于瀟，王玉超 ，劉金星，鄭偉，張芳，劉鵬飛

1 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科，濟南 250014；2 青島中西醫(yī)結合醫(yī)院婦科；3 山東中醫(yī)藥大學教務處；4 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院生殖與遺傳科

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常和生育能力下降［1］。POI 的發(fā)生機制可能與卵泡顆粒細胞凋亡引起卵泡異常閉鎖、卵巢功能損害有關。Hedgehog（Hh）信號具有進化保守性，在細胞增殖及分化過程中起先導作用［2］。研究表明，Hh 信號通路的關鍵基因Hh、腫瘤抑制基因（Ptch）和原癌基因（Smo）、鋅指蛋白1（Gli1）存在于哺乳動物卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞及卵巢間質中［3］，可以調控Bax、Bcl-2等靶基因的表達，抑制卵巢顆粒細胞凋亡。補腎養(yǎng)精顆粒是由本團隊自擬的治療POI 的中藥方，前期臨床及基礎研究證實，該方能夠促進卵泡發(fā)育及促排卵，改善卵巢內分泌功能［4-5］。動物實驗顯示，補腎養(yǎng)精顆?？赏ㄟ^調節(jié)凋亡相關基因Bcl-2、Bax、PI3K、AKT 表達，抑制卵泡顆粒細胞凋亡，從而改善POI 大鼠卵巢功能［6］。但是，補腎養(yǎng)精顆粒是否能夠通過調控Hh 信號通路來抑制卵巢顆粒細胞凋亡尚不明確。2019 年 7 月—2022 年 6 月，我們以Hh通路為調控顆粒細胞凋亡的作用靶點，觀察補腎養(yǎng)精顆粒對POI 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的抑制作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠90只，體質量（190±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗中心，SPF級屏障環(huán)境，溫度20～24 ℃，濕度50%～60%，適應性喂養(yǎng)2周后用于實驗。

1.1.2 藥物與試劑 補腎養(yǎng)精顆粒組成：菟絲子18 g、熟地黃12 g、枸杞子15 g、覆盆子9 g、當歸12 g、白芍12 g、川芎9 g、醋香附12 g、炒枳殼12 g、炙淫羊藿12 g、鹽知母12 g、鹽車前子6 g、川牛膝15 g、黨參12 g、益母草15 g、制五味子9 g。中藥飲片劑量為192 g，經(jīng)換算相當于配方顆粒33.3 g，取33.3 g中藥免煎顆粒（購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房）置于燒杯中，加入95 mL 純凈水攪拌后加熱溶解，配制成補腎養(yǎng)精顆粒中劑量灌胃藥液，4 ℃保存。雷公藤多苷片為遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司產品，戊酸雌二醇（補佳樂）為拜耳醫(yī)藥保健有限公司產品，孕馬血清促性腺激素（PMSG）為北京索萊寶科技有限公司產品。戊二醛購自北京雷根生物技術有限公司，PBS 緩沖液、紅細胞裂解液、Gli1 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，丙酮溶液購自南京試劑股份有限公司，DAB 顯色劑購自中杉金橋生物技術有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自Elabscience公司，Western一抗稀釋液購自碧云天生物技術有限公司，Bax、Bcl-2、Shh 抗體購自Proteintech 公司，Ptch1抗體購自Affinity公司。

1.1.3 實驗儀器 病理切片機購自德國LEICA 公司，透射電鏡購自日本日立公司，離心機購自上海安亭科學儀器廠，Mini-PROTEAN Tetra 電泳儀、Mini Trans-Blot 轉印儀購自Bio-Rad 公司，化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司，微量分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司，凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 動物分組與模型制作 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分成空白組15 只和模型組75 只，模型組給予50 mg/（kg·d）雷公藤多苷混懸液灌胃制備 POI 模型，空白組給予0.9%氯化納注射液2 mL/d 灌胃，每天1 次，連續(xù)14 d。以大鼠動情周期紊亂為造模成功。

1.3 干預方法 造模結束后，將模型組分為模型對照組、補佳樂組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組各15只。參照人與動物之間藥物劑量換算方法［7］，中藥低、中、高劑量組分別給予補腎養(yǎng)精顆粒1.75、3.5、7.0 g/（kg·d）灌胃，補佳樂組給予補佳樂0.1 mg/（kg·d）灌胃，空白組和模型對照組繼續(xù)灌服0.9%氯化納注射液，連續(xù)給藥15 d。

