陳開瀾，楊李，宋娜，吳彬，李暉

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院血液腫瘤科，武漢 430016

噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥（HLH）是由過度活化的淋巴組織細(xì)胞無效增生導(dǎo)致的高炎癥反應(yīng)，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子風(fēng)暴常引起持續(xù)發(fā)熱、肝脾腫大、多器官功能障礙、血細(xì)胞進行性下降、組織細(xì)胞吞噬血細(xì)胞等現(xiàn)象。HLH 在兒童和嬰幼兒高發(fā)，起病急，病情進展迅速，病死率高［1］。HLH 分為原發(fā)性HLH 和繼發(fā)性HLH，兒童繼發(fā)性HLH 原因主要是感染，特別以EB 病毒（EBV）感染最常見。按照國際組織細(xì)胞協(xié)會推薦的HLH-1994 方案給予激素聯(lián)合依托泊苷治療雖然可控制HLH 的高炎癥反應(yīng)，但對EBV 無清除作用，特別是對感染T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞的EBV 清除無能，往往會導(dǎo)致疾病復(fù)燃惡化［2-3］。其他慢病毒諸如乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒及某些腫瘤中均存在的T 細(xì)胞功能耗竭，即在慢病毒感染及腫瘤負(fù)荷的機體中T 淋巴細(xì)胞在持續(xù)抗原刺激下功能異常狀態(tài)，主要是抑制性受體表達，分泌細(xì)胞因子能力以及穿孔素、顆粒酶的殺傷功能減退，T 淋巴細(xì)胞自我更新及增殖能力降低等一系列功能耗竭表現(xiàn)［4-5］。EB 病毒感染后的HLH 可能同樣存在這種T 淋巴細(xì)胞耗竭而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞不能清除感染細(xì)胞。本研究對EBV 感染繼發(fā)噬血細(xì)胞綜合征（EBV-HLH）患兒的T 淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子水平進行分析，探討T 細(xì)胞功能耗竭在EBV 感染的HLH 中發(fā)揮的作用，為臨床診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 EBV 感染確診標(biāo)準(zhǔn)：實驗室檢查抗EB 病毒VCA-IgM 和抗EBV-VCA-IgG 抗體陽性，或?qū)崟r定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測EBV-DNA陽性，滿足以上任一種情況即可確診。HLH 的診斷根據(jù)國際組織細(xì)胞協(xié)會HLH 2004 診斷標(biāo)準(zhǔn)（以下 8 條至少滿足 5 條）［3］：①發(fā)熱；②全血細(xì)胞減少（三系中至少兩系減少）：血紅蛋白＜90 g/L、血小板＜100×109/L 或中性粒細(xì)胞＜1×109/L；③脾腫大（肋下≥3 cm）；④低纖維蛋白原血癥和（或）高甘油三酯血癥：纖維蛋白原≤1.5 g/L，甘油三酯≥3 mmol/L；⑤骨髓或淋巴結(jié)形態(tài)學(xué)涂片發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞存在，無惡性腫瘤證據(jù)；⑥可溶性CD25≥2 400 U/mL；⑦NK 細(xì)胞活性減低或缺乏；⑧鐵蛋白≥500μg/L。選取 2019 年 2 月—2021 年 11 月我院收治的EBV-HLH 患兒23例，男15例、女8例，年齡1.6～14 歲、中位年齡5.6 歲，外周血免疫球蛋白IgG（9.9 ± 2.9）g/L，EBV-DNA 載量 2 480（87，7 030）×103copies/mL；另選擇同期收治的EBV 感染相關(guān)傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）患兒29 例作為對照組，男 22 例、女 7 例，年齡 1.8～13 歲、中位年齡3.9 歲，外周血免疫球蛋白IgG（11.08 ± 3.25）g/L，EBV-DNA 載 量 937（176，2 210）×103copies/mL。兩組性別、年齡、外周血免疫球蛋白水平及EBVDNA 載量具有可比性。

1.2 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群檢測 使用EDTA 抗凝管采集患兒靜脈血2 mL，24 h內(nèi)上BD 公司FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測。取100 μL 血加入PECD3、FITC-CD57、PE-Cy7-CD4、Apc-CD279（PD1）、V450-CD69、V500-CD45、Apc-Cy7-CD8 各 20 μL，同時設(shè)同型對照管?；靹蚝? ℃避光孵育30 min，離心、洗滌、棄上清液，加入0.5 mL 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分別檢測CD3（+總T 淋巴細(xì)胞）及CD4+CD3（+調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞）、CD8+CD3（+殺傷性T淋巴細(xì)胞）亞群中的PD1+細(xì)胞（程序化死亡受體）、CD57+細(xì)胞（終末衰老T細(xì)胞）、CD69+活化細(xì)胞（刺激后活化的T細(xì)胞）比例。每管獲取10 000個細(xì)胞，結(jié)果以百分率表示。

