房冉 ，孟飛龍 ，李高鵬 ，饒琳 ，趙小立 ，2*

（1.浙江大學生命科學學院，浙江杭州310058；2.浙江省細胞與基因工程重點實驗室，浙江杭州310058）

0 引 言

哺乳動物的聽覺感受器即螺旋器(又稱柯蒂氏器)中存在線性排列的內、外感覺毛細胞,在成熟的耳蝸管內,基底膜上的毛細胞被各種支持細胞包圍。內耳毛細胞作為感受器在聽覺發(fā)生中起重要作用,其中外毛細胞負責聲音的機械放大,增強感覺上皮對不同聲音頻率的響應能力,檢測低強度聲音;內毛細胞負責將聲音刺激傳遞給基底部的神經末梢[1],從而將傳到耳蝸的聲音刺激轉變成神經興奮,興奮又沿耳蝸神經傳到聽覺中樞,產生聽覺。但是由于毛細胞對外界刺激非常敏感,年齡、家族遺傳、噪聲、氨基糖苷類藥物等因素都會對毛細胞產生一定的影響,并有可能造成聽覺螺旋神經節(jié)損傷[2],導致聽力障礙或永久性感音神經性耳聾。耳聾已成為全球主要的健康問題之一,越來越多的人受其困擾。研究表明,哺乳動物包括人的毛細胞損傷引起的聽力損失是不可逆的,因為損傷的毛細胞無法自發(fā)再生[3],在鳥類、兩棲類、魚類中,毛細胞可通過支持細胞轉化或者重新進入細胞周期進行有絲分裂產生,并且這種再生機制可以貫穿機體生命的始終[4-7]。目前,對于哺乳動物感音神經性耳聾,只能通過助聽器、人工電子耳蝸、中耳移植等輔助手段進行治療,都未從根本上解決這一難題[8-9]。有研究表明,雖然毛細胞在成熟的哺乳動物體內不能廣泛再生,但在新生鼠螺旋器中的支持細胞具有直接轉分化為毛細胞的潛力[10-13],與鳥類、兩棲類不同的是,這一潛力在出生后的第一周就消失了[14-15]。所以,研究人員試圖從此入手,探究哺乳動物中內耳的發(fā)育調控機制及毛細胞的再生途徑,從根本上解決這一難題。

Math1(Mouse homolog of the drosophila gene atonal)基因編碼一種轉錄因子,在毛細胞分化及成熟過程中起關鍵作用,引發(fā)了研究人員越來越多的關注。Math1最先在果蠅中發(fā)現(xiàn),命名為Atonal,與小鼠中的Math1是同源基因,屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白家族。1999年,BERMINGHAM等首次報道了Math1是果蠅原神經基因Atonal的同源基因,在小鼠內耳感覺上皮中表達[16],Math1基因雜合缺陷的小鼠胚胎不能生成耳蝸和前庭毛細胞[17]。也有許多研究闡明,在體外或體內的耳蝸實驗中,Math1過表達會促使非感覺支持細胞形成不成熟的毛細胞[18-22],說明Math1在這一過程中起重要作用。

