呂瑛,吳耀持,孫懿君,張峻峰,鄭明岳,康學智

(1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233;3.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院,上海 200336)

坐骨神經(jīng)痛是臨床常見病、多發(fā)病,是由多種原因引起的坐骨神經(jīng)炎癥、水腫從而產(chǎn)生沿坐骨神經(jīng)通路及其所分布區(qū)域疼痛的臨床癥狀群,全球患病率1.6%～43.0%[1]。常用的藥物緩解方法包括單獨口服阿片類藥物或非甾體抗炎藥物,或兩者合用,然而藥物治療可引發(fā)不可忽視的副作用[2]。此外,還可以對腰椎間盤患者實施椎間盤切除減壓術,但在單次或多次術后,仍有超過10%的人受到慢性頑固性疼痛困擾[3]。坐骨神經(jīng)痛漫長的治療過程會加重個人及家庭的多重壓力。因此,尋找毒副作用小且有效的治療方法極為重要,不但可以提高患者的生活質量,幫助其更好地投入生產(chǎn)工作,還可以減輕家庭和社會的經(jīng)濟負擔。

電針可以有效緩解坐骨神經(jīng)痛,經(jīng)過長期實踐,已在臨床中形成一套行之有效的治療方案,結合導氣手法則緩解疼痛效果更強[4],但其作用機制尚待進一步明確。諸多與疼痛相關的遞質都通過G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors, GPCRs)發(fā)揮作用[5]。GPCRs的敏感性提高與痛覺超敏有密切關系[6]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein coupled receptor kinase 2, GRK2)能夠結合被激活的GPCRs,使GRCRs脫敏從而減少其介導的疼痛過程發(fā)生[7]。本動物實驗研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI)大鼠模型,通過檢測各組大鼠不同時間點的機械縮足反射閾值(mechanic withdrawal threshold, MWT)及脊髓GRK2和炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)的水平,研究電針對CCI大鼠疼痛的影響及其相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性 SPF級 SD大鼠 25只,1月齡,體質量(220±20)g,購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部,許可證號為SCXK(滬)2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動物實驗室,室溫(22～24)℃、相對濕度50%～70%、12 h循環(huán)照明,正常供水喂食。開展動物實驗研究的實驗條件及操作技術符合實驗動物福利、倫理規(guī)范,倫理批件號為DWSY2020-0102。所有大鼠適應性飼養(yǎng) 1周后,隨機分為對照組、模型 1組、模型2組、電針組及導氣電針組,每組5只。

1.2 主要試劑及儀器

GRK2抗體(ABclonal生物科技有限公司,A4443)、TNF-α抗體(英國Abcam公司,Ab66579)、IL-10抗體(美國 SANTA CRUZ生物科技,SC-365858)、IL-1β抗體(Bioworld生物科技有限公司,BS6067)、β-Actin(美國ProteinTech集團有限公司,66009-1-Ig)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG(碧云天生物工程有限公司,A0208)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H＋L)(碧云天生物工程有限公司,A0216)、辣根過氧化物酶標記驢抗山羊 IgG(H＋L)(碧云天生物工程有限公司,A0181)。Semmes-Weinstein vonFrey BW806型機械刺痛測試包(Stoelting公司,美國)、BW8061型動物測試籠(含支架和金屬網(wǎng))(Stoelting公司,美國)、G6805-1A低頻電子脈沖治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司,中國)。

1.3 模型制備

除對照組外,其余組大鼠均接受 CCI模型制備[8]。采用 3%的戊巴比妥鈉溶液[40 mg/(kg·bw)]對大鼠行腹腔注射麻醉后取俯臥位捆綁。切開大鼠右后肢皮膚,分離肌肉,充分暴露右下肢坐骨神經(jīng)主干,采用3道結扎法[9],作3個間距1 mm的輕度結扎,結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動為度,注意避免損傷,隨后逐層縫合。對照組大鼠予以假手術,僅切開右后肢皮膚,分離肌肉,在找到坐骨神經(jīng)干后即逐層縫合。術后待大鼠蘇醒即放回籠中觀察。術后連續(xù)3 d予腹腔注射青霉素,每日40萬單位/只,防止傷口感染。

