潘翱，陳靜*，賴(lài)舒

（重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400050）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是獲得性甲狀腺功能減退的主要原因，占所有自身免疫性疾病的30%[1]。AIT的特征是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致甲狀腺濾泡破壞。在臨床實(shí)踐中，AIT的治療主要依賴(lài)于非特異性抗甲狀腺藥物、免疫抑制劑和抗炎劑，然而療效不佳和副作用明顯等缺點(diǎn)限制了這些藥物的臨床應(yīng)用[2]，因此，迫切需要新的治療方法。

考慮到中藥的療效、低副作用和低成本的特點(diǎn)，中藥是潛在的治療AIT的一種替代療法。柴胡皂苷A（saikosaponin A, SSa）來(lái)源于柴胡，具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫的作用[3]，可能也對(duì)AIT有治療作用。幾十年來(lái)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis, EAT）模型已被證明是研究AIT的理想模型，一直被用來(lái)模擬人類(lèi)AIT[4]。因此，本研究通過(guò)注射佐劑乳化的豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin, pTG）和攝入過(guò)量碘建立EAT大鼠模型，然后給予SSa干預(yù)，研究SSa對(duì)AIT的影響并分析其初步的機(jī)制。

材料和方法

1 試劑

SSa（HPLC≥98%）購(gòu)自成都普非德生物技術(shù)有限公司；pTG購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA）和弗氏不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant, FIA）購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；HE染色液和DAPI染色液（5 μg/mL）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；兔抗Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain containing protein 3, NLRP3）、兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC）、兔抗裂解胱天蛋白酶-1（Cleaved Caspase-1）（Ala317, p10）和兔抗白細(xì)胞介素‐1β（interleukin‐1β, IL‐1β）一抗購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗兔IgG-SAlexa Fluor 488購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶工作液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody, TgAb）、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody, TPOAb）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、游離三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine, T3）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor‐α, TNF‐α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等大鼠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組處理

24只6~7周齡雌性SD大鼠（體重180~200 g）購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（渝）2018-0003]。將大鼠置于特定的無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)，并隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、EAT組、EAT+SSa組，每組8只。根據(jù)文獻(xiàn)[5]所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)EAT大鼠模型，除對(duì)照組外，EAT+SSa組和EAT組的大鼠通過(guò)在多部位（背部、腹部、頸部和足墊部）皮下注射FCA乳化的pTG（100 μg/0.2 mL）進(jìn)行免疫，第2~6周每周多部位皮下注射注射FIA乳化的pTG（100 μg/0.2 mL）加強(qiáng)免疫一次，期間飲用含0.05%碘化鈉的飲用水；第7~10周每天腹腔注射20 mg/kg SSa[6]或等量生理鹽水。對(duì)照組在第1~6周每周皮下注射0.2 mL生理鹽水，第7~10周每天腹腔注射等量生理鹽水。

3 ELISA分析

給藥方案結(jié)束后，取次日空腹10 h的大鼠的尾靜脈血，并分離血清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，用ELISA法檢測(cè)血清中TgAb、TPOAb、TSH和T3的水平。

同時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉后并處死，收集甲狀腺組織。每只大鼠取0.1 g甲狀腺組織，用1 mL無(wú)菌生理鹽水勻漿后，收集勻漿液并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，用ELISA法檢測(cè)甲狀腺組織中TNF‐α和IL-6的水平。

4 HE染色

將甲狀腺組織用4%多聚甲醛固定后，包埋在石蠟中，然后制備4 μm厚的切片。切片脫蠟至水后，用HE對(duì)甲狀腺組織切片進(jìn)行染色，并按照Chen等[7]方法對(duì)EAT嚴(yán)重程度進(jìn)行定量評(píng)分，用1~5的等級(jí)評(píng)分來(lái)評(píng)估EAT的嚴(yán)重程度：1分，一個(gè)或幾個(gè)浸潤(rùn)病灶，覆蓋少于25%的腺體；2分，10-20個(gè)細(xì)胞浸潤(rùn)灶，覆蓋25%的腺體；3分，25%~50%的腺體被浸潤(rùn)；4分，50%~75%的腺體被浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞破壞；5分，甲狀腺腺體完全破壞。

5 免疫組織化學(xué)染色

取4 μm厚的石蠟包埋的甲狀腺組織切片，依次經(jīng)脫蠟、再水化、3% H2O2處理10 min后，將組織切片浸入檸檬酸緩沖液并在微波爐中90 ℃至98 ℃下加熱12 min來(lái)修復(fù)抗原。切片用10%山羊血清封閉30 min，然后用TNF‐α一抗（1:200）4℃孵育過(guò)夜，漂洗后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200）二抗，37 ℃孵育30 min；漂洗后加入鏈霉親和素-POD過(guò)氧化物酶（1:200）37 ℃孵育30 min。漂洗后進(jìn)行DAB顯色，然后用蘇木精復(fù)染。切片在在光學(xué)顯微鏡（BX53，OLYMPUS，日本）下觀察并拍照。