1 內耳發(fā)育過程與Math1表達

哺乳動物內耳起源于胚胎的外胚層,首先接近后腦的外胚層局部增厚形成聽基板,聽基板內陷形成聽窩,聽窩閉合后形成梨形的聽泡。其后聽泡脫離外胚層逐漸形成聽囊,聽囊繼續(xù)發(fā)育形成背側的前庭部和腹側的耳蝸部,前庭部分化為橢圓囊、半規(guī)管雛形和球囊雛形,耳蝸部分化為耳蝸管始基。接下來,前庭部的橢圓囊、半規(guī)管和球囊逐漸發(fā)育成熟,耳蝸上皮逐漸發(fā)育成感覺上皮,耳蝸繼續(xù)由底圈向頂圈發(fā)育成血管紋和原始螺旋器。哺乳動物的螺旋器主要由內、外毛細胞和支持細胞構成,內毛細胞由大上皮嵴發(fā)育而來,外毛細胞由小上皮嵴發(fā)育而來,內外毛細胞之間由支持細胞分隔開,并且內、外毛細胞也是由底圈向頂圈逐漸發(fā)育成熟(見圖1)。毛細胞和支持細胞由聽囊發(fā)育過程中的感覺前體細胞發(fā)育而來[23]。在最初的外胚層發(fā)育過程中,成纖維細胞生長因子(FGF)信號通路的激活與Wnt信號通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路間的相互拮抗,對外胚層的形成具有重要作用[24]。此外,在毛細胞的發(fā)育過程中,感覺前體細胞完成增殖后,開始向毛細胞和支持細胞兩種細胞類型分化,而分化命運則主要依賴于Math1的表達[25-26]。以小鼠為例,小鼠螺旋器由蝸管的原始感覺區(qū)域發(fā)育而來[27-28],胚胎12.5 d Math1最先在耳蝸基部表達;胚胎13.5～14.5 d,Math1在中基部的原始毛細胞中表達上調,此后,其表達沿原始感覺區(qū)域向頂部擴展,直至胚胎17.5 d,整個螺旋器發(fā)育完成[29]。Math1最初表達于所有的感覺細胞,但隨著發(fā)育分化的進程,Math1在毛細胞中持續(xù)表達,在支持細胞中的表達卻逐漸下調[25,30-31]。值得注意的是,在胚胎15～17.5 d,Math1對于分化后毛細胞的存活以及毛細胞纖毛束的形成非常重要[32-33]。在此之后,敲除Math1并不影響毛細胞的數(shù)量及機械傳感器通道的功能,但會導致毛細胞纖毛束形成出現(xiàn)缺陷或紊亂[32]。然而,Math1的表達從胚胎17.5 d后開始下降,出生后第6天降至幾乎無法檢測到Math1的水平[30],這可能就是哺乳動物內耳毛細胞損傷后再生能力受到限制的原因之一。研究表明,在哺乳動物中,當Math1不表達時,毛細胞不會發(fā)育,當過表達時,非感覺細胞也可以轉化為毛細胞[17,21,31]。當然,在整個內耳發(fā)育及毛細胞形成過程中,僅有Math1存在是不夠的,并且Math1的精確時空表達及表達量的維持,還需要上下游基因及其所形成的分子環(huán)境的共同調控。

圖1 內耳聽覺系統(tǒng)及耳蝸解剖示意圖Fig.1 The inner ear hearing system and cochlear anatomical diagrams

2 Math1調控內耳毛細胞發(fā)育

2.1 Math1及其相關信號通路調控內耳毛細胞發(fā)育

2.1.1 BMP信號通路

在毛細胞感覺前體細胞增殖過程中,BMP、FGF等信號通路發(fā)揮著重要作用。骨形成蛋白(BMP)屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族,其配體在許多動物物種的耳部發(fā)育中表達,包括前體感覺區(qū)域及感覺細胞[34-35]。BMP信號通路對感覺前體細胞及毛細胞的調控,主要是通過抑制Math1的表達來維持感覺祖細胞的未分化狀態(tài)[36]。通過分離的聽囊實驗發(fā)現(xiàn),在感覺前體細胞中,Bmp4抑制Math1的表達,相反,抑制Bmp4的活性能增強Math1表達及毛細胞的生成[36]。進一步研究表明,BMP信號通路對Math1的調控作用主要通過調節(jié)Ids基因的表達來實現(xiàn)(見圖2),Ids作為BMP信號的應答基因在毛細胞分化命運的決定中發(fā)揮重要作用[37-39]。Ids基因是與堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族(b-HLH)有關的分化抑制基因,IDS蛋白含有與其他保守b-HLH蛋白進行二聚體反應所需要的HLH保守結構域,但缺乏DNA結合結構域。由于b-HLH(如Math1)與DNA結合之前需要與其他廣泛表達的b-HLH結合形成功能性的異二聚體,然而IDS蛋白的競爭性結合,阻止了功能二聚體的形成,抑制了細胞分化的起始[40]。研究表明,Id1,Id2和Id3在耳蝸的蝸管中廣泛表達,并且在分化之前的耳蝸祖細胞中Ids與Math1重疊表達,在分化的毛細胞中卻特異地表達下調,但此階段的祖細胞中仍然持續(xù)表達Ids,并且抑制其向毛細胞分化[40]。在雞胚聽囊的前體感覺區(qū)域中Bmp4、Bmp7與Ids一同表達,并且在該區(qū)域內BMP激活的Smads磷酸化形式Smad1,5,8高水平表達。此外,增強BMP信號能夠誘導Id1-3的表達,進而抑制Math1功能的發(fā)揮,并且毛細胞的分化過程中Bmp4、Smad1,5,8以及Ids的表達水平都出現(xiàn)下調現(xiàn)象[39]。以上表明,BMP信號通路以及Ids的表達對毛細胞感覺前體細胞的維持及分化起重要作用。

