羅 杰，趙靈芝，楊 曦，楊改玲，高 瑞，胡毓琛

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

金(Au)是一種貴金屬，在自然界中常以單質(zhì)存在，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于處理和制造、極高的抗腐蝕性等特點(diǎn)。當(dāng)其直徑降低到2 nm 時(shí)，被稱為金納米團(tuán)簇(Au nanoclusters，Au NCs)，簡(jiǎn)稱金簇。金簇是一種由幾個(gè)到幾十個(gè)金原子組成的納米材料，由于其直徑接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，如：斯托克位移大、光穩(wěn)定性好、和較長(zhǎng)的熒光壽命等。此外，金簇低毒性、生物相容性好，從而使其在生物成像和生物傳感領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)[1-4]。本文將對(duì)金簇與尺寸相關(guān)的發(fā)光原理、合成方法，以及金簇作為納米探針應(yīng)用于生物成像研究進(jìn)行綜述。

1 金簇與尺寸相關(guān)的發(fā)光原理

金屬的物理和化學(xué)性質(zhì)與其尺寸大小有著密切的聯(lián)系。大塊金是良好的光學(xué)反射器和導(dǎo)體，但是通常表現(xiàn)出非常微弱的發(fā)光，這是由于塊狀金屬的電子能級(jí)是連續(xù)的，從而導(dǎo)致沒有能量間隙以及有效的非輻射衰減造成的[5]。當(dāng)金的尺寸減小1～100 nm成為金納米粒子[6](Gold nanoparticles,Au NPs，簡(jiǎn)稱納米金)時(shí)，電子的運(yùn)動(dòng)受到納米粒子尺寸的限制，并且主要與表面發(fā)生相互作用。納米金由于表面等離子體共振效應(yīng)而呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的顏色，其光學(xué)特性來自于傳導(dǎo)電子與光相互作用后發(fā)生的集體振蕩。納米金通常具有較強(qiáng)的吸光性，但它們并不或僅表現(xiàn)出微弱的發(fā)光。如直徑為5～20 nm的納米金水溶液呈現(xiàn)酒紅色，其特征吸收波長(zhǎng)在520 nm左右，表現(xiàn)出微弱的熒光。當(dāng)金納米粒子尺寸繼續(xù)降低(約2 nm)，變成僅有幾個(gè)原子構(gòu)成的金納米團(tuán)簇[7]時(shí)，其連續(xù)能級(jí)譜帶分裂成離散能級(jí)，電子的集體振蕩受到阻礙，因而金簇不再引起表面離子體共振效應(yīng)，但電子仍在能級(jí)間躍遷與光相互作用，顯示出明亮的熒光。金簇的發(fā)光一般與電子躍遷有關(guān)：其一，在已占據(jù)的 d 軌道和費(fèi)米能級(jí)之間的電子躍遷；其二，最高占用軌道(HOMO)和最低占用軌道(LUMO)之間的電子躍遷[8]。不同尺寸的金簇具有不同的能級(jí)間隙，因而需要不同能量的激發(fā)光，從而得到不相同的熒光發(fā)射光譜。近期，關(guān)于金簇的熒光性質(zhì)與其尺寸和表面配體密切相關(guān)的報(bào)道顯示，通過改變它們的核心尺寸可使金簇的熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生改變，粒徑越大，發(fā)光光譜逐漸紅移。Dickson等[9]通過此法將金簇的熒光發(fā)射波長(zhǎng)從近紅外區(qū)域調(diào)整到紫外區(qū)域，他們制備出組成和其對(duì)應(yīng)熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為Au5(385 nm), Au8(455 nm), Au13(510 nm), Au23(760 nm), 和Au31(866 nm)的納米簇。與銅簇和銀簇相比，金簇的熒光強(qiáng)度十分穩(wěn)定，不易受環(huán)境中的還原劑和氧化劑等物質(zhì)的影響。這些優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)使金簇多次應(yīng)用于分析檢測(cè)和生物成像方面，為多個(gè)領(lǐng)域的開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用提供可行方案。

