劉新艷，王媛媛，劉娜娜，王 榮

(1.榆林市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 榆林 719000；2.榆林市第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，陜西 榆林 719000)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告中指出甲狀腺癌在全球癌癥發(fā)病率中排名第9位，占全年新診斷惡性腫瘤的3.0%，女性發(fā)病率高于男性3倍，但病死率低，僅為0.5/10萬(wàn)(女性)和0.3/10萬(wàn)(男性)[1]。甲狀腺癌也是中國(guó)發(fā)病率增長(zhǎng)速度最快的癌癥之一，2003—2011年，平均每年增加20%[2]。中國(guó)癌癥登記報(bào)告調(diào)查回顧性分析提示，2000—2015年中國(guó)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤發(fā)病率排名依次是乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、胃癌和宮頸癌[3]。2015年我國(guó)甲狀腺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為9.61/10萬(wàn)，而年齡標(biāo)準(zhǔn)化病死率為0.35/10萬(wàn)[4]。甲狀腺癌病理分型包括分化型甲狀腺癌(Differentiated thyroid carcinoma，DTC)、低分化甲狀腺癌(Poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)、未分化甲狀腺癌(Anaplastic thyroid cancer，ATC)及甲狀腺髓樣癌(Medullary thyroid carcinoma，MTC)。95%以上甲狀腺癌病理類(lèi)型是DTC，其臨床常用治療方法包括手術(shù)、放射性131I、TSH抑制等[5]。多數(shù)DTC患者臨床預(yù)后良好，但進(jìn)展性局部晚期或轉(zhuǎn)移性碘難治性DTC、PDTC、MTC及ATC患者臨床預(yù)后差，通常采取手術(shù)、外照射及全身治療。ATC是甲狀腺癌中侵襲性最強(qiáng)、致死率最高的病理類(lèi)型，患者平均生存期僅6個(gè)月，尚缺乏有效的治療手段[6-7]。

腫瘤代謝經(jīng)典的Warburg 效應(yīng)指腫瘤細(xì)胞即使在氧供充足的情況仍主要依賴糖酵解方式獲取能量，而非葡萄糖有氧氧化方式[8]，已證實(shí)結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌及甲狀腺癌中存在此現(xiàn)象，隨后葡萄糖代謝處于腫瘤代謝研究的核心地位。然而，并非所有的腫瘤均存在一致的Warburg 效應(yīng)，Hans Krebs 于1935年首次報(bào)道了谷氨酰胺(Glutamine，Gln)的代謝研究，隨后Gln在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中的作用被逐步揭示[9-10]。腫瘤細(xì)胞除糖代謝改變以外，其氨基酸代謝及脂代謝等其他能量代謝方式也發(fā)生了變化。Gln作為半必需氨基酸，對(duì)于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展至關(guān)重要，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)Gln具有一定的依賴性[11]。然而，Gln代謝在甲狀腺癌中的研究相對(duì)滯后，因此本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)探討Gln代謝對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞體外增殖的影響，期望為甲狀腺癌的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 本研究所用甲狀腺癌細(xì)胞系包括4株ATC細(xì)胞系(C643、IHH4、8505C和8305C)和2株甲狀腺乳頭狀癌(PTC)細(xì)胞系(K1和TPC-1)。除C643細(xì)胞系由上海瑞金雷燁博士饋贈(zèng)外，其余5株細(xì)胞系均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)海霞教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 胎牛血清(貨號(hào)：SH30088.03)購(gòu)于HyClone公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基(貨號(hào)：11875101)及無(wú)Gln RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：21870084)購(gòu)于Gibco公司；0.25%胰蛋白酶(貨號(hào)：C0201-100ml)、ATP濃度檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：S0026)與凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1062L)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；Gln(貨號(hào)：A100374)購(gòu)于上海生工生物。

1.3 甲狀腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 人甲狀腺癌細(xì)胞系C643、IHH4、8505C、8305C、K1和TPC-1常規(guī)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的甲狀腺癌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞增殖活性 人甲狀腺癌細(xì)胞系置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，常規(guī)消化細(xì)胞。全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按每孔細(xì)胞800個(gè)計(jì)算所需細(xì)胞總數(shù)。用排槍加至 96 孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用含不同濃度Gln(0、1、2 mmol/L)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0、1、2、3、4 d后各收1板，每孔加入MTT液20 μl，于培養(yǎng)箱孵育4 h后吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在搖床上低速振蕩15 min以使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度(OD)值，其中第3天時(shí)為最后2 d的96孔板重新補(bǔ)充不同濃度Gln培養(yǎng)基。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期甲狀腺癌細(xì)胞，常規(guī)消化，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按每孔1000個(gè)細(xì)胞計(jì)算所需細(xì)胞總數(shù)。將細(xì)胞種植于6孔板內(nèi)，輕吹使細(xì)胞均勻分布，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用不同濃度Gln(0、1、2 mmol/L)培養(yǎng)基處理細(xì)胞，每4 d更換1次培養(yǎng)基，10～14 d 后顯微鏡下觀察到克隆長(zhǎng)成但尚未連續(xù)成片狀、大小至肉眼可見(jiàn)時(shí)，棄去培養(yǎng)基， PBS洗滌2次，每孔加入1.5 ml甲醇固定15 min。隨后結(jié)晶紫染色，用流水洗去殘留的結(jié)晶紫，通風(fēng)干燥后拍照，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。