圖2 BMP信號通路示意圖Fig.2 BMP signaling pathway所示內容為：BMP信號活化受體，磷酸化胞內蛋白，激活Ids基因的表達，從而抑制Math1功能二聚體的形成，維持細胞的未分化狀態(tài)。

2.1.2 FGF信號通路

成纖維生長因子(FGFs)信號通路通過7個受體酪氨酸激酶異構體發(fā)揮其功能(見圖3),在細胞生長、分化、運動和生存等方面發(fā)揮重要作用[41]。在整個內耳發(fā)育過程中,不僅調控早期聽囊的形成,還調控后期感覺毛細胞的形成。研究人員在對雞和斑馬魚的內耳研究中發(fā)現(xiàn),在最初的聽基板發(fā)育過程中,Fgf3單獨或Fgf3和Fgf8兩者功能的缺失都足以造成整個耳組織異常。在青蛙和雞中Fgf3或Fgf2過表達能夠促使聽囊的形成。在斑馬魚的聽基板和聽囊的發(fā)育過程中,Fgf3和Fgf8作為上游基因激活Math1的表達[42]。在小鼠胚胎14 d,抑制FGF信號通路能降低Math1基因的表達,并且影響毛細胞與支持細胞的形成。在Fgf2存在的情況下,許多神經營養(yǎng)因子(NGF,BDNF,NT-3)能夠促進Math1的表達[43]。此外,Fgf20也通過FGFR1(成纖維生長因子受體1)及激活轉錄因子PEA3和ERM間接激活Math1的表達[43-44],組織特異性敲除Fgfr1會導致毛細胞支持細胞的嚴重缺陷[44],具體作用機制尚待進一步研究。

圖3 FGF信號通路示意圖Fig.3 FGF signaling pathway所示內容為：FGF信號通路中，F(xiàn)GF20/FGFR1通過激活MEKERK通路，對Math1基因發(fā)揮正向調控作用。

2.1.3 Notch信號通路

Notch信號通路通過細胞間接觸依賴性作用方式發(fā)揮作用(見圖4)。其信號分子及其受體都是膜整合蛋白。信號轉導的啟動依賴于信號細胞的信號蛋白與相鄰應答細胞的受體蛋白的相互作用,激活的受體發(fā)生2次切割,釋放轉錄因子,調節(jié)下游靶基因的表達,從而決定細胞的分化方向。在決定毛細胞與支持細胞的分化命運方面,Notch信號通過抑制Math1的正常表達,阻斷感覺前體細胞向毛細胞分化,并最終分化為支持細胞。單獨敲除Notch信號配體Delta-like(Dl1)或Jagged 2,可導致感覺毛細胞顯著增加[45-46]。對于Notch信號通路對Math1的調控作用,相關研究表明,Math1在新生毛細胞中的選擇性上調決定毛細胞的最終分化結果,但這一說法遭到后人質疑,Math1最初可能在祖細胞中表達上調,隨著發(fā)育的成熟,最終在所有毛細胞和部分支持細胞中表達[30,47-48]。也就是說最終毛細胞結構的形成并不依賴于原始感覺域內特異表達Math1的陽性細胞,而是通過復雜的阻抑機制來抑制Math1在這些細胞中的表達,從而形成各種類型的支持細胞[49]。Hes和Hey家族作為b-HLH轉錄抑制因子,在機體發(fā)育過程中靠Notch信號通路發(fā)揮作用[50-52]。當前的模型研究顯示,在內耳發(fā)育過程中,一旦Math1在新生的毛細胞中表達,Notch信號通路就會刺激Hes/Hey在臨近前體感覺細胞中表達,從而使這些感覺前體細胞分化為支持細胞[30](見圖5),并且,Hes/Hey的表達對支持細胞的維持起重要作用[53-54]。近來,研究者對這一抑制機制做了進一步解釋,表明毛細胞與支持細胞的分化命運與Hes/Hey在Math1啟動子上高度保守位點的結合有關,并且確認了這一位點,在原始感覺域中,Hes/Hey結合在Math1啟動子上能及時抑制Math1的表達,最終向支持細胞方向分化。當解除這一抑制作用時,又能夠刺激Math1的表達[49]。

圖4 Notch信號通路示意圖Fig.4 Notch signaling pathway當信號細胞未與相鄰的效應細胞相互作用時，Notch蛋白存在于胞內；當效應細胞與信號細胞的配體Delta蛋白結合時，效應細胞的受體被蛋白酶切割，釋放Notch蛋白胞內結構域（NICD），后者入核并與核轉錄因子作用，激活轉錄。