6 免疫熒光染色

取4 μm厚的石蠟包埋的甲狀腺組織切片，依次經(jīng)脫蠟、再水化、3% H2O2處理10 min后，抗原修復(fù)后，將切片與NLRP3一抗（1:500）在4 ℃孵育過(guò)夜，漂洗后，加入羊抗兔IgG-SAlexa Fluor 488（1:500）37 ℃避光孵育1 h。漂洗后，用DAPI復(fù)染并在熒光顯微鏡（TE2000-E，尼康，日本）下觀察并拍照。

7 Western blot

用RIPA提取甲狀腺組織中蛋白，然后用BCA法將蛋白定量后，取等量的蛋白（10 μL樣品中含30 μg蛋白）在10% SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上；用5%牛血清白蛋白封閉蛋白轉(zhuǎn)移膜30 min，并在4 ℃下與NLRP3（1:1000）、ASC（1:1000）、Cleaved Caspase-1（1:1000）和IL‐1β（1:1000）和GAPDH（1:5000）分別孵育過(guò)夜；TBST漂洗膜，室溫下與羊抗兔IgG-HRP（1:1000）孵育60 min；TBST漂洗膜，用化學(xué)發(fā)光底物試劑顯色并通過(guò)化學(xué)發(fā)光蛋白印跡成像儀（上海易孛特光電技術(shù)有限公司）成像并測(cè)定條帶光密度值。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并輸出統(tǒng)計(jì)柱狀圖。多組數(shù)據(jù)之間差異使用單向方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用Bonferroni事后檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SSa降低EAT大鼠的自身免疫性甲狀腺炎嚴(yán)重程度

HE染色顯示，對(duì)照組甲狀腺組織正常，甲狀腺濾泡較大且濾泡腔內(nèi)充滿(mǎn)膠質(zhì)，濾泡上皮和濾泡間未見(jiàn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)；EAT組表現(xiàn)為中重度甲狀腺炎，許多甲狀腺濾泡破壞、萎縮、濾泡上皮細(xì)胞崩解成碎屑聚集在濾泡腔，部分濾泡上皮細(xì)胞和濾泡間可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)變少，另外部分間質(zhì)間可見(jiàn)纖維組織增生，甲狀腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分顯著高于對(duì)照組；EAT+SSa組大鼠甲狀腺炎的嚴(yán)重程度評(píng)分較EAT組顯著降低，組織學(xué)損傷也得到一定的改善（包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，濾泡形態(tài)轉(zhuǎn)良，泡腔內(nèi)膠質(zhì)增多）（圖1）。

圖1 SSa減輕EAT大鼠自身免疫性甲狀腺炎的病理嚴(yán)重程度。A，HE染色觀察大鼠甲狀腺炎的組織學(xué)變化；B，甲狀腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：與Con組相比，###P<0.001；與Model組相比，**P<0.01；n=8Fig. 1 Alleviation effects of SSa on the severity of autoimmune thyroiditis in EAT rats. A, HE staining to observe the histological changes of rat thyroiditis; B, statistical analysis for severity score of thyroiditis. ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs Model group; n=8

2 SSa降低EAT大鼠血清TPOAb、TgAb和T3水平

ELISA檢測(cè)顯示：與甲狀腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，EAT組大鼠血清TPOAb、TgAb和T3顯著升高，EAT+SSa組大鼠血清TPOAb、TgAb、T3水平較EAT組顯著降低（圖2）。

圖2 SSa對(duì)EAT大鼠血清TPOAb（A）、TgAb（B）和T3（C）水平影響的ELISA檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與Con組相比，###P<0.001；與EAT組相比，**P<0.01；n=8Fig. 2 ELISA detection and statistical analysis for the effect of SSa on the levels of TPOAb (A), TgAb (B) and T3 (C) in the serum of the EAT rats.###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

3 SSa降低EAT大鼠甲狀腺組織中的炎性細(xì)胞因子水平

對(duì)甲狀腺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色顯示：對(duì)照組大鼠的甲狀腺組織無(wú)TNF‐α免疫反應(yīng)性；EAT組TNF‐α主要表達(dá)于濾泡上皮，呈強(qiáng)陽(yáng)性；EAT+SSa組大鼠甲狀腺組織中TNF‐α免疫反應(yīng)性強(qiáng)度和分布范圍均較EAT組明顯減少（圖3A）。ELISA分析顯示，EAT+SSa組大鼠的甲狀腺組織中TNF‐α和IL-6水平均顯著低于EAT組（圖3B）。