2 金簇的制備方法

貴金屬光致發(fā)光已被發(fā)現(xiàn)多年[10]，但由于量子產(chǎn)率極低(僅有10-10)，一直未引起人們的重視。近年來，研究人員開發(fā)了多種方法用來制備量子產(chǎn)率在10-3～10-1范圍內(nèi)具有熒光顯著增強(qiáng)的水溶性金簇，從而使其具有足夠的亮度用于熒光標(biāo)記應(yīng)用。一般情況下，通過將水溶液中金離子還原為零價(jià)金原子產(chǎn)生的是納米金而非金簇，這是由于金簇易聚集造成的。此外，用于覆蓋金簇表面的配體的性質(zhì)也顯著影響其發(fā)光性能。因此，選擇合適的穩(wěn)定劑能穩(wěn)定金簇防止其聚集并增強(qiáng)其熒光至關(guān)重要。通常使用一些配體作為模板對(duì)金簇進(jìn)行表面改性，這其中包括硫醇分子[11-14]、樹枝狀大分子[15-16]、聚合物[17]、DNA 寡核苷酸[18-19]、肽以及蛋白質(zhì)[20-22]等物質(zhì)。由于金簇的光學(xué)性質(zhì)與其尺寸有著密切關(guān)系，覆蓋在金簇表面的模板或配體不僅影響金簇的幾何形狀，還提供合適的條件以避免金簇聚集成大納米粒子從而改變結(jié)構(gòu)影響其熒光性能。因此，合成高量子產(chǎn)率的金納米團(tuán)簇，關(guān)鍵是選擇合適的模板或配體。所選模板或配體不僅要防止金納米簇團(tuán)聚，還要考慮到它們對(duì)金簇?zé)晒獾挠绊憽?/p>

3 金納米簇在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

近年來，生物兼容性好、小尺寸且發(fā)光性能好的金簇作為新型熒光探針多次應(yīng)用于細(xì)胞成像等方面。通過對(duì)其表面配體進(jìn)行修飾后可得到不同性能的金簇，在配體上連接具有靶向識(shí)別功能的分子后，金簇具有靶向檢測(cè)癌細(xì)胞且可應(yīng)用于癌細(xì)胞成像。例如，葉酸偶聯(lián)金簇已被廣泛應(yīng)用于葉酸過量表達(dá)的癌細(xì)胞成像。例如：Astilean等[23]采用葉酸功能化金簇對(duì)人類卵巢癌細(xì)胞靶向熒光成像；此外，Kong等[24]偶聯(lián)維生素B12到核糖核酸酶A穩(wěn)定的金簇，基于該納米探針，對(duì)人類結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞靶向成像。三苯基膦(TPP)是一種離域親脂陽離子，容易通過磷脂雙分子層并在活細(xì)胞線粒體中積累。因此偶聯(lián)TPP到殼聚糖穩(wěn)定的金簇可用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體成像[25]。Su等[26]基于RGD序列(由精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成)對(duì)富含整合素的腫瘤細(xì)胞具有較高的親和力，將其設(shè)計(jì)進(jìn)入多肽序列，并以此為模板合成的金簇可自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，該金簇復(fù)合材料發(fā)光增強(qiáng)了近70倍，具有21.3%的量子效率，同時(shí)RGD序列的存在可用于癌細(xì)胞靶向成像。Lin等[27]報(bào)道了硫辛酸保護(hù)的金簇，通過其表面的羧基將含氨基的鏈酶抗生素蛋白修飾于金簇表面，可用于標(biāo)記肝癌細(xì)胞。Ghosh的團(tuán)隊(duì)[28]報(bào)道了以苯硼酸和巰基丙酸作為配體合成金簇，由于苯硼酸和癌細(xì)胞表面的黏蛋白特異性識(shí)別，將其應(yīng)用于癌細(xì)胞選擇性成像。此外，以蛋白質(zhì)為模板制得的金簇可直接用于選擇性標(biāo)記被蛋白質(zhì)特異性識(shí)別的細(xì)胞。例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白功能化的金簇對(duì)過量表示轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞(如A549肺腫瘤細(xì)胞)具有高親和力[29]。

利用它們良好的細(xì)胞成像特性，金簇也被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中重要生理事件的成像。例如，一種通過包裹染料分子二氧化硅顆粒與金簇組裝的新型納米復(fù)合材料[30]，被用于活細(xì)胞中高活性氧(highly reactive oxygen Species，hROS，·OH, ClO-和 ONOO-) 成像。這種復(fù)合材料表現(xiàn)出單一波長(zhǎng)激發(fā)和雙波長(zhǎng)發(fā)射, 565 nm波長(zhǎng)發(fā)射的紅光來自于金簇,其可被存在hROS有效地猝滅；在435 nm波長(zhǎng)發(fā)射的藍(lán)光來自于二氧化硅納米粒子，其熒光發(fā)射不受hROS的影響,從而為熒光法實(shí)時(shí)反映細(xì)胞內(nèi)hROS提供一個(gè)內(nèi)部參考。該金簇納米復(fù)合材料載入細(xì)胞效率高，選擇性熒光猝滅，光穩(wěn)定性好可用于長(zhǎng)時(shí)間成像觀察，這些特性使該金簇復(fù)合材料可用于長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中hROS，顯示出監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)生理事件的巨大優(yōu)勢(shì)。