2.1.4 Wnt-β-catenin信號通路

Wnt-β-catenin信號通路主要由Wnt信號分子及膜受體Frzzled和輔助受體LRP5/6組成,βcatenin作為轉錄調控蛋白,在胞質中的穩(wěn)定及核內的累積是Wnt信號發(fā)揮作用的關鍵(見圖6)。Wnt信號分子能促使β-catenin從胞質蛋白復合物中釋放出來,從而調控基因的表達。在內耳發(fā)育過程中,Wnt信號通路在前庭的形成及耳蝸發(fā)育中起調控作用。有研究表明,在耳蝸發(fā)育過程中,Wnt信號通路作為Math1及Sox2的上游基因發(fā)揮作用,并且在聽基板的發(fā)育過程中,Wnt信號的濃度決定聽基板形成的大小[55-57]。在耳蝸的早期發(fā)育過程中,Wnt信號通路在耳蝸前體感覺細胞中表達上調,并且通過制止Wnt信號通路的表達阻礙感覺前體細胞的形成[58]。SHI等[55]發(fā)現(xiàn),在神經前體細胞中,β-catenin與轉錄因子TCF/LEF以復合體的形式結合在Math1基因的增強子區(qū)域,并且起正向調控作用。這一結果也在后續(xù)研究中得到證明,并且體內與體外實驗均顯示,刺激Wnt信號的表達能增加Math1的表達,導致額外毛細胞的形成[58-59]。相反,抑制Wnt信號的表達會降低Math1的表達,繼而影響毛細胞的形成。最近有研究表明,Wnt信號通路和Math1對新生耳蝸毛細胞的生成和存活具有協(xié)同效應[60],并且Math1的過表達與β-catenin的激活相結合,既能促進細胞的增殖又能形成新的毛細胞,而且新生的毛細胞能夠存活到成年[60]。此外,一個單次跨膜蛋白Kremen1,也通過調控Wnt信號通路對毛細胞的分化命運產生影響。Kremen1作為DKK信號的受體蛋白,對Wnt信號通路起拮抗作用,當DKK信號與Kremen1蛋白結合形成復合體時會阻斷Wnt信號通路,最終導致β-catenin的表達下降,從而影響毛細胞的命運[61]。有研究表明,Kremen1過表達極大地抑制了毛細胞的發(fā)育,并且促使受影響的細胞發(fā)育為支持細胞,而降低Kremen1的表達水平則會導致細胞向毛細胞方向發(fā)育,推測可能是通過影響Wnt信號通路來實現(xiàn)的[62]。

圖5 Wnt和Notch信號通路在感覺前體細胞共同調控作用示意圖Fig.5 Wnt and Notch signaling pathways controlling cell fate choices in the prosensory cellsWnt信號通路促進Math1在新生毛細胞中表達，此時新生毛細胞作為信號細胞，激活效應細胞的Notch信號，Notch信號蛋白就會刺激Hes/Hey在臨近前體感覺細胞中表達，從而使得這些感覺前體細胞分化為支持細胞。

圖6 Wnt-β-catenin信號通路示意圖Fig.6 Wnt/β-catenin signaling pathway缺乏Wnt信號時，β-catenin與胞質蛋白復合物結合，以復合體的形式存在，不能發(fā)揮作用；當Wnt信號存在時，能激活一系列的磷酸化反應，致使β-catenin從蛋白復合體中解離出來，轉位到核內，與核內轉錄因子TCF結合靶基因激活轉錄。

上述信號通路之間相互作用,共同調控內耳的發(fā)育過程。在最初聽基板的發(fā)育過程中,Wnt和Notch信號通路共同決定聽囊向耳蝸或前庭系統(tǒng)分化的方向[57];并且共同參與調控毛細胞的形成以及感覺前體細胞的分化[12,31,58,63],此外,2個信號通路之間存在相互作用,有研究表明,Notch信號的受體調控Wnt信號通路中β-catenin的穩(wěn)定性,并且Notch信號的配體JAG1是Wnt信號的靶基因[64-66],在小鼠的聽基板中,β-catenin不足會抑制JAG1的表達。另外,Wnt信號通路一個非常重要的基因Dishevelled能與Notch信號受體的胞內區(qū)域結合,使其內化[67-68]。

2.2 Math1及其相關基因調控內耳毛細胞發(fā)育

Math1是毛細胞分化及維持過程中重要的分化基因,但是這一功能的發(fā)揮是在許多其他因子共同協(xié)調作用下完成的[69](見圖7)。轉錄因子如Sox2、PAX2、EYA1、GATA3等,先于 Math1表達,同時影響毛細胞的分化過程[70-72],而Math1同時調控下游上百個基因的表達。

