徐 昊，黃克強(qiáng)，黃 超

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院正畸科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

口腔癌是威脅全球公眾健康的一個(gè)重要因素，其發(fā)生與經(jīng)常飲酒、吸煙、不良修復(fù)體、常食燙熱食物、口腔疾病史等因素密切相關(guān)，約占體內(nèi)所有癌癥的1%～2%[1-2]。舌鱗狀細(xì)胞癌(Tongue squamous cell carcinoma，TSCC)在口腔癌中的發(fā)病率最高，尤其是TSCC晚期，腫瘤可向肺部等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。化療作為口腔癌重要治療方法之一，其毒性大、易產(chǎn)生多要耐藥性，面臨的主要問題是癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性下降。目前發(fā)現(xiàn)有許多中藥單體都具有抑制腫瘤生長的作用[3-4]。同時(shí)，天然植物中的藥物成分，因其單體成分的不良反應(yīng)小、治療范圍廣，可作為靶向治療舌癌的輔助甚至替代手段[5-6]。因此，尋找高效的中藥單體成分治療舌癌已成為研究熱點(diǎn)。橙皮苷(Hesperidin，HP)作為一種中藥單體成分，是一種可以從柑橘果皮中提取出的生物類黃酮，還可能提取自蕓香科、茜草科植物，具有降低毛細(xì)血管脆性和通透性、利尿、止痛及抑制多種腫瘤細(xì)胞的藥理作用[7-8]。本研究探討HP對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；橙皮苷(批號(hào)：20170212)購自上海沃凱生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司；垂直電泳儀購自美國Amersham Biosciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人舌癌Tca8113細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，2～3 d換液，直至細(xì)胞融合至培養(yǎng)皿底的85%左右。先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得半數(shù)抑制濃度，再進(jìn)行傳代并將其分成三組：對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入低劑量(30 μmol/L)和高劑量(60 μmol/L)HP處理24 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理同上。將人舌癌Tca8113細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，約5×103個(gè)/孔，隔夜加入不同濃度含HP的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μl CCK-8溶液以后繼續(xù)孵育2 h。然后將96孔板置于酶標(biāo)儀上并檢測(cè)450 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=OD值實(shí)驗(yàn)組/OD值對(duì)照組×100% 。

1.2.3 Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)：細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理同上。將人舌癌Tca8113細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，約1×105個(gè)/孔，隔天換液，直至細(xì)胞融合至50%左右，更換為含HP完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入5 μg/ml Hoechst33342染色液(500∶1)繼續(xù)孵育20 min，在熒光顯微鏡下拍照并記錄。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理同上。將人舌癌Tca8113細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，約3×105個(gè)/孔，隔天更換為含HP完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用1 ml不含EDTA胰蛋白酶消化，離心后加入流式緩沖液重懸細(xì)胞，向流式管中加5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，常溫暗室處理10 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白：細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理同上。將人舌癌Tca8113細(xì)胞接種在直徑為10 cm培養(yǎng)皿中，2～3 d換液，直至細(xì)胞融合至培養(yǎng)皿底的80%左右時(shí)加入含HP完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞并制備出磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白樣品。制備蛋白樣品后先將樣品進(jìn)行電泳，再將蛋白電濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用2% BSA進(jìn)行封閉后一抗4 ℃搖床16 h，二抗室溫?fù)u床2 h，最后ECL顯影。

2 結(jié) 果

2.1 三組細(xì)胞增殖活力比較 見圖1。將對(duì)照組細(xì)胞活力看作100%，經(jīng)30、60 μmol/L HP處理24 h后，舌癌Tca8113細(xì)胞的增殖活力受到不同程度的抑制(均P<0.01)。IC50值為45.50 μmol/L。

圖1 三組細(xì)胞增殖活力比較注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.2 三組細(xì)胞Hoechst33342染色結(jié)果 見圖2。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)均勻，胞核呈現(xiàn)出弱藍(lán)色熒光。HP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核固縮，部分胞核碎裂呈現(xiàn)出亮藍(lán)色熒光，凋亡數(shù)量明顯增加。