此外，將腫瘤細(xì)胞與氯金酸溶液共孵育，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高還原性物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)金簇的原位形成，原理如圖1所示。Wang等[31]原位形成金簇一方面最終集中在細(xì)胞核周圍，可提供精確的細(xì)胞成像。該現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生在非癌變的細(xì)胞里(如：人類胚胎肝細(xì)胞)，具有較高的選擇性。這種胞內(nèi)原位形成金簇?zé)o需外界注入納米粒子即可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特異性熒光自標(biāo)記；另一方面有研究指出[41]胞內(nèi)原位合成的金簇能顯著抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，從而有效抑制腫瘤的發(fā)展。這種簡(jiǎn)便有效的體內(nèi)腫瘤靶向治療技術(shù)，將有助于在未來的臨床應(yīng)用中有效治愈癌癥。

圖1 細(xì)胞內(nèi)原位合成金簇及其應(yīng)用于細(xì)胞成像 原理示意圖[31]Fig.1 Schematic illustration of in situ biosynthesis of gold nanoclusters in cells imaging[31]

4 金納米簇在活體成像中的應(yīng)用

與細(xì)胞系和體外成像研究相比，使用動(dòng)物模型的體內(nèi)成像面臨額外的挑戰(zhàn)。這是由于其復(fù)雜性增加，可見光通過生物組織與各種生物分子相互作用，從而導(dǎo)致透射光減少以及發(fā)光材料發(fā)生降解。生物組織在近紅外光范圍僅表現(xiàn)出微弱的吸收/散射和自發(fā)熒光，因而金簇的近紅外發(fā)光性能使它們作為新型造影劑多次用于活體腫瘤熒光成像。在早期的研究中，Wu等[32]第一次報(bào)道了近紅外發(fā)射牛血清蛋白修飾的金簇BSA-AuNCs用于體內(nèi)腫瘤成像。研究表明，這些BSA-AuNCs在腫瘤區(qū)域積累到高水平，表現(xiàn)高度的腫瘤靶向性，這歸結(jié)于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞通透性和保留性的差異。鑒于此，金簇被多次應(yīng)用于活體小鼠腫瘤組織成像研究。Sancey等[33]評(píng)價(jià)超小型金簇在光學(xué)圖像引導(dǎo)手術(shù)中的應(yīng)用潛力。他們合成了以兩性離子或聚乙二醇為配體包覆的金簇，對(duì)荷瘤小鼠靜脈注射金簇用于測(cè)定其藥代動(dòng)力學(xué)特性以及研究金簇在荷瘤小鼠身體的分布情況。研究情況表明，表面缺乏特異性靶向配體的金簇，細(xì)胞載入率低；但在體內(nèi)，靜脈注射后能快速到達(dá)腫瘤部位，說明金簇在影像引導(dǎo)腫瘤手術(shù)研究中十分有潛力。

多模態(tài)成像，即兩種或多種提供互補(bǔ)信息的成像模式的結(jié)合，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。因此，近年來基于金簇作為多模態(tài)成像探針應(yīng)用于體內(nèi)成像受到了廣泛的關(guān)注[34-36]。例如：甲狀腺癌作為最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)病率高，缺乏雙重模式精確診斷的成像方法。對(duì)于甲狀腺癌的雙模態(tài)熒光/計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)成像，Chen等[34]以牛血清白蛋白(BSA)和氯胺-T為原料合成碘化BSA-AuNCs復(fù)合材料，合成原理如圖2所示，并以此作為雙模態(tài)探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些碘化BSA-AuNCs不僅具有超小的體積和優(yōu)異的生物相容性，而且表現(xiàn)出優(yōu)良的熒光/CT成像特性。一方面它們的熒光發(fā)射光譜在近紅外區(qū)，能夠準(zhǔn)確和選擇性地顯示甲狀腺癌，該發(fā)光材料可分辨微小的甲狀腺癌，小到2～3 mm；在注射較長(zhǎng)時(shí)間后仍有熒光信號(hào)顯示，且腫瘤和其他組織的熒光對(duì)比，腫瘤細(xì)胞處的熒光逐漸加強(qiáng)，其他部位的熒光逐漸減弱。另外在CT成像方面，其性能可以與臨床CT造影劑相媲美。碘基制劑在吸收x射線方面是有效的，但它們的循環(huán)壽命很短，而且非特異性分布和潛在的腎臟毒性限制了它們的應(yīng)用。金比碘具有更高的x射線吸收系數(shù)，單位質(zhì)量的對(duì)比度約高2.7倍。因此，金簇的強(qiáng)x射線衰減使其成為多模態(tài)成像的良好選擇，有望成為一種應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的納米探針。