圖3 SSa對(duì)EAT大鼠甲狀腺組織中炎性因子表達(dá)的影響。A，甲狀腺組織中TNF‐α表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。B，甲狀腺組織中TNF‐α水平ELISA檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，甲狀腺組織中IL-6水平的ELISA檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Con組相比，###P<0.001；與EAT組相比，**P<0.01；n=8Fig. 3 Effect of SSa on the expression levels of inflammatory factors in the thyroid tissues of EAT rats. A, immunohistochemical examination of TNF‐α expression in the thyroid tissues; B，ELISA detection and statistical analysis for the TNF‐α level in rat thyroid tissues; C, ELISA detection and statistical analysis for the IL-6 level in rat thyroid tissues; ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

4 SSa抑制EAT大鼠甲狀腺NLRP3炎癥小體激活

免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)SSa對(duì)炎癥體激活的作用顯示：與對(duì)照組相比，EAT組大鼠甲狀腺中NLRP3的免疫染色信號(hào)增加，NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1和IL‐1β水平顯著升高，而EAT+SSa組上述蛋白表達(dá)顯著低于EAT組（圖4），表明提示EAT大鼠甲狀腺中NLRP3炎癥小體被激活，SSa能抑制EAT大鼠甲狀腺中NLRP3炎癥小體的激活。

圖4 SSa對(duì)EAT大鼠甲狀腺組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A，甲狀腺組織NLRP3免疫熒光染色代表性圖像。B，甲狀腺組織中NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1和IL‐1β表達(dá)水平的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；C—F，甲狀腺組織中NLRP3（C）、ASC（D）、Cleaved Caspase-1（E）和IL‐1β（F）相對(duì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Con組相比，###P<0.001；與EAT組相比，**P<0.01；n=8Fig. 4 Effect of SSa on the expression of NLRP3 inflammasome associated proteins in the thyroid tissues of the EAT rats. A, representative images of thyroid NLRP3 immunofluorescence staining; B, Western blotting to detect the expression levels of NLRP3, ASC, Cleaved Caspase‐1 and IL‐1β in the thyroid tissues; C to F, statistical analysis for the relative expression levels of NLRP3 (C), ASC (D), Cleaved Caspase‐1 (E) and IL‐1β (F) in the thyroid tissue. ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

討 論

AIT也稱(chēng)為橋本氏甲狀腺炎，是最常見(jiàn)的自身免疫疾病之一，是成人甲狀腺功能減退的頭號(hào)病因[1]。EAT模型已被證明是研究AIT的理想模型[4]。本研究通過(guò)皮下注射佐劑乳化的pTG聯(lián)合過(guò)量碘攝入建立EAT大鼠模型，證明了SSa能減輕EAT大鼠的甲狀腺濾泡損傷并降低血清中的TgAb、TPOAb、TSH和T3濃度，提示SSa在治療AIT的潛在有效性。

越來(lái)越多的研究顯示NLRP3炎癥小體在AIT的發(fā)病和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在AIT患者甲狀腺組織中中觀察到NLRP3、ASC、Caspase-1、IL‐1β和IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)[8,9]。過(guò)量碘攝入通過(guò)激活甲狀腺濾泡細(xì)胞中的NLRP3炎癥體而促進(jìn)AIT的發(fā)展[9]。一項(xiàng)研究探討了炎癥小體與AIT之間的聯(lián)系，并揭示了AIT患者甲狀腺組織中NLRP3和IL‐1β水平與血清TPOAb和TgAb水平呈正相關(guān)[10]。另外，已有研究表明下調(diào)NLRP3/Caspase-1通路可改善大鼠的EAT[11]。因此，本研究中關(guān)注NLRP3炎癥體的作用，發(fā)現(xiàn)EAT大鼠甲狀腺中NLRP3、ASC、Cleaved Caspase1和IL‐1β蛋白表達(dá)增加，提示NLRP3炎癥的激活，而SSa成功地逆轉(zhuǎn)了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)，反映出SSa在EAT中的有益效果至少部分歸因于抑制了甲狀腺中的NLRP3炎癥。

總之，目前的研究表明，SSa治療對(duì)EAT大鼠的自身免疫性甲狀腺炎有顯著的有益作用，這可能是由于其抑制了EAT大鼠甲狀腺腫NLRP3炎癥小體的激活。另外，本研究為SSa治療自身免疫性甲狀腺炎提供了臨床前證據(jù)。