李曉濱，白建云，趙啟兵

(1.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院麻醉手術(shù)科，陜西 寶雞 721001；2.榆林市第三醫(yī)院麻醉科，陜西 榆林 719000；3.安康市人民醫(yī)院麻醉科，陜西 安康 725029)

一般情況下，缺血心肌組織經(jīng)血液再灌注后，其結(jié)構(gòu)和功能可得到恢復(fù)。缺血患者恢復(fù)血液灌注后的這種損傷程度與缺血持續(xù)時(shí)間、側(cè)支循環(huán)狀況、需氧量、再灌注狀況密切相關(guān)[1]，也可能與需氧自由基爆發(fā)、超負(fù)荷Ca2+、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和線粒體損傷等有關(guān)[2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種新型α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有高特異性，臨床上用于鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮，其呼吸抑制比其他鎮(zhèn)靜劑少得多，藥效也很快消失，不會(huì)讓患者昏昏欲睡[3]。研究[4]表明，Dex降低了術(shù)后心臟相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括心肌缺血再灌注損傷 (Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)和心律失常，顯示出心臟保護(hù)作用。研究[5]表明，心臟手術(shù)期間使用Dex與較低的術(shù)后病死率、較少的并發(fā)癥和心臟手術(shù)結(jié)果的改善相關(guān)。此外，動(dòng)物研究[6]表明，Dex預(yù)處理通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕MIRI。因此，Dex可能是治療MIRI的一種有前途的治療藥物。鑒于此，本研究探討Dex對MIRI大鼠的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠36只，體重200～260 g，購自陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司，許可證號：SYXK(陜)2018-010。所有大鼠均在(24±1)℃、14 h∶10 h光/暗循環(huán)(即每24 h光照14 h)下飼養(yǎng)，并自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑 Dex(國藥準(zhǔn)字H20110085)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑(批號：4464061)購自美國Thermo Fisher公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號：C0016)購自上海碧云天生物科技有限公司；Apo DETECT Annexin V-FITC試劑盒(批號：331200)、Ribo PureTMRNA純化試劑盒(批號：AM1924)購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 MIRI模型制備與分組處理 所有大鼠隨機(jī)分為對照組、MIRI模型組(MIRI組)和Dex治療組(MIRI+Dex組)，每組12只。MIRI組和MIRI+Dex組的24只大鼠用于建立MIRI模型：將大鼠麻醉后，于第5肋間剪開胸壁，逐層暴露心臟，在大鼠左耳下緣處用6-0縫合線穿入左冠狀動(dòng)脈前降支，深度約1.5 mm，平穩(wěn)后收緊結(jié)扎線，缺血30 min后再進(jìn)行灌注3 h。當(dāng)心電圖ST段顯示弓背向上抬高、心外膜顏色變成灰白色且出現(xiàn)充血、心肌呈紫色后迅速消失，表示建模成功。MIRI+Dex組大鼠腹腔注射50 mg/kg Dex，對照組和MIRI組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將實(shí)際大鼠心臟剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的組織塊，加入10 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%的胰蛋白酶消化8 min后靜置，棄上清。向上清液中加入30%體積DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)以終止消化作用，1200 r/min離心12 min后所得沉淀用約20 ml培養(yǎng)基輕輕吹散，200目孔徑鋼網(wǎng)過濾后移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁，55 min后取細(xì)胞懸液以1000 r/min離心10 min，所得沉淀用培養(yǎng)基(pH 7.2)輕輕吹散。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×108/L密度接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h。miR-146a模擬物(5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’)、miR-146a抑制劑(5’-AACCCAUGGAAUUCAGUU-CUCA-3’)和陰性對照(NC，5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’)由上海基因制藥合成公司提供，并根據(jù)制造商方案通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。

1.5 心肌細(xì)胞分組 為研究miR-146a在Dex對MIRI大鼠心肌細(xì)胞作用中的機(jī)制，將細(xì)胞分為NC組(對照組大鼠心肌細(xì)胞)、抑制劑組(對照組大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑)、MIRI+NC組(MIRI組大鼠心肌細(xì)胞)、MIRI+抑制劑組(MIRI組大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑)、Dex+MIRI+NC組(MIRI+Dex組大鼠心肌細(xì)胞)和Dex+MIRI+抑制劑組(MIRI+Dex組大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑)。為驗(yàn)證絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是否參與了Dex對MIRI損傷心肌細(xì)胞的作用機(jī)制，將心肌細(xì)胞分為對照組(僅用培養(yǎng)基處理大鼠心肌細(xì)胞)、SB組[p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制劑SB203580，大鼠心肌細(xì)胞用0.5 μmol/L SB預(yù)處理2 h]、MIRI組(MIRI組大鼠心肌細(xì)胞)、MIRI+SB組(MIRI組大鼠心肌細(xì)胞用0.5 μmol/L SB預(yù)處理2 h)、Dex+MIRI組(MIRI+Dex組大鼠心肌細(xì)胞)和Dex+MIRI+SB組(MIRI+Dex組大鼠心肌細(xì)胞用0.5 μmol/L SB預(yù)處理2 h)。