圖2 以牛血清白蛋白和氯胺-T為原料合成碘化 BSA-AuNCs復(fù)合材料并以此作為雙模態(tài)探針 用于活體熒光/CT成像示意圖Fig.2 Schematic illustration of the preparation of AuNCs@BSA-I and biological function for in vivo synergistic dual-modality fluorescence and CT imaging

熒光、CT和MR成像方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，與CT成像相比，磁共振MR成像具有較低的空間分辨率，但對(duì)軟組織有較高的敏感性。因此，一個(gè)探頭內(nèi)結(jié)合這三種方式可以幫助推進(jìn)傳統(tǒng)診斷，可準(zhǔn)確識(shí)別疾病部位，即多模態(tài)顯像劑比單模態(tài)顯像劑能提供更多的腫瘤信息，因此是腫瘤診斷的理想方法。Peng等[37]以釓離子(Gd3+)介導(dǎo)表面富有羧基的金簇自組裝成單分散球形納米顆粒，基于該納米材料可實(shí)現(xiàn)熒光/MR/CT三模態(tài)成像。由于金簇和釓離子的共存，形成的納米材料在近紅外熒光成像中熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，在CT成像中表現(xiàn)出高的X射線衰減，在磁共振成像中表現(xiàn)出合理的r1弛豫。金簇和釓離子復(fù)合材料在體內(nèi)外均具有良好的生物相容性,并對(duì)A549荷瘤小鼠也具有獨(dú)特的近紅外熒光/CT/MR成像能力。Xu等[38]以BSA-AuNCs和氧化釓的復(fù)合粒子作為三模態(tài)顯像劑。經(jīng)過葉酸修飾后，金簇可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并允許異種移植瘤的活體光學(xué)、MR和CT成像。通過三種方式的比較可以清楚了解到體內(nèi)腫瘤的構(gòu)造和相關(guān)信息，這一切均表明金簇在腫瘤和其他組織生物成像有良好的應(yīng)用前景，在腫瘤多模式臨床診斷中具有巨大的潛力。

5 結(jié) 語

金納米團(tuán)簇作為一類新型的發(fā)光納米材料，它們體積小、毒性低，具有良好的生物相容性和熒光特性，逐漸成熟的應(yīng)用于生物成像研究。隨著金納米團(tuán)簇在多領(lǐng)域應(yīng)用的深入，相關(guān)技術(shù)研究也面臨著較多的挑戰(zhàn)。其一，與半導(dǎo)體量子點(diǎn)和許多有機(jī)染料相比，目前報(bào)道的大多數(shù)金簇量子產(chǎn)率低，還不能夠滿足實(shí)際熒光檢測(cè)的需要；其二，金簇的光學(xué)性質(zhì)與其尺寸和分散性密切相關(guān)，而大多數(shù)金簇粗產(chǎn)品常表現(xiàn)出的粒度不均勻性，導(dǎo)致其光學(xué)性質(zhì)的巨大差異。在合成過程中很難做到有效精確調(diào)控金簇的組成、尺寸和分散性，進(jìn)而準(zhǔn)確調(diào)控金簇的熒光發(fā)射峰位置和發(fā)光強(qiáng)度。目前，金簇還未進(jìn)入大規(guī)模的投資使用，但是發(fā)展簡(jiǎn)單、綠色、低成本合成光學(xué)性能優(yōu)異的金簇，并以此為探針研究出更多快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法更能適應(yīng)當(dāng)代社會(huì)高效、快節(jié)奏的分析需求。近年來，研究者通過各種策略(包括化學(xué)共軛、靜電相互作用、自組裝、配體交換等作用)對(duì)金簇進(jìn)行修飾，以及將金簇與其他納米材料(包括碳納米材料、其他金屬簇、金屬氧化物、金屬有機(jī)框架化合物等)進(jìn)行復(fù)合，控制金簇的結(jié)構(gòu)、尺寸和分散性，從而提高金簇發(fā)光的量子產(chǎn)率。此外，通過其他材料與金簇復(fù)合可使其成為多功能光學(xué)探針，使金簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有更多發(fā)展和應(yīng)用潛力。