1.4 干預方法

造模后3 d導氣電針組予以導氣針刺法聯(lián)合電針干預,采用0.25 mm×40 mm一次性無菌針灸針,選擇大鼠患側(右側)L5～L6夾脊穴(平髂棘,L5～L6間脊椎旁開0.1寸)和環(huán)跳穴(俯臥固定,股骨大轉子與尾骨、髂骨結合部連線上,外1/3與內2/3的交點)[10-11]進行治療。進針后用拇、食指夾住針柄小幅度提插捻轉,而后中指側壓針身使針身彎曲成弓弩狀,將針體向上向前按壓行導氣針法1 min。后兩穴接G6805-1A低頻電子脈沖治療儀,2 Hz,連續(xù)波,1 mA。出針前再行導氣針法1 min。行針與留針總時長為 20 min,每日1次,連續(xù)治療5 d后休息2 d,共干預14次。電針組進針后不行針,直接接電針留針20 min,電針參數(shù)及療程同導氣電針組。

1.5 樣本采集

實驗過程中無死亡大鼠,樣本按照每組 5只采集分析。于干預4 d后處死模型1組,末次干預后處死其余4組。取大鼠L4～L6段脊髓,采用PBS緩沖液沖洗后,縱切平均分為2份,1份用于抽提RNA開展RT-PCR實驗,1份用于抽提蛋白進行Western blot實驗,均保存于-80 ℃冰箱。

1.6 觀察指標

1.6.1 MWT

采用von Frey細絲刺激大鼠后腿,記錄回縮時細絲的相應克數(shù),采用 up-and-down法[12]計算大鼠MWT。檢測時,用von Frey細絲穿過網(wǎng)格鼠架由下向上刺激大鼠右足中間部位,即L5神經(jīng)根的足底支配區(qū)域,避開感覺遲鈍的足墊區(qū)域,細絲彎曲略呈“S”狀時維持時間6～8 s,使其提供相對恒定的機械力,這個過程視為1次刺激。刺激過程中,大鼠走動或一刺激就抬足被視為可疑陽性,此次結果不算在正常結果內,需等大鼠安靜下來后再重新測量。相臨兩次刺激間隔時間≥6 s以避免前次刺激對本次痛閾測定結果產(chǎn)生影響。陽性結果記為○,陰性結果為記為×。檢測以10.0 g細絲為起始測量值,大鼠若沒有出現(xiàn)陽性反應,則繼續(xù)取相鄰一級更高強度細絲進行刺激,當在某一強度刺激過程中發(fā)生陽性反應時,則繼續(xù)取相鄰低一級的強度進行刺激。以這種方式重復進行,一直到第1次陽性、陰性反應交替出現(xiàn)時視為初始兩次反應,出現(xiàn)后再使用相同強度重復測定4次。若檢測力度大于60 g或小于2 g,該閾值則記為60 g或2 g。按照陽性反應、陰性反應順序根據(jù)機械縮足痛閾值計算公式為 50%縮足痛閾(paw withdrawal threshold, PWT)＝(10Xf＋kδ)/10 000計算出閾值。以PWT評價大鼠MWT。

1.6.2 脊髓GRK2 mRNA水平檢測

采用RT-PCR檢測脊髓GRK2 mRNA水平。取適量脊髓組織,加入 1 mL Trizol溶液進行勻漿,冰上操作,提取RNA。按照37 ℃、60 min;95 ℃、5 min;4 ℃、60 min的反轉錄程序得到cDNA,加入80 μL無酶水稀釋備用,-20 ℃保存。PCR擴增,每個樣品做3個重復對照,最終結果使用 2-ΔΔCt相對定量法測定目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各檢測指標引物序列