1.4 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡狀態(tài)觀察 末次給藥24 h 后，每組分別隨機取6 只大鼠，給予PMSG 50 IU皮下注射進行促排卵干預，以提取卵巢顆粒細胞。48 h后將大鼠脫頸椎處死，75%乙醇浸泡消毒，取出雙側卵巢。在解剖鏡下用1 mL 注射器針頭刺破卵巢表面卵泡，使顆粒細胞釋放，吹打分散成單個懸浮細胞，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清。加入 3 倍體積的紅細胞裂解液，冰上放置15 min。在避光條件下依次加入 5 μL Annexin V-FITC 染液和 5 μL PI 染色液，室溫避光孵育20 min。使用FlowJo7.6 軟件，以FITC 為橫坐標、PI 為縱坐標繪制雙色散點圖，計算細胞碎片、晚期凋亡細胞、早期凋亡細胞及正常細胞的百分率。

1.5 大鼠卵泡超微化結構觀察 末次給藥后24 h，各組剩余9 只大鼠給予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，取出雙側卵巢。右側卵巢固定于2.5%戊二醛中，在解剖鏡下完整分離出卵巢表面較大的卵泡，PBS 緩沖液漂洗，固定液固定，丙酮梯度脫水，滲透后包埋在包埋板中進行聚合處理，制成50～60 nm 厚度的超薄切片。采用檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染色法，在透射電子顯微鏡下觀察卵泡的超微化結構。左側卵巢加入液氮，-80 ℃冰箱保存，用于檢測凋亡相關蛋白。

1.6 大鼠卵巢組織Hh 信號通路關鍵基因Shh、Ptch1、Gli1 及凋亡相關基因 Bax、Bcl-2 蛋白表達檢測 取凍存的大鼠左側卵巢，加入裂解液制備組織勻漿，采用BCA法測定蛋白樣品濃度定量。按照蛋白體積+PBS與蛋白上樣緩沖液4∶1的體積比例配制蛋白體系，充分混勻，95 ℃水浴鍋中加熱8 min 使蛋白變性。SDS-PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜上，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇轉印時間（220 mA，1～2 h）。5%TBST 牛奶溶液封閉1 h，加入GAPDH（1∶3 000）、Shh（1∶1 000）、Ptch1（1∶1 000）、Gli1（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 500）一抗，4 ℃過夜。沖洗后放入1∶5 000的二抗溶液中，沖洗后加化學發(fā)光試劑顯影，分析蛋白灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，均數(shù)比較前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布時多組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性時組間比較采用LSD 和SNK分析；計數(shù)資料用例表示，采用Fisher 確切概率法進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡狀態(tài)比較 見表1。

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡狀態(tài)對比（%，）

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡狀態(tài)對比（%，）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與補佳樂組比較，▲P＜0.01；與中藥低劑量比較，■P＜0.05，■■P＜0.01；與中藥高劑量組比較，□P＜0.01。

正常細胞比例81.80± 4.76 24.40± 8.45*37.30 ± 4.98*△△□45.68 ± 2.81*△△▲■□57.09 ± 8.54*△△▲34.80±12.57*△組別空白組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組補佳樂組n 6 6 6 6 6 6細胞碎片率0.57±0.32 0.84±0.25 0.88±0.34 0.89±0.29 0.98±0.63 0.62±0.35晚期凋亡率9.57± 3.61 56.60±10.32*42.56 ± 6.64*△29.96 ± 4.95*△△▲■■31.30 ± 8.09*△△▲■■41.26 ± 7.91*△早期凋亡率7.81± 4.55 21.90±10.21*22.14±12.97*□24.06 ± 6.55*□10.37 ± 4.86△△▲25.00±11.69*

2.2 各組大鼠卵泡超微化結構變化 空白組卵母細胞及顆粒細胞形態(tài)規(guī)則，細胞器結構正常，線粒體呈圓形或橢圓形，內質網(wǎng)成簇排列，高爾基復合體及溶酶體結構完整。模型對照組卵母細胞形態(tài)欠規(guī)則，細胞核固縮，顆粒細胞形態(tài)欠規(guī)則，見凋亡相，細胞器結構異常且數(shù)量偏少，線粒體基質疏松，偶見內質網(wǎng)及高爾基復合體，溶酶體數(shù)量增多。與模型對照組相比，中藥低劑量、補佳樂組卵母細胞及顆粒細胞形態(tài)欠規(guī)則，部分細胞見凋亡相，細胞器數(shù)量偏少，線粒體輕度水腫，內質網(wǎng)稀疏，溶酶體數(shù)量較模型組減少。中藥中劑量、高劑量組卵母細胞形態(tài)正常，細胞膜完整，基本接近空白組，顆粒細胞形態(tài)規(guī)則，細胞器數(shù)量較空白組減少，線粒體部分水腫，內質網(wǎng)及高爾基復合體減少；溶酶體數(shù)量較空白組增多。