1.6 LDH、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平測定 培養(yǎng)24 h后，采用LDH檢測試劑盒、脂質(zhì)過氧化法測定LDH和SOD活性以及MDA水平。收集4.5×106個(gè)細(xì)胞，加入反應(yīng)混合物，在37 ℃下孵育，然后在最佳波長處測量光密度(OD)值，所有參數(shù)均根據(jù)協(xié)議設(shè)置。

1.7 細(xì)胞凋亡率和活性氧(ROS)水平評估 培養(yǎng)24 h后，使用Mito SOXTMRed測定ROS水平：收集每組4.5×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有0.5 ml完全磷酸鹽緩沖液的試管中，將試管在37 ℃下通過搖動(dòng)20 min進(jìn)行孵育，然后用0.5 ml完全磷酸鹽緩沖液(在37 ℃下預(yù)熱)洗滌細(xì)胞2次，再將細(xì)胞懸液加載到流式細(xì)胞儀上，檢測ROS水平。使用Apo DETECT Annexin V-FITC 試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率：收集4.5×106個(gè)細(xì)胞，加入195 μl Annexin-V結(jié)合溶液、6 μl Annexin-V和4 μl碘化丙啶，將細(xì)胞在25 ℃下進(jìn)一步培養(yǎng)20 min，加載到流式細(xì)胞儀上以檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)檢測目的基因 使用TRIzol提取心肌細(xì)胞總RNA。使用Ribo PureTMRNA純化試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA。反應(yīng)體系包含2×SYBER Green master mix 10 μl、cDNA模板1.5 μl、正向引物(10 μmol/L)1 μl、反向引物(10 μmol/L)1 μl和ddH2O 6.5 μl。擴(kuò)增程序設(shè)置為95 ℃ 2 min熱啟動(dòng)，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的3步PCR(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)。引物序列見表1。將mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin。目的基因包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、下游靶基因C/EBP家族同源蛋白(CHOP)、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、醌氧化還原酶1(NQO1)、過氧化氫酶(CAT)和miR-146a。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織miR-146a、氧化應(yīng)激指標(biāo)、ERS指標(biāo)及細(xì)胞活力與凋亡水平比較 見表2。MIRI組miR-146a水平、SOD活性和細(xì)胞活力低于對照組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、細(xì)胞凋亡率高于對照組(均P<0.05)。MIRI+Dex組miR-146a表達(dá)水平、SOD活性和細(xì)胞活力高于MIRI組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、細(xì)胞凋亡率低于MIRI組(均P<0.05)。推測Dex可能能夠提高miR-146a，并通過下調(diào)MIRI損傷的大鼠心肌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和ERS指標(biāo)，導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和細(xì)胞凋亡率降低。

表2 各組大鼠心肌組織miR-146a、氧化應(yīng)激指標(biāo)、ERS指標(biāo)及細(xì)胞活力與凋亡水平比較

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞miR-146a mRNA、ROS及細(xì)胞活力水平比較 見表3。抑制劑組和MIRI+NC組細(xì)胞活力和miR-146a mRNA相對表達(dá)量明顯低于NC組，Dex+MIRI+NC組細(xì)胞活力和miR-146a mRNA相對表達(dá)量高于Dex+MIRI+抑制劑組，而ROS水平表現(xiàn)出相反趨勢(均P<0.05)。表明Dex可能通過上調(diào)miR-146a表達(dá)來增加MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力，氧化應(yīng)激可能參與了這一機(jī)制。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞miR-146a mRNA、ROS及細(xì)胞活力水平比較

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達(dá)量比較 見表4。抑制劑組和MIRI+NC組GRP78、CHOP mRNA相對表達(dá)量高于NC組，MIRI+NC組低于MIRI+抑制劑組而高于Dex+MIRI+NC組，且Dex+MIRI+抑制劑組高于Dex+MIRI+NC組，而CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達(dá)量顯示出相反趨勢(均P<0.05)。說明Dex可以通過增加miR-146a表達(dá)來抑制MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞的ERS和氧化應(yīng)激，MAPK信號通路可能參與了這一機(jī)制。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 p38 MAPK信號通路抑制劑作用下各組大鼠心肌細(xì)胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較 見表5。MIRI組細(xì)胞活力低于對照組，但在MIRI+SB組和Dex+MIRI組中升高(均P<0.05)。MIRI組GRP78、CHOP mRNA相對表達(dá)量高于對照組，MIRI+SB和Dex+MIRI組則低于MIRI組(均P<0.05)。但Dex+MIRI+SB組GRP78 mRNA相對表達(dá)量低于Dex+MIRI組，CHOP mRNA相對表達(dá)量高于Dex+MIRI組(均P<0.05)。