1.3 外周血T 淋巴細(xì)胞因子水平檢測 采集患兒EDTA 抗凝的靜脈血2 mL，應(yīng)用BD 公司FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀和江西諾德醫(yī)療器械有限公司試劑盒，將捕獲微球混合液（包含抗人IL-2 單抗、抗IL-4單抗、抗 IL-6 單抗、抗 IL-10 單抗、抗 TNF-α 單抗、抗IFN-γ 單抗）低速離心 2 000 r/min 離心 5 min，吸去上清，加入與所吸走上清等體積的微球緩沖液，渦旋充分混勻后，避光孵育30 min。每個實驗管中加25 μL 孵育后的捕獲微球混勻液，標(biāo)準(zhǔn)管加入25μL梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本管加入25μL 待測血漿。所有實驗管加25 μL 熒光抗體檢測試劑，室溫孵育2.5 h，加入 PBS 緩沖液，離心棄上清，加入 100 μL PBS 緩沖液，上機進行熒光檢測 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。采用Shapirowilk 檢驗和Q-Q圖方法進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組T 淋巴細(xì)胞亞群比較 EBV-HLH 組活化的CD69+CD3+T 淋巴細(xì)胞比例高于EBV-IM 組，PD1+CD3+T 淋 巴 細(xì) 胞 比 例 低 于 EBV-IM 組（P＜0.05），兩組CD57+CD3+T 淋巴細(xì)胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。進一步比較顯示，EBV-HLH組CD69+CD3+T 淋巴細(xì)胞主要以CD69+CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞增高為主（P＜0.05），而CD69+CD4+CD3+T淋巴細(xì)胞增高不明顯（P＞0.05）；PD1+CD3+T 淋巴細(xì)胞主要以PD1+CD8+CD3+T 淋巴細(xì)胞減少為主（P＜0.05），而PD1+CD4+CD3+T淋巴細(xì)胞減少不明顯（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組CD3+T淋巴細(xì)胞中CD57+、CD69+及PD1+細(xì)胞比例比較［%，M（P25，P75）］

表2 兩組CD4+CD3+及CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中CD69+和PD1+細(xì)胞比例比較［%，（P25，P75）］

2.2 兩組外周血細(xì)胞因子水平比較 見表3。

表3 兩組外周血細(xì)胞因子水平比較［ng/L，M（P25，P75）］

3 討論

目前，HLH 的治療主要采用國際組織細(xì)胞協(xié)會的HLH-94/2004方案，包括地塞米松、依托泊苷等藥物，治療目標(biāo)是抑制組織細(xì)胞/巨噬細(xì)胞過度激活和增殖導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴［6］。理想的EBV-HLH治療不僅要控制細(xì)胞因子風(fēng)暴，同時還要修復(fù)受損的免疫細(xì)胞功能，從而最終清除EBV感染細(xì)胞，達到從根本上治愈疾病。EBV-IM為原發(fā)性EBV感染，病毒多在B淋巴細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，殺傷性T淋巴細(xì)胞（CTLs）則負(fù)責(zé)清除感染的B 淋巴細(xì)胞，同時產(chǎn)生記憶細(xì)胞。而EBV-HLH的發(fā)病機制與IM不同，EBV多感染T淋巴細(xì)胞或NK 細(xì)胞，CTLs 清除病毒感染的細(xì)胞能力下降，被感染的細(xì)胞出現(xiàn)克隆增殖，引起持續(xù)性無效的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子大量釋放和級聯(lián)反應(yīng)，從而形成噬血細(xì)胞綜合征［7-8］。本研究結(jié)果顯示，EBV-HLH 組 CD69+CD3+的活化 T 淋巴細(xì)胞比例高于EBV-IM 組，提示EBV-HLH 確實激活了更多的活化T 淋巴細(xì)胞進入血液，且主要激活的是CD69+活化細(xì)胞。EBV-HLH的發(fā)生與EBV感染負(fù)荷無明顯相關(guān)性，表現(xiàn)為EBV-HLH 組與EBV-IM 組的病毒載量無明顯差異。已有研究表明，細(xì)胞免疫而非體液免疫在EBV-HLH發(fā)揮主導(dǎo)作用，恢復(fù)受損的細(xì)胞免疫功能才能從根本上治愈EBV-HLH［9-10］。本研究中也顯示，兩組患兒外周血IgG、IgM等體液免疫的球蛋白水平接近，無明顯差異。

