欒彥軍，王 磊，賈 戊

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 延安 716000；2.商洛市中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 商洛 726000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨損害為主，并累及整個關(guān)節(jié)組織的常見關(guān)節(jié)疾病，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、缺損以及整個關(guān)節(jié)面的損害[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎患者臨床上主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、肥大和活動受限，好發(fā)于膝、髖、頸椎和腰椎等負(fù)重關(guān)節(jié)，以及遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)、近端指間關(guān)節(jié)、第1腕掌關(guān)節(jié)和第1跖趾關(guān)節(jié)。目前，OA是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致患者殘疾的主要疾病之一，并且隨著人口老齡化進(jìn)程的不斷加深，OA發(fā)病率逐年增加，這會給社會和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來巨大的負(fù)擔(dān)[3-4]。

OA的治療一般包括藥物治療和非藥物治療。藥物治療主要是通過使用鎮(zhèn)痛藥、非甾體抗炎藥、選擇性COX-2抑制劑、透明質(zhì)酸鈉、硫酸氨基葡萄糖、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑或聯(lián)合用藥，來減輕關(guān)節(jié)疼痛，延緩病情進(jìn)展。非藥物治療主要有中醫(yī)推拿針灸、運動治療、正骨治療以及物理電脈沖治療[5-6]。然而，無論是藥物治療還是非藥物治療，都只能緩解OA患者臨床癥狀，延緩病情進(jìn)展，而無法治愈。因此，尋找OA治療新方案、新藥物對提高OA患者生活質(zhì)量意義重大。桃葉珊瑚苷是一種提取自杜仲、車前草、地黃等中藥材的生物活性物質(zhì)，具有清熱利尿、鎮(zhèn)痛、降壓、保護(hù)肝臟、抗腫瘤等作用[7]。然而，目前關(guān)于桃葉珊瑚苷對OA治療作用的研究鮮有報道。鑒于此，本研究探討桃葉珊瑚苷在體外對白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡和對OA小鼠疾病進(jìn)展的影響，為桃葉珊瑚苷用于治療OA奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實驗動物 小鼠軟骨細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。30只雄性C57小鼠(8～10周齡，20～24 g)購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2022-0059。實驗動物飼養(yǎng)在12 h白天環(huán)境中，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器 MTT細(xì)胞活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：ST316、C1062S、C1091)均購自碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒(批號：DP421)購自北京天根生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自Bio-Rad公司；Bax和Bcl-2抗體(批號：ab32503、ab182858)均購自英國Abcam公司；IL-1β和桃葉珊瑚苷(批號：SRP8033、55561)均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 小鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。將小鼠軟骨細(xì)胞分為對照組、IL-1β組和IL-1β+AC組。①對照組：小鼠軟骨細(xì)胞正常培養(yǎng)36 h。②IL-1β組：小鼠軟骨細(xì)胞正常培養(yǎng)12 h后，加入10 μg/L IL-1β培養(yǎng)24 h。③IL-1β+AC組：小鼠軟骨細(xì)胞加入100 μmol/L桃葉珊瑚苷處理12 h后，加入10 μg/L IL-1β培養(yǎng)24 h。

1.4 OA小鼠模型制備與分組 30只C57小鼠被隨機(jī)分為正常組、模型組和AC組。模型組和AC組小鼠通過手術(shù)切除小鼠板股韌帶及內(nèi)側(cè)半月板前角制備OA模型，正常組僅切開皮膚。AC組小鼠在OA模型制備成功后，每日給予桃葉珊瑚苷80 mg/kg進(jìn)行灌胃治療，共6周，正常組和模型組灌胃同等劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 細(xì)胞活性或凋亡檢測 對照組、IL-1β組和IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞被不同方法處理后，吸出全部細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗滌2次后再加入20 μl 0.5% MTT溶液培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔光密度值。此外，三組軟骨細(xì)胞被不同方案處理后，收集細(xì)胞使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax和Bcl-2)表達(dá)檢測 對照組、IL-1β組和IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞被不同方法處理后，收集細(xì)胞，使用細(xì)胞RNA提取試劑盒提起組織總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR參數(shù)：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：根據(jù)2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。各基因PCR引物見表1。