圖7 小鼠內耳毛細胞發(fā)育的基因調控示意圖Fig.7 Genes regulation pattern in mice inner ear development

Sox2是高活性族-盒轉錄因子,屬于Sox蛋白家族的b1亞族[73]。Sox2是感覺前體細胞的標志基因,在感覺前體細胞中廣泛表達,并通過激活和上調Neurog1與Math1的表達來促進祖細胞向神經和感覺細胞方向發(fā)育[74]。有研究表明,感覺祖細胞晚期向毛細胞分化時需要Sox2的表達,并通過濃度依賴的分子間相互作用與Math1的3端增強子結合來刺激Math1表達[75],Sox2的下調將誘導神經和感覺祖細胞的分化[76]。在敲除Sox2的突變體時,即使在祖細胞完全成熟后的階段,Sox2的缺失也會影響毛細胞的發(fā)育、抑制新生毛細胞的正常分化,形成甚至導致毛細胞和支持細胞的丟失[75]。Sox2在內耳發(fā)育早期表達于前體細胞,隨著前體細胞發(fā)育為毛細胞和支持細胞,Sox2則僅限于支持細胞中表達[77]。由此表明,Sox2在感覺前體細胞發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用。

Gfi1是鋅指轉錄因子家族中GPS(Gfi1/PAG-3/SENS)家族的成員。在毛細胞的發(fā)育過程中,鋅指轉錄因子Gfi1對毛細胞的正常分化和成熟起重要作用。小鼠胚胎12.5 d時,Gfi1的mRNA在中樞神經系統(tǒng)、外周神經系統(tǒng)及許多感覺上皮都有表達,包括發(fā)育中的內耳上皮細胞。在后期的發(fā)育過程中,Gfi1的表達貫穿于內耳毛細胞及神經元的發(fā)育。并且在毛細胞中,Gfi1是Math1的下游目標基因[78]。有研究表明,在胚胎15.0 d時的內毛細胞及胚胎15.5 d的外毛細胞中,Math1和Gfi1兩種蛋白共同表達[79]。后來的轉錄組分析也證實它們在毛細胞分化后期共表達[80]。

在小鼠中,當Gfi1基因存在缺陷時,即使內耳毛細胞的形成不受影響,但前庭和耳蝸毛細胞仍然表現(xiàn)出雜亂無章的現(xiàn)象。此外,在Gfi1突變小鼠中,所有耳蝸毛細胞在出生前后都會以凋亡的方式缺失[78]。所以,Gfi1對毛細胞的存活起重要作用,在胚胎13.5～15.5 d,Math1活性對毛細胞的生存至關重要。推測可能是Math1通過調節(jié)Gfi1的表達來防止細胞死亡或者二者共同調節(jié)毛細胞的存活[81]。但具體的相互作用機制尚待進一步研究。

POU4F3,POU家族成員中的POU域4型轉錄因子3,也是毛細胞發(fā)育過程中的重要轉錄因子,在小鼠中,Pou4f3在內耳的耳蝸和前庭毛細胞中高表達,并且對毛細胞的最終分化及成熟至關重要[82-84]。在前庭的感覺上皮中,Pou4f3在胚胎12.5 d開始表達,在耳蝸中,Pou4f3在胚胎14.5 d開始表達,并且也是沿螺旋器由基底部向頂部逐漸表達[20,79,83]。在Pou4f3突變的小鼠中,Gfi1的表達也會受到影響,敲除Pou4f3不僅使毛細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出缺陷、畸形、缺乏纖毛結構、前庭毛細胞錯誤定位及毛細胞退化現(xiàn)象,而且導致前庭和耳蝸毛細胞凋亡[82-83,85]。但是Gfi1和Pou4f3單獨作用,不能起始毛細胞的分化,而這一過程中,Math1的作用是至關重要的[81]。Pou4f3作為Math1的下游基因,同樣受Math1的直接調控[86-87]。近來,MASUDA等[88]在轉基因小鼠中通過染色質免疫沉淀的方法得到,在POU4F3 5,端的近端保守域和遠端保守域存在著Math1,TFE2,GATA3,NMYC,ETS2和ETV4等轉錄因子的結合位點,并且Math1與其他轉錄因子共同作用于Pou4f3上游時比Math1單獨作用更能促進Pou4f3的表達。