1.6 甲狀腺癌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期甲狀腺癌細(xì)胞，常規(guī)消化后分別予以不同濃度Gln(0、1、2 mmol/L)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，隨后消化6孔板細(xì)胞，留存培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含凋亡細(xì)胞)連同消化后細(xì)胞一起離心重懸，控制細(xì)胞總數(shù)在1×106個(gè)左右，每種處理設(shè)置3個(gè)副孔。通過(guò)凋亡檢測(cè)試劑盒內(nèi)的Annexin V-PI染料對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行冰上避光染色15 min，同時(shí)設(shè)置未染組和Annexin V、 PI兩個(gè)單染組作為對(duì)照組，染色完成的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)，加入0.5 ml經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾的PBS，上流式細(xì)胞儀分析，以488 nm波長(zhǎng)激發(fā)，經(jīng)515 nm濾光片過(guò)濾后檢測(cè)熒光素，用>600 nm濾光片檢測(cè)PI。應(yīng)用Flowjo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 甲狀腺癌細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)生產(chǎn)效能檢測(cè) 甲狀腺癌細(xì)胞予以不同濃度Gln(0、1、2 mmol/L)培養(yǎng)基處理24、48、72 h后常規(guī)消化6孔板細(xì)胞，利用ATP濃度檢測(cè)試劑盒中ATP檢測(cè)裂解液裂解細(xì)胞，催化螢光素產(chǎn)生螢光時(shí)需要ATP提供能量，從而用熒光分光光度計(jì)測(cè)定ATP濃度，用細(xì)胞總蛋白水平校正ATP濃度值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖活性的影響 見(jiàn)圖1。與含有Gln的培養(yǎng)基相比，不含Gln培養(yǎng)基培養(yǎng)的6株甲狀腺癌細(xì)胞增殖活性明顯降低(均P<0.05)。

圖1 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖活性的影響注：與Gln 0 mmol/L比較，*P<0.05，#P<0.01，▲P<0.001

2.2 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響 見(jiàn)圖2。與含有Gln的培養(yǎng)基相比，不含Gln培養(yǎng)基培養(yǎng)的6株甲狀腺癌細(xì)胞細(xì)胞平板克隆形成能力明顯降低(均P<0.05)。

圖2 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響注：圖A為6株甲狀腺癌細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色)；圖B中，與Gln 0 mmol/L比較，*P<0.05，#P<0.01，▲P<0.001

2.3 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)圖3。與含有Gln的培養(yǎng)基相比，不含Gln培養(yǎng)基培養(yǎng)的6株甲狀腺癌細(xì)胞凋亡明顯增加(均P<0.05)。

圖3 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響(Annexin V-PI染色)注：與Gln 0 mmol/L比較，*P<0.05，#P<0.01，▲P<0.001

2.4 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞ATP生成能力的影響 見(jiàn)圖4。與含有Gln的培養(yǎng)基相比，不含Gln培養(yǎng)基培養(yǎng)的6株甲狀腺癌細(xì)胞ATP生成能力明顯降低(均P<0.05)。

圖4 不同濃度Gln對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞產(chǎn)生ATP能力的影響注：與Gln 0 mmol/L比較，*P<0.05，#P<0.01，▲P<0.001

3 討 論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，也是中國(guó)發(fā)病率增長(zhǎng)速度較快的腫瘤之一，目前已成為我國(guó)女性第四大惡性腫瘤。雖然臨床多數(shù)甲狀腺癌預(yù)后良好，但轉(zhuǎn)移性或碘難治性甲狀腺癌以及低分化或未分化甲狀腺癌尚缺乏有效的治療手段，進(jìn)而導(dǎo)致患者臨床預(yù)后差，尤其是ATC患者1年生存率不足20%。甲狀腺癌致死率低，但發(fā)病率高，因此仍需探尋更為有效、安全的治療靶點(diǎn)和策略。