2.3 各組大鼠卵巢組織Shh、Ptch1、Gli1 及Bax、 Bcl-2蛋白表達比較 見表2。

表2 各組卵巢組織Shh、Ptch1、Gli1及Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（）

表2 各組卵巢組織Shh、Ptch1、Gli1及Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與補佳樂組比較，▲P＜0.05；與中藥低劑量比較，■P＜0.05，■■P＜0.01。

組別空白組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組補佳樂組Bcl-2 1.00±0.00 0.29±0.17*0.43±0.19*△0.51 ± 0.15*△△0.57 ± 0.16*△△▲■0.41±0.11*△n 9 9 9 9 9 9 Shh 1.00±0.00 0.21±0.11*0.44 ± 0.22*△△0.57 ± 0.16*△△▲■■0.61 ± 0.17*△△▲■■0.41±0.13*△Ptch1 1.00±0.00 0.28±0.13*0.45 ± 0.14*△△0.51 ± 0.21*△△0.56 ± 0.19*△△0.43±0.15*△Gli1 1.00±0.00 0.27±0.11*0.41 ± 0.10*△△0.55 ± 0.17*△△▲■0.58 ± 0.14*△△▲■0.38±0.12*△Bax 1.00±0.00 1.86±0.49*1.51±0.32*△1.43 ± 0.31*△△1.34 ± 0.28*△△▲■1.59±0.24*△

3 討論

目前POI 的發(fā)生機制尚不明確，西醫(yī)主要從遺傳因素、醫(yī)源性因素、免疫因素、環(huán)境因素等方面進行研究。大量研究表明，卵泡顆粒細胞的過度調亡通過卵泡閉鎖的形式引起POI，而引起卵巢顆粒細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展機制十分復雜，內分泌紊亂、凋亡基因與表觀遺傳調控失常、免疫異常等相關因素均可能參與其中。常規(guī)激素補充治療可以建立正常的月經(jīng)周期，但無法改善卵子的質量及妊娠結局。2017 年發(fā)布的早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識指出，中藥可做為一種治療POI 的非激素藥物［8］。POI 屬于中醫(yī)學“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇，系七情內傷、生活失度及先天稟賦不足等原因引起的臟腑功能失調?！端貑枴ち?jié)藏象論》曰：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也?！薄夺t(yī)學正傳》記載：“月經(jīng)全賴腎水施化，腎水既乏，則經(jīng)血日以干涸。”因此，多數(shù)中醫(yī)學者認為腎虛是POI 發(fā)生的主要病機，補腎為其治療大法。

補腎養(yǎng)精顆粒是由本研究團隊負責人劉金星教授所創(chuàng)制，由四物湯、五子衍宗丸及二仙湯組方加減而成。方中菟絲子補腎益精，熟地黃補血養(yǎng)陰，填精益髓，共為君藥。枸杞子、覆盆子益肝腎明目，當歸、白芍、川芎與熟地黃合為四物湯，上述諸藥合用滋陰補血，養(yǎng)血填精，為臣藥。五味子可引氣入腎故補腎之力更強；車前子能泄腎濁而生精液，使補而不滯；淫羊藿補腎溫陽，取其陽中求陰之功，以增強補腎填精之效；炒知母瀉火堅陰，制約淫羊藿溫熱之性；制香附、枳殼行氣，益母草活血調經(jīng)；黨參健脾益氣，補益氣血生化之源，共為佐藥。川牛膝活血通經(jīng)，補肝腎，為使藥。諸藥合用，既能溫補先天腎氣以生精，又能培補后天脾胃以生血，使精血充足，天癸得養(yǎng)，胎孕可成。