Neurod1是bHLH轉錄因子家族中的一員,參與內耳感覺神經元的發(fā)育、小腦顆粒細胞的形成、視網膜神經節(jié)的形成等多種細胞分化過程的調節(jié)[89-91]。在內耳感覺神經元發(fā)育過程中,Neurod1基因調控螺旋神經節(jié)神經元前體細胞退出細胞分裂周期,開始向成熟感覺神經元分化。在內耳發(fā)育中,Neurod1作為Math1的下游基因,Math1基因表達的沉默會導致Neurod1基因表達的缺失[20],同時Neurod1對Math1的表達也存在負反饋調節(jié)作用,由于Math1存在自我調控回路,能刺激自身表達,而Neurod1以負反饋調節(jié)的方式使Math1的表達維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。有研究表明,在Neurod1基因敲除小鼠時,Math1會過度表達,并且使感覺神經元轉化成毛細胞[92]。與Neurod1類似,Neurog1也在聽囊發(fā)育的早期階段調控感覺神經元的分化,并與Neurod1存在相互調控關系。在內耳的球囊和橢圓囊發(fā)育過程中,神經發(fā)生與毛細胞形成在時間上存在一定的重疊,作為調控兩部位發(fā)育的關鍵基因,Neurog1與Math1相互拮抗共同促進內耳感覺神經元和感覺上皮的發(fā)生,Math1的缺失會導致曾表達Neurod1的感覺區(qū)域出現(xiàn)神經細胞過量及異常發(fā)生。同樣,降低Neurog1的表達量會使表達Math1的細胞增多,并且這種效應具有劑量敏感性[93]。

2.3 內耳毛細胞發(fā)育過程中Math1的表觀遺傳學調控

組蛋白修飾在基因沉默和發(fā)育調控過程中起至關重要的作用。5種組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4)殘基的磷酸化、乙?；?、泛素化、甲基化、腺苷酸化、ADP核糖基化等修飾作用之間既相互協(xié)同,又互相拮抗,共同調控基因的表達及機體的發(fā)育過程。Math1作為內耳毛細胞發(fā)育的關鍵基因,其時空表達同樣受組蛋白修飾的影響,尤其是組蛋白H3,如其第4位賴氨酸殘基的甲基化與基因激活相關,第9位與第27位賴氨酸殘基的甲基化與基因沉默相關[94]。有研究發(fā)現(xiàn),在小鼠胚胎干細胞中,三甲基化的H3K27(組蛋白H3第27位賴氨酸)在Math1啟動子區(qū)域富集,從而抑制Math1在該細胞中的表達。并且這些激活基因(H3K4me3)或抑制基因(H3K27me3)的二價表觀遺傳標記在內耳前體感覺細胞和新生支持細胞內的Math1基因座中都有出現(xiàn)[95]。近來,STOJANOVA等[29]利用μChIP技術和qPCR檢測流式純化的小鼠耳蝸感覺前體細胞,追蹤Math1在感覺上皮發(fā)育過程中的表觀遺傳變化,發(fā)現(xiàn)H3K4me3(組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化)/H3K27me3,H3K9ac(組蛋白H3賴氨酸9乙?；?和H3K9me3組蛋白修飾的動態(tài)變化,即從靜止到激活再到沉默的過程與Math1表達的起始及其后的表達沉默相關聯(lián)。在感覺前體細胞階段,組蛋白通過抑制Math1來維持其未分化狀態(tài),在毛細胞分化過程中,Math1的表達依賴于H3K27的甲基化及H3K9組蛋白的乙?；痆96],并且抑制組蛋白的乙?；€會造成螺旋器由基底圈向頂圈發(fā)育過程中Math1表達的受阻,同時影響毛細胞的分化形成。在毛細胞成熟階段,Math1的下調與組蛋白H3的去乙酰化及H3K9me3的富集有關。這種二價組蛋白修飾模式為毛細胞發(fā)育過程中Math1瞬時表達調控機制的研究提供了新的思路。