自腫瘤Warburg 效應(yīng)被揭示以來(lái)，葡萄糖一直處于腫瘤代謝研究的中心地位。Hans Krebs于1935年研究了動(dòng)物體內(nèi)Gln代謝，進(jìn)而掀起以Gln代謝為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究熱潮。Gln屬于非必需氨基酸，也是人體最豐富的氨基酸，占血液中游離氨基酸庫(kù)的20%以上，占肌肉中游離氨基酸庫(kù)的40%以上。人體Gln始終保持恒定水平，Gln分解代謝參與維持機(jī)體酸堿平衡及氨基酸代謝平衡。雖然Gln為機(jī)體非必需氨基酸，但在腫瘤細(xì)胞中則處于必需氨基酸地位。腫瘤細(xì)胞快速增殖需要消耗大量能量，Gln通過(guò)多種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)線粒體Gln酶水解為谷氨酸和氨離子，隨后谷氨酸經(jīng)過(guò)谷氨酸脫氫酶催化生成α-酮戊二酸(α-KG)，后者則進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)，最終產(chǎn)生ATP為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量。Gln代謝產(chǎn)生的碳用于氨基酸和脂肪酸的合成，而Gln代謝產(chǎn)生的氮直接用于嘌呤和嘧啶的從頭生物合成[12]。谷氨酸還與半胱氨酸、甘氨酸通過(guò)結(jié)合的方式生成谷胱甘肽(GSH)參與腫瘤細(xì)胞氧化還原反應(yīng)，直接抑制活性氧(ROS)合成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，GSH水平還與腫瘤的發(fā)生和耐藥性相關(guān)[13-14]。已有研究[15-16]證實(shí)，致癌基因突變上調(diào)腫瘤細(xì)胞Gln代謝，其中研究最多的是Myc致癌基因，Myc可以上調(diào)Gln轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLCIA5)，誘導(dǎo)Gln酶(GLS)在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，并在缺氧條件下促進(jìn)Gln回補(bǔ)TCA循環(huán)和誘導(dǎo)GSH的產(chǎn)生。研究[17]證實(shí)PIK3CA突變直腸癌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶2(GPT2)來(lái)提高Gln代謝，使PIK3CA突變直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)更加依賴Gln，提示靶向Gln代謝可能是治療PIK3CA突變型結(jié)直腸癌的一種有效方法。另外，谷氨酸還可通過(guò)多種途徑激活mTOR信號(hào)通路以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[18]。

已知部分腫瘤的發(fā)生進(jìn)展依賴于Gln，但Gln代謝是否參與了甲狀腺癌尤其是ATC的發(fā)生與發(fā)展仍不明確。研究[19]發(fā)現(xiàn)PTC細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于Gln，其次以Gln代謝為治療靶點(diǎn)的GLS抑制劑可以抑制PTC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等惡性行為，提示Gln代謝可能是PTC的潛在治療靶點(diǎn)。沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)4是Sirtuin家族成員，具有去乙?；富钚圆⒃谀芰看x中發(fā)揮作用，已有研究[20]證實(shí)SIRT4通過(guò)抑制Gln代謝進(jìn)而削弱甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。此次研究我們利用甲狀腺癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)甲狀腺癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)依賴Gln的供給，當(dāng)剝奪腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中Gln后會(huì)顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖活性、平板克隆形成能力，并顯著誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞發(fā)生凋亡。已知Gln為快速分裂的腫瘤提供能量、碳源及氮源，本研究將甲狀腺癌細(xì)胞置于不同濃度Gln培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～72 h，結(jié)果顯示剝奪腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中Gln后，ATP產(chǎn)生能力顯著降低，提示甲狀腺癌細(xì)胞的Gln依賴可能更多源于腫瘤所需能量不足。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)于Gln的依賴使其成為極具潛力的抗腫瘤治療靶點(diǎn)，以Gln代謝為目標(biāo)的化合物已被應(yīng)用于臨床前期實(shí)驗(yàn)并顯示出效果的有GLS抑制劑BPTES和CB-839，可分別抑制基因工程小鼠癌癥模型的生長(zhǎng)和三陰性乳腺癌的進(jìn)展[21-22]。腫瘤的異質(zhì)性、不同腫瘤的基因類(lèi)型和微環(huán)境對(duì)靶向治療提出了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，研究顯示靶向Gln代謝還可與其他藥物組合誘導(dǎo)腫瘤合成致死，如抗凋亡蛋白Bcl-2特異性抑制與GLS抑制協(xié)同作用可誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡及周期阻滯[23]。

綜上所述，甲狀腺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)依賴Gln，剝奪Gln后甲狀腺癌細(xì)胞體外增殖、平板克隆形成能力、ATP生成能力受到抑制，細(xì)胞凋亡增加，靶向Gln代謝可能成為甲狀腺癌尤其是未分化甲狀腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。