表5 p38 MAPK信號通路抑制劑作用下各組大鼠心肌細(xì)胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 miR-146a抑制劑和SB預(yù)處理2 h后各組大鼠心肌細(xì)胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較 見表6。抑制劑組細(xì)胞活力低于NC組，而抑制劑+SB組細(xì)胞活力高于抑制劑組(均P<0.05)。抑制劑組CHOP、GRP78 mRNA相對表達(dá)量高于NC組和抑制劑+SB組(均P<0.05)。抑制劑+SB組GRP78、CHOP mRNA相對表達(dá)量低于抑制劑(均P<0.05)。由此可知，Dex可能會(huì)增加miR-146a表達(dá)并進(jìn)一步使MAPK信號通路失活，從而抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶活化和ERS，促進(jìn)MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力。

表6 miR-146a抑制劑和SB預(yù)處理2 h后各組大鼠心肌細(xì)胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

臨床將患者冠狀動(dòng)脈部分或者完全急性梗阻后于一定時(shí)間內(nèi)重新獲得再通時(shí)缺血心肌恢復(fù)正常灌注但其組織損傷出現(xiàn)加重的病理過程稱為心肌缺血后再灌注損傷。該疾病嚴(yán)重影響患者生命健康，甚至?xí)?dǎo)致其死亡，預(yù)防心肌缺血后再灌注損傷的發(fā)生是臨床一直致力解決的問題。本研究探究了Dex在MIRI損傷大鼠模型中的作用，進(jìn)一步揭示了miR-146a、ERS、氧化應(yīng)激和MAPK信號通路是關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，Dex可以通過這些調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞活力或凋亡。因此，在本研究中發(fā)現(xiàn)的機(jī)制可能是支持性證據(jù)，表明Dex在治療MIRI損傷中的有效性。

Gao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Dex可以防止MIRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和炎癥，從而提高細(xì)胞存活率。因此，Dex、miR-146a和細(xì)胞生長間可能存在聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，MIRI+Dex組細(xì)胞活力、SOD活性和miR-146a相對表達(dá)量高于MIRI組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP表達(dá)、細(xì)胞凋亡率均低于MIRI組。其中，SOD、MDA和LDH是評價(jià)抗氧化系統(tǒng)狀態(tài)的標(biāo)志物，而GRP78和CHOP被視為ERS指標(biāo)[8-9]。提示Dex可能會(huì)提高miR-146a，并通過下調(diào)MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和ERS，導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和細(xì)胞凋亡率降低。研究[10-12]表明，ERS參與了MIRI進(jìn)程，抑制ERS可以減輕MIRI對心肌細(xì)胞的損傷。還有報(bào)道稱ERS能夠引發(fā)氧化應(yīng)激并破壞線粒體功能，導(dǎo)致CHOP依賴性細(xì)胞死亡。研究[13-14]顯示，Dex通過抑制NLRC5缺陷小鼠炎癥和氧化應(yīng)激來防止肝臟缺血/再灌注損傷，通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來減輕對大鼠大腦的缺血/再灌注損傷。因此，可假設(shè)Dex可以提高miR-146a表達(dá)，從而下調(diào)ERS和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和細(xì)胞凋亡降低。據(jù)報(bào)道[15-16]，Dex通過α2-腎上腺素受體依賴性抑制氧化應(yīng)激來減輕原位肝移植引起的急性腸道損傷。因此，Dex可通過α2-腎上腺素受體刺激MAPK信號通路，從而減輕心肌細(xì)胞的MIRI損傷。此外，通過探討Dex對MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞在抑制miR-146a后的影響發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力和miR-146a、CAT、MnSOD和NQO1的表達(dá)降低，而細(xì)胞凋亡率、使用miR-146a 抑制劑和Dex后的ROS水平、GRP78和CHOP表達(dá)增加，表明miR-146a在Dex對細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和ERS的影響中起關(guān)鍵作用[17-18]。在MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞中使用SB與Dex組合不會(huì)增加細(xì)胞活力，但會(huì)進(jìn)一步降低Dex降低的GRP78和CHOP表達(dá)。將SB與miR-146a抑制劑一起使用能夠增加被miR-146a抑制劑降低的細(xì)胞活力，并且在心肌細(xì)胞中GRP78和CHOP表達(dá)被miR-146a抑制劑降低。鑒于這些事實(shí)，推測Dex可以通過miR-146a影響ERS，從而影響細(xì)胞活力，這在一定程度上依賴于MAPK信號通路。

綜上所述，Dex可能通過調(diào)節(jié)miR-146a表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)ERS和氧化應(yīng)激，最終通過MAPK信號通路影響MIRI損傷大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力和凋亡。然而，這項(xiàng)研究存在一定局限性，由于α2-腎上腺素受體在心室肌細(xì)胞中表達(dá)不高，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)之前檢測心肌細(xì)胞中α2-腎上腺素受體表達(dá)可使研究更有說服力。Dex是一種新型的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，膜內(nèi)受體表達(dá)的改變會(huì)影響Dex的作用，因此應(yīng)進(jìn)一步探討MIRI損傷后受體表達(dá)的變化[19]。此外，SB部分逆轉(zhuǎn)了miR-146a抑制劑對細(xì)胞活性、GRP78和CHOP的影響[20]。