表1 各基因引物序列

1.7 炎癥因子含量檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組軟骨細(xì)胞和OA小鼠的炎癥細(xì)胞因子含量，包括腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6、前列腺素E2(PGE2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)。

1.8 OA小鼠病情評估 桃葉珊瑚苷治療6周后，安樂死所有小鼠，分離小鼠膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行HE染色，然后參考國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(OARSI)評分標(biāo)準(zhǔn)對OA小鼠病情進(jìn)行評估。此外，通過小動物計算機(jī)斷層掃描技術(shù)對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描分析，計算OA小鼠軟骨下骨骨量，并通過TUNEL組織細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測軟骨組織細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 三組軟骨細(xì)胞活性及凋亡情況比較 見圖1。使用MTT法檢測各組軟骨細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：與未經(jīng)任何處理的對照組軟骨細(xì)胞相比，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)24 h的軟骨細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)；經(jīng)桃葉珊瑚苷預(yù)治療12 h的軟骨細(xì)胞，在IL-1β誘導(dǎo)后其細(xì)胞活性高于IL-1β組(P<0.05)。使用流式細(xì)胞儀檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：與對照組相比，IL-1β組和IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增高(均P<0.05)，并且IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著低于IL-1β組(P<0.05)。

圖1 三組軟骨細(xì)胞活性(A)及凋亡(B)情況比較注：與對照組比較，*P<0.05；與IL-1β組比較，#P<0.05

2.2 三組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較 見表2。使用RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，IL-1β組和IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA表達(dá)顯著升高，而Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA表達(dá)顯著降低，而Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。

表2 三組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較

2.3 三組軟骨細(xì)胞炎癥因子含量比較 見圖2。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組軟骨細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示：與對照組相比，IL-1β組和IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6、PGE2和MMP-3含量顯著升高，且IL-1β+AC組軟骨細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6、PGE2和MMP-3含量顯著低于IL-1β組(均P<0.05)。

圖2 三組軟骨細(xì)胞炎癥因子TNF-α(A)、IL-6(B)、PGE2(C)和MMP-3(D)含量比較注：與對照組比較，*P<0.05；與IL-1β組比較，#P<0.05

2.4 三組OA小鼠病情比較 見圖3。與正常組小鼠相比，模型組和AC組小鼠軟骨OARSI評分、軟骨下骨骨量及軟骨組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著升高，且AC組小鼠軟骨OARSI評分、軟骨下骨骨量與軟骨組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組(均P<0.05)。

圖3 三組OA小鼠OARSI評分(A)、軟骨下骨骨量(B)和軟骨組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率(C)比較注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.5 三組OA小鼠血清炎癥因子含量比較 見圖4。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組OA小鼠血清炎癥細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組和AC組血清TNF-α、IL-6、PGE2和MMP-3含量顯著升高，且AC組血清TNF-α、IL-6、PGE2和MMP-3含量顯著低于模型組(均P<0.05)。

圖4 三組OA小鼠血清炎癥因子TNF-α(A)、IL-6(B)、PGE2(C)和MMP-3(D)含量比較注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

OA是一種復(fù)雜的多因素關(guān)節(jié)疾病，影響所有關(guān)節(jié)組織[8-9]。盡管由于缺乏明確定義的診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前關(guān)于OA流行病學(xué)的研究報道較少，但在全球范圍內(nèi)癥狀性手骨關(guān)節(jié)炎的患病率約3%～16%[10]。根據(jù)國家健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查數(shù)據(jù)庫的研究數(shù)據(jù)，我國有癥狀的膝關(guān)節(jié)OA患病率約8.1%，且女性高于男性，西南地區(qū)和西北地區(qū)發(fā)病率高于華北地區(qū)和東部沿海地區(qū)[11]。據(jù)統(tǒng)計，我國50歲以上人群中半數(shù)患OA，65歲以上人群中90%女性和80%男性患OA，嚴(yán)重的OA患者壽命被縮短10～15年[11]。然而，目前尚無治愈OA的藥物上市，現(xiàn)有關(guān)于OA治療的藥物僅僅是緩解患者臨床癥狀和延緩病情發(fā)展。