1.6.3 脊髓GRK2及IL-1β、TNF-α、IL-10蛋白表達水平

采用Western blot法檢測脊髓GRK2及IL-1β、TNF-α、IL-10蛋白表達水平。取適量脊髓組織,用冰PBS溶液洗滌3次。取適量RIPA裂解液,在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF溶液,比例為1:100。將組織吹打混勻,在4 ℃冰箱放置20 min左右。充分裂解后,11 000 rpm 4 ℃離心10 min,取上清液。進行蛋白質定量后,首先在80 V恒定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端。然后120 V恒定電壓電泳至溴酚藍剛出膠底部。350 mA轉膜 2 h,以進行免疫檢測。封閉時,將膜浸入到封閉液中,室溫下振蕩 1 h。加入稀釋好的一抗抗體,GRK2抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體、IL-10抗體稀釋比例均為1:1 000,β-Actin抗體稀釋比例為1:10 000,4 ℃過夜。TBST溶液洗膜3次。加入稀釋好的二抗抗體,1:1 000稀釋,室溫1 min振蕩孵育。TBST溶液洗膜3次后取出 ECL發(fā)光試劑,取發(fā)光試劑和過氧化物溶液按1:1混合成發(fā)光液。將膜放入熒光化學發(fā)光成像儀中,滴加發(fā)光液進行曝光。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料,用均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用ANOVA分析,多時間點MWT采用重復測量方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠MWT比較

CCI造模前,各組間 MWT比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療前與對照組比較,模型1組、模型2組、導氣電針組及電針組MWT顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。治療前和治療4 d后,模型1組與模型 2組 MWT比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療4 d后與對照組比較,模型1組、模型2組MWT顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與模型2組比較,導氣電針組MWT顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療 11 d后,與模型 2組比較,導氣電針組、電針組MWT顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。末次治療后,與模型2組比較,導氣電針組、電針組MWT顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),與電針組比較,導氣電針組MWT顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠MWT比較 (±s, g)

表2 各組大鼠MWT比較 (±s, g)

注:與對照組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型2組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與導氣電針組比較5)P＜0.01

組別 n 造模前 治療前 治療4 d后 治療11 d后 治療后對照組 5 106.78±16.02 100.50±18.84 104.79±33.97 92.54±27.16 103.37±31.53模型1組 5 94.23±14.99 52.13±5.751) 43.49±10.842) 0 0模型2組 5 98.03±18.65 55.50±6.821) 42.10±11.072) 29.43±6.70 27.84±5.52導氣電針組 5 105.01±22.29 55.39±5.711) 61.67±13.342)4) 60.40±11.013) 67.35±9.693)電針組 5 96.89±18.15 56.89±12.791) 55.78±9.452) 54.36±11.143) 48.81±6.033)5)

2.2 各組大鼠脊髓組織中GRK2 mRNA和蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型 1組及模型 2組脊髓GRK2 mRNA和蛋白均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型 2組比較,導氣電針組及電針組脊髓GRK2 mRNA和蛋白表達水平均顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。導氣電針組與電針組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見圖1至圖3。

圖1 各組大鼠脊髓組織中GRK2 mRNA水平比較

圖2 各組大鼠脊髓組織GRK2蛋白條帶圖

圖3 各組大鼠脊髓組織GRK2蛋白表達水平變化

2.3 各組大鼠脊髓組織 IL-1β、TNF-α、IL-10蛋白表達量比較

末次治療后與對照組比較,模型1組及模型2組脊髓IL-1β、TNF-α蛋白表達顯著上升(P＜0.05);與模型2組比較,導氣電針組及電針組脊髓TNF-α蛋白表達顯著下降(P＜0.01);與導氣電針組比較,電針組脊髓TNF-α蛋白表達顯著上升(P＜0.01);與模型2組比較,導氣電針組脊髓 IL-1β蛋白表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與導氣電針組比較,電針組脊髓IL-1β蛋白顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與對照組比較,模型1組及模型2組脊髓IL-10蛋白表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型 2組比較,導氣電針組脊髓IL-10蛋白顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與導氣電針組比較,電針組脊髓 IL-10蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖4和圖5。

圖4 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白條帶圖

圖5 各組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-10蛋白表達量比較

3 討論

有研究證實在經(jīng)典4道結扎法制備CCI模型基礎上改用3道結扎法,也可以制備出滿意的CCI模型,與4道法無顯著差異[13],為了盡可能保證影響因素的單一性,本實驗選擇3道結扎法的CCI模型觀察電針對坐骨神經(jīng)痛的影響。CCI大鼠坐骨神經(jīng)長時間受壓,病情類似梨狀肌綜合征一類神經(jīng)受壓致痛疾病,辨證為血瘀氣滯證,治以疏經(jīng)通絡、活血化瘀。取大鼠患側平髂棘L5～L6水平的夾脊穴和環(huán)跳穴治療。L5～L6夾脊穴位于腰部,用以緩解局部督脈和膀胱經(jīng)氣血不暢導致的疼痛癥狀,環(huán)跳穴可以疏風解痹、利腰腳痛,是治療坐骨神經(jīng)痛的要穴[14]。