研究顯示，在早期卵泡閉鎖過程中，卵母細胞首先發(fā)生凋亡；而在生長晚期的卵泡，顆粒細胞首先凋亡，誘導卵母細胞凋亡，觸發(fā)卵泡閉鎖。當大量卵泡以高于生理代謝速度閉鎖時，才可能發(fā)生POI，卵巢顆粒細胞的異常凋亡也因此成為POI發(fā)病的始動因素。謝敏等［9］在卵泡超微化結構的研究中發(fā)現(xiàn)，閉鎖卵泡中存在一系列凋亡形態(tài)的改變（包括核固縮、胞質出現(xiàn)空泡、形成凋亡小體等），而這些變化最先發(fā)生在顆粒細胞中。本研究通過流式細胞定量檢測發(fā)現(xiàn)，POI 大鼠卵巢顆粒凋亡率明顯增高；經(jīng)不同劑量的補腎養(yǎng)精顆粒干預后，均可以降低顆粒細胞晚期凋亡的發(fā)生率，而高劑量補腎養(yǎng)精粒還可以降低顆粒細胞早期凋亡的發(fā)生率，抑制染色體DNA 發(fā)生斷裂。透射電鏡下觀察POI大鼠卵泡超微化結構異常，而中藥中、高劑量組卵母細胞及顆粒細胞形態(tài)接近空白組，細胞器數(shù)量增多，細胞器結構改善或恢復正常，表明補腎養(yǎng)精顆粒可以改善卵泡超微化結構。

閉鎖卵泡的顆粒細胞死亡可能由幾個凋亡相關基因的蛋白質產物控制，Bcl-2家族中的多個成員在大鼠卵巢顆粒細胞中表達，通過拮抗卵泡膜細胞和顆粒細胞的凋亡，抑制卵母細胞凋亡，減少卵泡閉鎖，而Bax 通過拮抗Bcl-2 對細胞的保護作用而促進細胞凋亡［10］。本研究結果顯示，給予雷公藤多苷后，模型對照組大鼠卵巢顆粒細胞激活了促凋亡基因Bax，抑制抑凋亡基因Bcl-2表達；不同劑量的補腎養(yǎng)精顆粒均可下調Bax 蛋白表達、上調Bcl-2 蛋白表達，并且顆粒細胞凋亡率與凋亡基因的表達水平相一致，Bax 表達降低，Bcl-2 表達升高，則顆粒細胞凋亡率減少；反之，顆粒細胞凋亡率增多。這表明補腎養(yǎng)精顆粒可以通過下調Bax 表達、上調Bcl-2 表達，抑制顆粒細胞凋亡。

Hh 信號通路是一條參與生物細胞胚胎生長發(fā)育的重要通路，存在于哺乳動物的卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞中，它通過調節(jié)重要細胞因子和功能蛋白的表達，參與轉錄調節(jié)、遷移、增殖、基因表達、存活和凋亡等多種細胞的生物學行為［11］。在哺乳動物體內 Hh 蛋白家族主要包括 Ihh、Shh 及 Dhh3 種同源蛋白。Hh 信號通路的傳遞受靶細胞上蛋白受體復合物的調控，即Ptch 和Smo。哺乳動物的Ptch 基因有兩個同源蛋白，即 Ptch1 和 Ptch2，Ptch1 與 Hh 配體結合后可以激活經(jīng)典的Hh信號通路［12］。Gli基因是Hh 信號通路的轉錄因子，有三種蛋白亞型，分別是Gli1、Gli2 和 Gli3，其中，Gli1 是 Hh 信號通路的陽性轉錄因子，有較強的轉錄激活作用，是Hh 信號通路的靶基因［13］。Shh 信號通路是目前研究最成熟，也是在體內分布較為廣泛的一個信號通路，與卵巢顆粒細胞凋亡關系密切。當Shh蛋白與Ptch1結合后，解除了Ptch 對Smo 的抑制，Smo 可以引起下游陽性轉錄因子Gli1釋放并活化進入細胞核內，啟動Hh靶基因的轉錄和表達。Shh 信號通路在激活Gli 基因家族后，可以調控包括Bax、Bcl-2等靶基因的表達抑制卵巢顆粒細胞的凋亡［14-15］。本研究結果顯示正常生育期大鼠卵巢組織中有一定的Hh 信號活性，POI模型大鼠卵巢組織中Hh 信號通路的關鍵基因表達均明顯降低，不同劑量的補腎養(yǎng)精顆粒干預后各組卵巢Shh、Ptch1、Gli1 蛋白表達均顯著升高，表明補腎養(yǎng)精顆?？梢约せ頗h信號通路的表達，從而促進顆粒細胞的增值，抑制顆粒細胞凋亡。

綜上所述，補腎養(yǎng)精顆?？擅黠@抑制POI 模型大鼠的卵巢顆粒細胞凋亡，其機制可能與激活Hh信號通路，同時下調促凋亡基因Bax 表達、上調抑凋亡基因Bcl-2 表達有關。我們的研究為POI 發(fā)病機制以及治療提供新思路和新靶點，但Hh信號通路及其調節(jié)機制與POI 的關系還處于起步階段，仍需進一步深入研究。