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)中的重要結(jié)構(gòu)，由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)兩部分組成，發(fā)揮緩沖應(yīng)力、減少摩擦等一系列關(guān)節(jié)保護(hù)作用。OA的發(fā)生是由關(guān)節(jié)軟骨損害引起的，更深入的機(jī)制是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的修復(fù)速度低于關(guān)節(jié)軟骨的破壞速度，導(dǎo)致受損的關(guān)節(jié)軟骨無法修復(fù)[12-13]。本研究關(guān)注桃葉珊瑚苷在體外對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷可以抑制IL-1β引起的軟骨細(xì)胞凋亡，且抑制IL-1β引起的軟骨細(xì)胞中Bax表達(dá)升高和上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。Bcl-2蛋白家族成員在軟骨細(xì)胞的存活和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，Bax是Bcl-2家族中的促細(xì)胞凋亡蛋白，而Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白[14]。因此，桃葉珊瑚苷抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡可能與調(diào)控Bcl-2蛋白家族蛋白表達(dá)有關(guān)。

軟骨細(xì)胞在整個關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)新陳代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，但隨著年齡的增大，由軟骨細(xì)胞合成新軟骨基質(zhì)的能力下降而導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)的破壞[15]。另一方面，日積月累的軟骨創(chuàng)傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)有害物質(zhì)積累，引起軟骨細(xì)胞凋亡或活性下降，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨無法修復(fù)，最終引起OA[16]。此外，軟骨細(xì)胞還發(fā)揮著調(diào)控作用，能分泌一系列細(xì)胞生長因子和炎癥因子來發(fā)揮雙重作用，既通過對軟骨基質(zhì)的生長、分布、狀態(tài)等進(jìn)行調(diào)控而形成符合人體需要的關(guān)節(jié)軟骨，也會因被誘導(dǎo)分泌氧化物質(zhì)和炎癥細(xì)胞因子而破壞軟骨基質(zhì)。IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，不僅在OA患者關(guān)節(jié)軟骨、外周血以及滑膜組織中表達(dá)升高，而且參與OA發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，所以IL-1β抑制劑及拮抗IL-1β的藥物被用于治療OA。根據(jù)本研究的結(jié)果，IL-1β參與OA發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，而桃葉珊瑚苷可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，表明桃葉珊瑚苷具有治療OA的潛力。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷不僅在體外降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，而且在體內(nèi)延緩OA進(jìn)展、抑制關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)，這些研究結(jié)果表明桃葉珊瑚苷在體內(nèi)同樣具有治療OA的潛力，并且其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。桃葉珊瑚苷是多種中藥材的有效成分之一，也被認(rèn)定為評價某些中藥成藥質(zhì)量的重要指標(biāo)。隨著對中藥單體成分生理病理學(xué)研究的不斷深入，桃葉珊瑚苷被發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤以及抗凋亡等[17-18]。眾所周知，炎癥引起的軟骨細(xì)胞凋亡是OA發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，而既往研究也表明桃葉珊瑚苷在體內(nèi)具有抗炎作用。Gao等[19]在體外發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷可以通過抑制NF-κB 和Keap1/Nrf2信號通路的激活而抑制脂多糖誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在體內(nèi)，Wang等[20]同樣發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷通過阻礙Nrf2介導(dǎo)的炎癥信號傳導(dǎo)抑制創(chuàng)傷性腦損傷小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，桃葉珊瑚苷在體外顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)延緩小鼠OA疾病進(jìn)展，其機(jī)制可能與桃葉珊瑚苷通過抑制炎癥因子表達(dá)而抑制炎癥誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。