的治療手段，但僅有20%的患者可行手術(shù)治療，術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，根治性手術(shù)后的患者5 年生存率也僅為25%［2-3］。迄今，胰腺癌的病因和確切的分子機制尚不清楚，可能涉及多個基因的表達異常。因此，尋找胰腺癌的關(guān)鍵基因?qū)τ诖_立早期診斷、預(yù)后標志物和治療新靶點至關(guān)重要。近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，基因芯片和基因測序的運用已成為研究腫瘤疾病必要且高效的方法。如今各大數(shù)據(jù)庫中擁有豐富的基因檢測和分析結(jié)果，但缺少精確、有效的數(shù)據(jù)挖掘。本研究利用生物信息學(xué)方法對胰腺癌與癌旁正常組織進行差異表達基因篩選并深入分析，旨在為胰腺癌尋找到特異的腫瘤分子標志物和藥物治療靶點。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)信息來源 從NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo）中下載3 個胰腺癌芯片，即GSE71989、GSE62165、GSE62165，分別包含胰腺癌組織13、118、15例，癌旁組織8、13、7例。

1.2 胰腺癌與癌旁組織差異表達基因及共表達差異基因的篩選 通過GEO2R在線工具，以｜logFC｜＞2 且校正P＜0.05 的基因為差異表達基因，其中l(wèi)ogFC＞2 為上調(diào)，logFC＜-2 為下調(diào)，定義胰腺癌與癌旁組織中的差異表達基因。通過韋恩在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）繪制韋恩圖，獲得3 個基因芯片共有的差異表達基因。

1.3 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的篩選將所獲得的共有差異表達基因用STRING 網(wǎng)站（https：//string-db. org）構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape3.7.2軟件及MCODE插件分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖，獲得PPI中聯(lián)系最為緊密的核心網(wǎng)絡(luò)，將這核心網(wǎng)絡(luò)中的基因定義為核心差異表達基因。MCODE 分析設(shè)置條件：度數(shù)截斷值=2，節(jié)點分數(shù)截斷值=0.2，K-分數(shù)=2，最大深度=100。

1.4 核心差異表達基因不同表達量胰腺癌患者的生存情況分析 在GEPIA 網(wǎng)站（http：//gepia. cancer-pku.cn）中，對核心差異表達基因分別進行生存分析，選擇總生存期（OS）為指標，癌癥名稱選擇胰腺癌，描繪核心差異表達基因高表達與低表達患者的生存曲線圖，篩選出生存分析中P＜0.05 的基因，作為胰腺癌預(yù)后相關(guān)基因。

1.5 預(yù)后核心差異表達基因在胰腺癌與癌旁組織中的表達分析 在GEPIA 網(wǎng)站中，利用Box Plots 分析胰腺癌與癌旁組織中相關(guān)基因的表達量，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 個基因芯片共表達差異基因篩選結(jié)果 從3 個基因芯片 GSE71989、GSE62165、GSE19650 中分別篩選出1 085、1 598、3 426 個差異表達基因，其中上調(diào) 887、1 140、728 個，下調(diào)198、458、2 698 個。通過韋恩圖分析，獲得3 個基因芯片共表達差異基因156個，其中上調(diào)62個、下調(diào)94個。見圖1。

圖1 3個芯片差異表達基因的韋恩圖

2.2 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的篩選結(jié)果 將156 個差異表達基因提交至STRING 在線網(wǎng)站后，共有152 個基因出現(xiàn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，其中節(jié)點數(shù) 152 個，邊數(shù) 291 條，聚類系數(shù) 0.447，見 OSID碼圖1。將得到的PPI 使用Cytoscape3.7.2 軟件及MCODE 插件分析后，得到2 個相交點最多的基因簇；將這2 個基因簇涉及的差異表達基因定義為核心差異表達基因，共得到19 個核心差異表達基因，其中上調(diào)基因6個，即ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A，下調(diào)基因 13 個，即 CPA1、CTRL、CLPS、CTRC、CPA2、CEL、CELA2B、PLA2G1B、PNLIPRP1、PNLIP、CELA3A、SYCN、CPB1。

2.3 核心差異表達基因不同表達量胰腺癌患者的OS 比較 使用GEPIA 在線網(wǎng)站對19 個核心差異表達基因不同表達量患者的OS 進行比較，結(jié)果顯示，ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A 基因在高表達患者的OS 低于低表達患者（P均＜0.05），見OSID 碼圖2。其余13 個基因不同表達量患者的OS比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.4 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的表達量比較 在GEPIA 網(wǎng)站中利用Box Plots 對上述6 個與預(yù)后相關(guān)的基因進行表達量驗證，結(jié)果顯示6 個基因在胰腺癌中的表達量均高于癌旁組織（P均＜0.05）。見OSID碼圖3。

3 討論

胰腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及基因、環(huán)境、飲食等多種因素的共同作用過程，利用生物信息學(xué)技術(shù)準確篩選出導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，能夠為胰腺癌的早期診斷和精準靶向治療提供重要依據(jù)?；蛐酒侵咐矛F(xiàn)代探針固相原位合成技術(shù)、照相平板印刷技術(shù)、高分子合成技術(shù)等微電子技術(shù)把大量分子生物學(xué)技術(shù)具體而微的固定在一定狹小的空間內(nèi)，以實現(xiàn)高速度、高通量、集約化和低成本的分析技術(shù)。本研究基于生物信息學(xué)分析，在GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選出近幾年樣本量較大的3份胰腺癌與癌旁組織基因芯片，在多個生物信息分析網(wǎng)站中進行系統(tǒng)全面的分析，最終得出ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP、RRM2、TOP2A 基因與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。