導氣針法是《內經(jīng)》主要針法之一,《靈樞·五亂》中提及“徐入徐出,謂之導氣”,其目的在于“同精導氣”,即分辨逆亂的清濁營衛(wèi)之氣,引其歸位,傳導氣感,擴散療效。陰陽氣機調順歸位則陰陽協(xié)同作用,亂氣可除病可獲愈[15]。本實驗采用導氣手法以針向行氣法為主,欲氣上行則針尖向上刺,欲氣下行針尖向下刺,然后適度捻轉、提插以催氣。導氣針法以求更快更強烈地“氣至病所”,以達到“氣速至則病速愈”。以導氣針法聯(lián)合電針治療腰椎間盤突出癥能明顯緩解疼痛、麻木、酸脹等臨床癥狀,并且可以使病變部位肌張力得到顯著緩解,還能改善腰突癥術后患者頑固性腰痛[16-17],對腰腿痛者徐徐導氣有助于加快循經(jīng)感傳從而加速止痛[13],石向東等[18]發(fā)現(xiàn)導氣針法有效緩解了腰突癥下肢疼痛,童青等[19]發(fā)現(xiàn)在督脈穴位上施以導氣針法可以起到溫陽益腎、祛風通絡、散寒止痛的效果,導氣針法對腰腿痛治療效果明顯優(yōu)于電針治療。本實驗中,行導氣針法時觀察到大鼠出現(xiàn)強烈的舔舐、轉身、尖叫等反應,電針組大鼠此類反應則明顯弱化。

以往機制研究發(fā)現(xiàn)電針可以影響局部神經(jīng)性一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶 2、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、JAK激酶 2-信號傳導及轉錄激活因子 3(JAK kinase2-signal transduction and transcription activetor 3, JAK2-STAT3)信號通路[20-22]。上述部分炎癥因子及信號通路受到上游GRK2調節(jié),其機制是GRK2通過磷酸化胞內絲氨酸和蘇氨酸殘留致 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)與其 G蛋白失去偶聯(lián)來調節(jié)一系列同源 GPCR脫敏[23],此過程促進 GPCR與抑制素結合而后內化[24],失去介導下游多條細胞因子釋放通路,如MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路,從而起到保護細胞免受過度刺激的作用。通過對模型1組和模型2組變化趨勢的觀察,發(fā)現(xiàn)CCI大鼠造模后3周時間里MWT、GRK2 mRNA和蛋白表達水平、細胞因子 IL-10水平均顯著下降,而促炎因子IL-1β和TNF-α水平顯著提高,提示炎癥和痛敏狀態(tài)持續(xù),因此介入導氣電針療法是有意義的。TNF-α和 IL-1β是疼痛發(fā)生的機制之一[25-26],調節(jié)因子IL-10也參與疼痛產(chǎn)生的過程,其功能與IL-1β、TNF-α等拮抗,通過多種機制發(fā)揮減緩炎癥、促進神經(jīng)修復的作用[27]。實驗結果顯示,導氣電針和電針治療方法均可以顯著上調大鼠脊髓組織GRK2蛋白表達水平;與電針法比較,導氣電針法抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α水平和降低MWT的效果更好。電針法可以緩解CCI坐骨神經(jīng)痛和炎癥持續(xù)的趨勢,其機制與電針調節(jié)脊髓組織GRK2蛋白表達水平并降低細胞因子 IL-1β、TNF-α水平和提高IL-10水平有關。

PATIAL S等[28]發(fā)現(xiàn),在腹腔巨噬細胞GRK2減少95%的小鼠中,炎癥細胞因子反應增強。電針可以治療炎性疼痛,脊髓 GRK2可能是一個關鍵的分子靶點[29],靶向GRK2作為調節(jié)炎癥性疼痛的策略可能是治療臨床疼痛的一種有前景的干預措施。導氣電針組與電針組比較,GRK2蛋白水平變化未見顯著差異,而炎癥因子IL-1β和 TNF-α變化差異顯著,提示導氣針法還通過其他機制影響疼痛變化,有待進一步的研究。