2.4 MicroRNA在內耳毛細胞發(fā)育過程中對Math1的表達調控

MicroRNA(miRNA)是由內源基因編碼,長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,在動植物中參與基因轉錄后表達調控。除了參與感覺器官的發(fā)育和成熟,還與腫瘤、神經、自我免疫缺陷等疾病的發(fā)生有關。目前,發(fā)現(xiàn)miR-183家族(miR-96、miR-182、miR-183)、miR-200a、miR-200b、miR-15a1、miR-18a、miR-124等 microRNA在內耳發(fā)育過程中都有表達。對miR-183家族在小鼠內耳、大腦、心臟及整個胚胎中表達狀況的研究發(fā)現(xiàn),與其他部位相比,miR-183家族在內耳中限制性表達[97]。此外,miR-96的種子區(qū)域突變,會造成人類非綜合征型耳聾[98]。在感覺神經元與毛細胞形成過程中,miR-183家族在Neurog1和Math1的下游發(fā)揮功能,并且在內耳中Math1的缺失會造成陽性表達miR-183的細胞消失。近來,EBEID等[99]通過全轉錄組實驗比較Math1和miR-183家族對多能干細胞及多能耳祖細胞的影響發(fā)現(xiàn),miR-183家族與Math1聯(lián)合表達不僅有利于毛細胞命運的決定,而且有利于其他毛細胞特異基因的表達。這種MicroRNA與Math1相結合的調控途徑為毛細胞再生及維持研究提供了新的思路。

3 Math1與毛細胞再生

在鳥類的基底乳頭中,通過2種不同的機制使毛細胞再生,即支持細胞可以增殖并分化成毛細胞,也可以進行重新編程轉分化為毛細胞[100]。這種轉分化可能是由基底乳頭受到損傷后Math1的表達被重新激活所致[101]。在斑馬魚的側線中,感覺細胞再生是通過支持細胞進行增殖,然后,其中一部分增殖的細胞分化成毛細胞的機制實現(xiàn)的[102]。近來有研究表明,Wnt信號通路在這一過程中起重要作用,激活Wnt信號的表達可促進增殖,抑制其表達會使進行分裂的細胞減少[103]。也有研究表明,Wnt只能促進支持細胞的增殖,但不能起始毛細胞再生。毛細胞再生需要Notch、FGF等信號通路發(fā)揮作用,這些通路成員的表達會在毛細胞死亡后立即出現(xiàn)下調現(xiàn)象[104]。Notch信號可以通過調節(jié)細胞周期抑制劑的表達來阻止細胞的增殖,從而降低支持細胞的活性,誘導其向毛細胞分化。研究人員利用γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號通路,可以增加損傷后的斑馬魚側線或雞耳蝸中的再生毛細胞數(shù)量[105-106]。

但成熟的哺乳動物聽覺感受器中的毛細胞損傷后不能自發(fā)再生。小鼠出生后毛細胞周圍的支持細胞轉變成毛細胞的能力就會下降,直至一周內消失。哺乳動物毛細胞的再生能力與鳥類等非哺乳動物存在巨大差異,是因哺乳動物支持細胞本來就不能增殖再生成毛細胞,還是因存在某種缺陷或者存在抑制再生信號,具體原因尚不明確。研究人員進一步研究發(fā)現(xiàn),如果將哺乳動物的支持細胞放在培養(yǎng)基中培養(yǎng),確實能夠增殖和分化成毛細胞,由此推測這是由于毛細胞創(chuàng)傷后體內存在抑制作用信號,從而影響其再生作用[13]。研究人員試圖利用鳥類等內耳再生機制實現(xiàn)哺乳動物中的毛細胞再生。Math1作為實現(xiàn)毛細胞再生的首選基因,已分別在小鼠的胚胎期、新生期、成年期的耳蝸中過表達,而在胚胎干細胞水平上的過表達也在不斷探索中[107-108],并且取得了不同的效果。與成年期相比,胚胎和新生期Math1的過表達能夠使更多的支持細胞分化成毛細胞,并且更好地恢復聽力[109]。但是,由于用來轉分化的支持細胞的數(shù)量有限,轉分化得到的毛細胞并不能達到完全成熟的狀態(tài),此外,支持細胞的轉分化受年齡的限制,單獨過表達Math1還不足以達到理想的效果,尚需其他信號通路或因子的共同調控[110]。

在哺乳動物前庭中,前庭毛細胞損傷會抑制Notch信號的表達,支持細胞能夠激活Math1基因的表達并且轉變?yōu)槌墒斓拿毎鸞111-113]。橢圓囊中的損傷會伴隨著Math1的上調及Notch信號靶基因Hes5的下調。眾多研究表明,在新生小鼠中,通過γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號通路能夠促進毛細胞再生。此外,在未受損的新生小鼠耳蝸中,抑制Notch信號通路也可以使支持細胞轉變成新生毛細胞[114-115]。由此說明哺乳動物存在像非哺乳動物中的毛細胞再生的潛力。雖然目前在哺乳動物耳蝸中還未能形成成熟的具有功能的毛細胞,但這些結果表明,Notch信號通路在支持細胞與毛細胞的分化中起關鍵作用,也為損傷毛細胞的再生提供了一種有效的研究思路。