圖2 三組細(xì)胞Hoechst33342染色結(jié)果(×50)

2.3 三組細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見圖3。低劑量HP組和高劑量HP組細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)。

圖3 三組細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較注：左圖為電泳圖；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.4 三組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見圖4。低劑量HP組和高劑量HP組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(均P<0.01)。

圖4 三組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較注：左圖為電泳圖；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.5 三組細(xì)胞凋亡率比較 見圖5。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(7.23±0.90)%， 低劑量HP組和高劑量HP組細(xì)胞凋亡率分別為(16.46±1.47)%和(31.73±2.14)%，明顯高于對(duì)照組(均P<0.01)。

圖5 三組細(xì)胞凋亡率比較注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

3 討 論

舌癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病呈上升趨勢(shì)，臨床治療方法是以手術(shù)為主的綜合序列治療，并術(shù)后化學(xué)治療為輔，其化療藥物自身的不良反應(yīng)導(dǎo)致臨床效果并不理想，嚴(yán)重影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量[9]。HP是存在于多種天然植物中的重要功效成分。作為一種抗腫瘤化合物，它既能抑制肝癌、乳腺癌、直腸癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，又能誘導(dǎo)其凋亡，在治療和預(yù)防腫瘤方面的作用已經(jīng)引起科學(xué)家的關(guān)注[10-12]。

本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的結(jié)果顯示，經(jīng)30、60 μmol/L HP處理24 h后，Tca8113細(xì)胞的增殖活力明顯低于對(duì)照組。再用Hoechst33342染色液染色后觀察Tca8113細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞胞核呈現(xiàn)暗藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，而HP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核均呈現(xiàn)出亮藍(lán)色顆粒狀熒光，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞變扁，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮。我們進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，經(jīng)30、60 μmol/L HP處理24 h后，Tca8113細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比顯著增加，進(jìn)而證明HP能抑制人舌癌Tca8113細(xì)胞生長。

研究[13]對(duì)舌癌組織和配對(duì)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因1700個(gè)，下調(diào)基因2249個(gè)，京都基因與基因組百科全書分析表明這些差異表達(dá)基因主要富集在PI3K/AKT等通路中。PI3K/AKT信號(hào)通路可起到加快細(xì)胞新陳代謝、誘導(dǎo)血管生成以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長等作用，PI3K、AKT是信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，而AKT是一種蛋白激酶，磷酸化的PI3K和AKT還能加快腫瘤的發(fā)生[14-15]。本研究收集對(duì)照組和經(jīng)30、60 μmol/L HP處理24 h后的人舌癌Tca8113細(xì)胞制備成蛋白樣品后采用Western blot蛋白印跡法檢測(cè)關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比HP能降低Tca8113細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)量，從而抑制Tca8113細(xì)胞生長，這與熊果酸抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的結(jié)果一致[16]。

細(xì)胞凋亡是一種由基因主導(dǎo)的細(xì)胞程序化死亡過程，包括多個(gè)基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等，其形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為核碎裂、染色質(zhì)濃縮、出現(xiàn)凋亡小體等[17-18]。Bax是一種中樞細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子，是線粒體功能障礙不可或缺的門戶，也是控制正常細(xì)胞和癌細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族蛋白的主要促凋亡成員，Bcl-2和Bax可以通過形成同源或異源二聚體的形式來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2蛋白增加可以抑制細(xì)胞凋亡，而Bax蛋白增加可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。Bax可激活誘導(dǎo)線粒體膜通透性，引起凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。本研究采用Western blot檢測(cè)Tca8113細(xì)胞中Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比HP能夠促進(jìn)Bax活化并增加其蛋白表達(dá)水平，抑制Bcl-2活化并減少其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而通過線粒體途徑快速誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡。

綜上所述，HP可以有效抑制Tca8113細(xì)胞體外生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)有關(guān)，為臨床治療舌癌提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。