T 細(xì)胞功能耗竭主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞毒作用減低甚至喪失、分泌細(xì)胞因子能力降低。細(xì)胞功能丟失按等級依次出現(xiàn)，首先丟失的是細(xì)胞毒性、增殖能力和IL-2產(chǎn)生能力，隨后丟失的是TNF-α 產(chǎn)生能力，嚴(yán)重的耗竭則出現(xiàn)病毒特異性細(xì)胞部分或完全喪失細(xì)胞毒脫顆粒的能力，最終導(dǎo)致病毒特異性T 淋巴細(xì)胞凋亡［11-12］。既往研究認(rèn)為，CD57、KLRG1 和PD1 均與細(xì)胞的復(fù)制性衰老相關(guān)，表達這些標(biāo)志物的細(xì)胞增殖能力較弱，生長停滯，自我更新減退，喪失分化能力，對增殖刺激反應(yīng)差［13］。但PD1 和CD57 并不總是同時表達，特別是終末分化效應(yīng)記憶細(xì)胞（TEMRA）群會表達更高的CD57 和KLRG1但不表達PD1，而效應(yīng)記憶性細(xì)胞（CD28-CD 45RA-）通常高表達PD1但卻無CD57，這種差異性表達可能代表細(xì)胞從高增殖/低細(xì)胞毒性功能轉(zhuǎn)換為低增殖/高細(xì)胞毒性［14］。終末效應(yīng)細(xì)胞 TEMRA 有高水平的CD57 表達與復(fù)制性衰老有關(guān)，而程序化死亡受體PD1表達在效應(yīng)記憶細(xì)胞與免疫細(xì)胞的耗竭有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，EBV-HLH 組與EBV-IM組CD57+CD3+T 淋巴細(xì)胞比例無明顯差異，而PD1+CD3+T 淋巴細(xì)胞 EBV-HLH 組較 EBV-IM 組明顯減少，說明這種代表復(fù)制性衰老的終末效應(yīng)細(xì)胞在兩組間無明顯區(qū)別，而代表低增殖高細(xì)胞毒性的PD1+CD3+T 淋巴細(xì)胞在EBV-HLH 組明顯減少。提示效應(yīng)功能的T淋巴細(xì)胞減少而不是凋亡衰老導(dǎo)致EBV-HLH 發(fā)生。特別是在EBV-HLH 組中，以PD1+CD8+CD3+T 淋巴細(xì)胞減少為主而非PD1+CD4+CD3+T 淋巴細(xì)胞減少，也表明是T 淋巴細(xì)胞殺傷功能受損而非調(diào)節(jié)功能受損導(dǎo)致EBV-HLH，即EBVHLH中T淋巴細(xì)胞的耗竭主要表現(xiàn)在PD1+CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞的耗竭。這為PD-1和PD-L1等程序化死亡受體相關(guān)因子在EBV-HLH 中的應(yīng)用提供了部分依據(jù)。ROBERTS 等［15］在外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)體系中用PD1 特異性抗體pembrolizumab 阻斷PD1/PDL1相互作用，可恢復(fù)PD1+T淋巴細(xì)胞的分泌細(xì)胞因子功能，表明免疫耗竭是可逆的。LIU 等［16］在EBV-HLH 患者中應(yīng)用 PD1 抑制劑 Nivolumab，提高了PD-1、LAG-3表達的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞亞群，增強了T 淋巴細(xì)胞清除EBV 感染細(xì)胞的能力，同時控制了HLH的發(fā)展。

IL-2和IFN-γ促進T淋巴細(xì)胞終末分化與擴增，大量的靜止T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞，而IL-10抑制T淋巴細(xì)胞增殖。IL-2由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，使靜止T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化T淋巴細(xì)胞，促進T淋巴細(xì)胞增殖及分化，IL-2增強CTLs、NK細(xì)胞殺傷活性及誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生［8］。IFN-γ 可以促進 T 淋巴細(xì)胞的增殖與分化，從而促使T淋巴細(xì)胞活化為效應(yīng)細(xì)胞?；罨男?yīng)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，持續(xù)刺激T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不受控制的增殖，導(dǎo)致大量終末分化階段的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，T淋巴細(xì)胞一方面被耗竭，一方面其正常的殺傷功能減弱［14，17］。IL-10 高表達具有免疫抑制作用，抑制人IL-2分泌，抑制Th細(xì)胞分化及T淋巴細(xì)胞增殖［8］。本研究結(jié)果顯示，EBVHLH組IL-2、IFN-γ水平較EBV-IM組升高，這兩種細(xì)胞因子持續(xù)刺激可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞大量進入終末分化階段（持續(xù)被耗竭）而減弱其細(xì)胞毒殺傷作用；同時抑制性細(xì)胞因子IL-10 在EBV-HLH 組較EBVIM 組升高，抑制了正常T 淋巴細(xì)胞增殖。本研究與既往湯永民等［19］報道的HLH患兒Th1/Th2細(xì)胞因子譜表達差異相符，也一定程度上說明EBV-HLH中受損的細(xì)胞免疫功能可能由于T淋巴細(xì)胞耗竭導(dǎo)致。

總之，本研究支持在EBV-HLH 中存在以T 細(xì)胞功能耗竭為主的疾病發(fā)展機制，提示程序化死亡因子及其受體拮抗劑在EBV-HLH 應(yīng)用具有一定臨床意義。進一步研究需要通過單細(xì)胞功能測序探討耗竭T淋巴細(xì)胞的具體亞型對免疫檢查點拮抗劑具有最佳響應(yīng)，從而依據(jù)其表型篩選出更適合應(yīng)用免疫檢查點抑制劑患者。