Wnt信號通路可以通過促進細胞增殖以及Math1表達來促使毛細胞再生[63,116-117]。在這一過程中,Lgr5(富含亮氨酸重復序列G-蛋白偶聯(lián)受體5,Leucinerich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)發(fā)揮了重要作用,Lgr5作為Wnt信號的靶基因,在小鼠胚胎期的蝸管感覺前體細胞中廣泛表達,但出生后Lgr5的表達只限制在支持細胞[118]。CHAI等[63]假設Lgr5陽性細胞是Wnt響應的感覺前體細胞,將其從新生的轉基因小鼠(Lgr5-EGFP-CreERT2/+)中分離出來進行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)有新的感覺細胞形成并顯示特定的毛細胞標志基因(Myo7a,Calretinin,Parvalbumin,Myo6),而且表現(xiàn)出纖毛樣結構并表達F-actin和Espin等標志基因。在體內過表達β-catenin能夠促進耳蝸感覺上皮細胞的增殖,并且導致Lgr5陽性細胞在耳蝸感覺上皮上瞬時擴增。后來,SHI等[116]也證實維持βcatenin在新生動物支持細胞的穩(wěn)定能促進支持細胞的增殖及毛細胞的產生,并且,Wnt/β-catenin能促使Lgr5陽性細胞向毛細胞的祖細胞方向發(fā)育,以決定細胞的分化命運。

近來,許多研究表明,多個基因(Pou4f3,Gfi1,Math1)共同作用比單獨過表達Math1更能促進胚胎干細胞向毛細胞方向分化[119]。有研究表明,敲除p27Kip1基因同時過表達Math1基因克服年齡相關的衰退,能使成熟的鼠耳蝸在遭受損傷后其支持細胞轉化為毛細胞。但在新生小鼠中,一些受影響的細胞出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象,而且,轉化后的毛細胞不能進一步成熟,這一結果并不比Math1單獨過表達取得的效果好。p27在成熟的支持細胞中抑制Gata3的表達,然而Gata3能促進Math1調控的成熟支持細胞向毛細胞轉化。此外,Pou4f3表達上調同樣對Math1調控的支持細胞向毛細胞轉化起重要作用。雖然,單獨過表達Pou4f3或者Math1也足以引起成熟支持細胞中毛細胞特異基因的表達上調,但Math1基因與Pou4f3基因聯(lián)合的過表達能促進更多支持細胞轉化成毛細胞。在胚胎及新生小鼠的耳蝸中,將Math1與Tcf3,Gata3,Etv4,N-Myc或Ets2共表達比Math1單獨過表達能產生更多的毛細胞[120-121]。

4 結語與展望

內耳的發(fā)育是一個極其復雜的過程,在此過程中任何生物化學因素或者分子途徑的異常都會導致聽力損失或前庭功能紊亂,并且聽力受環(huán)境、遺傳等多種因素的影響,聽覺功能受損最常見的就是感覺神經障礙,每500個新生兒中就有一個患兒,此外,這種障礙對大部分老年人也有影響。與哺乳動物聽覺相關的感覺毛細胞,損傷后不可自發(fā)再生,一旦感覺細胞足量損傷或死亡,就會導致永久性感覺神經性耳聾。所以,闡明感覺毛細胞背后的損傷、修復及再生機制,對于臨床診斷和治療是至關重要的。近年來,研究人員已在內耳毛細胞的發(fā)育及再生方面取得了很大進展,包括發(fā)現(xiàn)調控毛細胞發(fā)育及分化的關鍵基因Math1,與Math1有關的BMP信號通路、FGF信號通路、Notch信號通路、Wnt-β-catenin信號通路,相關基因、表觀遺傳調控等都在毛細胞的發(fā)育及分化中起關鍵作用。應用基因、干細胞和分子療法以及基因編輯等技術來恢復聽覺功能取得了一定進展。但目前得到的毛細胞仍然是未成熟的,缺乏正常的毛束且未能表達成熟的毛細胞標志基因Prestin等,另外還會出現(xiàn)一些明顯的凋亡跡象。要想得到完整且具有功能的毛細胞,仍存在巨大挑戰(zhàn),各種生物化學因素以及分子途經會影響毛細胞的再生,此外,合適的定位、有序的排列、適當?shù)恼弦约白銐虻纳窠浿浼毎纫蛩?也會影響毛細胞正常功能的恢復,進而阻礙聽力功能的恢復。未來,有待發(fā)現(xiàn)更多與毛細胞發(fā)育及再生相關的基因,并且在基因、分子和干細胞水平上進一步研究聽力恢復機理。