ANLN 是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，在胞質(zhì)分裂中起重要作用。在乳腺癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌中，ANLN 上調(diào)可影響細胞的增殖、遷移和浸潤，進而導(dǎo)致腫瘤的進展［4-5］。研究顯示，ANLN 表達水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)，可能是因為ANLN 可以通過細胞骨架重塑促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細胞遷移，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。WANG等［7］研究認為，ANLN在胰腺癌高表達可能與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，ANLN 可誘導(dǎo) EZH2 上調(diào)，通過 miR-218-5p/LASP1信號軸促進胰腺癌發(fā)生發(fā)展。

CDK1 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在調(diào)節(jié)細胞周期、DNA 復(fù)制和分離的進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。VASSILEV 等［8］報道，使用 CDK 抑制劑誘導(dǎo)的G2期阻滯可阻止DNA 雙鏈斷裂的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸期，認為CDK1 是一種與腫瘤生長相關(guān)的細胞周期調(diào) 節(jié) 劑 。 ZHANG 等［9］研 究 發(fā) 現(xiàn) ，CDK1 是 BRAF V600E 結(jié)直腸癌中細胞凋亡抗性的新介質(zhì)，其與MEK/ERK 抑制劑聯(lián)合是一種有效的臨床治療策略。HUANG 等［10］利用 CDK 抑制劑阻斷細胞因子干擾素γ 誘導(dǎo)的IDO1 和CD274 在小鼠胰腺癌細胞中表達，小鼠總體存活率顯著提高，提示CDK1 可能是胰腺癌治療的靶點之一。

ECT2 是GTP 酶Rho 家族的鳥嘌呤核苷酸交換因子，ECT2 在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達［11-13］，可能與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)。LI 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白1（YAP1）在胰腺癌惡化起著關(guān)鍵作用，通過YAP1 抑制劑降低ECT2 蛋白表達，可以降低胰腺癌細胞在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移性肝癌的生長，為早期檢測和治療胰腺癌提供了新的思路。有研究發(fā)現(xiàn)，ECT2 可通過RhoA-ERK 信號通路調(diào)控VEGF 和MMP9 的表達，抑制食管鱗狀細胞癌增殖、侵襲、遷移和腫瘤的發(fā)展［11］。MANSOUR 等［12］認為，ECT2 可能是乳腺癌的標志物；HIRATA等［13］對242例非小細胞肺癌和240 例食管鱗狀細胞癌進行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)ECT2 陽性腫瘤患者的生存期較ECT2 陰性患者縮短。

NUSAP1 是增殖細胞中所需的微管結(jié)合蛋白，NUSAP1作為細胞有絲分裂調(diào)控因子，其異常表達可能通過影響細胞有絲分裂過程而導(dǎo)致細胞癌變。LIU等［15］報道，NUSAP1表達與腫瘤組織病理學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且NUSAP1高表達患者的生存期明顯低于NUSAP1 低表達患者。但NUSAP1 上調(diào)的分子機制仍然未知，先前研究報道NUSP1 可能通過調(diào)控BTG2/PI3K/AKT 信號通路抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移［16］。但關(guān)于胰腺癌與NUSAP1關(guān)系的報道目前少見。

RRM2是一種參與DNA合成和損傷修復(fù)的限速酶，在細胞增殖、侵襲、遷移、血管生成等過程中起著至關(guān)重要的作用。利用生物信息學(xué)分析，RRM2 過表達可能是腫瘤進展的重要組成部分，也是許多癌癥的生物標志物，為RRM2 做為癌癥新的治療靶點提供了依據(jù)。YANG 等［17］報道，鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化物引發(fā)的細胞死亡過程與肝癌發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，RRM2 的磷酸化通過谷胱甘肽合成酶以維持谷胱甘肽水平防止鐵死亡。RüSTEM 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，GW8510 能夠顯著降低RRM2 蛋白水平，與吉西他濱協(xié)同作用可抑制胰腺癌細胞增殖和遷移。

TOP2A 是一種控制DNA 拓撲狀態(tài)的酶，它在有絲分裂過程中催化雙鏈DNA 斷裂并促進基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，TOP2A 在各種癌癥中過度表達。CHEN等［19］通過生物信息方法證實，TOP2A 對胰腺癌具有很高的診斷價值，但并未深入探討與胰腺癌作用機制。DONG 等［20］報道，TOP2A通過調(diào)節(jié)SnaiL表達觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進肝癌進展。PEI 等［21］研究認為，TOP2A是miR-139的直接靶點，TOP2A通過激活β-catenin信號通路促進胰腺癌細胞增殖和遷移。這提示TOP2A 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。

綜上所述，本研究使用生物信息學(xué)的方法挖掘出 6 個基因 ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A 可能是胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要基因，且與浸潤性乳腺癌、硬囊卵巢、先天性發(fā)育不全、喉鱗狀細胞癌、雌激素受體陽性乳腺癌等具有重要關(guān)系。這6 個基因可為胰腺癌早期診斷及治療的新靶點，并為胰腺癌的機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。