趙玉紅，邵 偉，吳淑華，李 勐

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.神經(jīng)外科，山東 濱州 256600)

星形細(xì)胞瘤是較常見的神經(jīng)上皮源性顱腦腫瘤，由膠質(zhì)細(xì)胞異常增生所致。根據(jù)異型特點(diǎn)及分化將其分成4個(gè)級(jí)別，Ⅰ級(jí)惡性水平最低，患者預(yù)后最佳；Ⅳ級(jí)則相反。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞通常呈浸潤性生長，手術(shù)無法完全切除，復(fù)發(fā)率較高[1]。雖然手術(shù)，放、化療等是治療膠質(zhì)瘤的常見方式，但療效不佳，1年生存率僅為57%[2]。因此，探究腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的臨床指導(dǎo)意義。Hippo-Yes相關(guān)蛋白(YAP)通路首次發(fā)現(xiàn)于果蠅中，其作用在于為細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)提供渠道,可以使細(xì)胞在繁殖與死亡時(shí)基本實(shí)現(xiàn)均衡。YAP1為該通路中介入轉(zhuǎn)錄的一種重要物質(zhì)，其單獨(dú)情況下不發(fā)揮作用，在人體中主要是以磷酸化的方式介入信號(hào)傳導(dǎo)工作。有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，YAP1能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)通路介入腫瘤細(xì)胞的繁殖[3-4]。為檢測(cè)人星形細(xì)胞瘤中是否也存在這種調(diào)節(jié)模式，本研究使用免疫組織化學(xué)(免疫組化)法檢查了人各級(jí)星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin的表達(dá)并分析了Hippo與Wnt信號(hào)路徑在星形細(xì)胞瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展中的作用，以及彼此間的影響與臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2013年1月至2020年12月本院收治的確診且有完整病理檢查資料的星形細(xì)胞瘤患者52例，其中男32例，女20例；年齡4～77歲，中位年齡36歲；Grade分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)18例。選取同期收治的腦減壓術(shù)后正常腦組織10例作為對(duì)照組。切取組織前均未經(jīng)放、化療，由2名副高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的病理醫(yī)師依據(jù)蘇木精-伊紅染色切片及蠟塊篩選確定入選病例。

1.1.2試劑 濃縮型YAP1一抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，兔抗人β-catenin即用型抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，陽離子防脫片、通用型二抗PV-6000、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(pH 8.0)修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。復(fù)染用蘇木素、分化液所需鹽酸、脫水涉及的不同濃度乙醇試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法 運(yùn)用免疫組化Elivision兩步法，篩選好的蠟塊以4 μm厚度切片并撈于免疫組化專用載玻片上，70 ℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水。用PBS沖洗3次，每次3 min。取出切片放置于高壓鍋乙二胺四乙酸(pH 8.0)修復(fù)液(按說明書標(biāo)準(zhǔn)配置)內(nèi)隔水熱修復(fù)13 min，冷卻至室溫后水洗切片，用PBS沖洗3次，每次3 min。3%過氧化氫液室溫孵育切片15 min后水洗，用PBS沖洗3次，每次3 min。滴加一抗(YAP1稀釋度為1∶200；β-catenin為即用型)后置于4 ℃冰箱過夜。次日由冰箱中取出復(fù)溫后水洗10 min后用PBS沖洗3次，每次3 min。滴加通用型二抗PV-6000，置37 ℃溫箱孵育30 min，取出后水洗5 min后用PBS沖洗3次，每次3 min。用新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，光學(xué)顯微鏡下控制，達(dá)到顯色標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)入水終止顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水封片。用前期篩選好的陽性切片進(jìn)行陽性對(duì)比，用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)比。

1.2.2結(jié)果判讀 邀請(qǐng)2名單獨(dú)的研究人員評(píng)價(jià)有關(guān)的免疫染色切片的得分，其對(duì)患者的臨床資料毫不了解。按染色強(qiáng)度除以陽性細(xì)胞獲得的結(jié)果核算分?jǐn)?shù)。使用陽性細(xì)胞百分比作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0為低于5%的細(xì)胞(弱陽性)，1+為5%～<25%的細(xì)胞(弱陽性)，2+為25%～50%的細(xì)胞(陽性)，3+為超過50%的細(xì)胞(強(qiáng)陽性)。利用著色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0為無染色，1+為淡黃色，2+為深黃色。參考染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)相加的數(shù)據(jù)得到相關(guān)化學(xué)染色得分標(biāo)準(zhǔn)：0～1為陰性，2+為弱陽性，3～4++為中度陽性，5+++為強(qiáng)陽性。

1.2.3用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因生存分析 OncoLnc屬于一種交互型嘗試生存關(guān)系的工具，使用在下載與mRNA、微小RNA或長鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)有關(guān)的臨床信息上。OncoLnc涵蓋了源于TCGA中記載的33種癌癥分析數(shù)據(jù)，累計(jì)納入了超過8 650例患者的生存信息及源于TCGA數(shù)據(jù)庫的mRNA與微小RNA的RNA-SEQ表達(dá)數(shù)據(jù)，其他源于MiTranscriptome beta數(shù)據(jù)庫的lncRNA表達(dá)也記載于其中。用戶可利用特定基因的表達(dá)對(duì)腫瘤患者實(shí)施分組處理，接著開展Kaplan-Meier研究或下載信息以便深入地開展研究。OncoLnc還保管了過去核算的生存資料，方便使用者在短時(shí)間內(nèi)查詢各種癌癥之間的生存關(guān)系。此數(shù)據(jù)庫可以使用戶在短時(shí)間內(nèi)查詢某種固定基因在不同種類癌癥中的表達(dá)，不僅如此，還能明確和其有關(guān)的新型lncRNA。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法等；采取Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤及正常腦組織中YAP1和β-catenin表達(dá)比較 正常腦組織中YAP1表達(dá)極少，主要著色部位為個(gè)別神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；β-catenin無明顯表達(dá)。星形細(xì)胞瘤中YAP1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，β-catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有表達(dá)，二者表達(dá)強(qiáng)度均隨腫瘤級(jí)別增高而增強(qiáng)。見圖1。

2.2YAP1和β-catenin表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 星形細(xì)胞瘤中YAP1的表達(dá)主要受腫瘤大小、分級(jí)影響，β-catenin的表達(dá)主要受腫瘤分級(jí)影響，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 YAP1表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3YAP1和β-catenin在不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性 星形細(xì)胞瘤中YAP1 和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.553，P<0.05)。見圖2。

表2 β-catenin表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4YAP1表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系 在低級(jí)別膠質(zhì)瘤、高級(jí)別膠質(zhì)瘤中YAP1高表達(dá)組患者生存期均較低表達(dá)組明顯縮短。見圖3。

3 討 論

Hippo信號(hào)通路由一系列保守激酶組成，是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡的關(guān)鍵通路，YAP1位于下游，是通路核心效應(yīng)分子。YAP廣泛存在于性腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，本身并不具有轉(zhuǎn)錄活性，其是用磷酸化的方式介入細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和下游靶分子的轉(zhuǎn)錄過程。Hippo-YAP1信號(hào)通路可與Wnt/β-catenin[5]、上皮生長因子受體[6]、磷酸肌醇-3激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白[7]、上游激活蛋白信號(hào)通路[8]等其他信號(hào)通路相互作用。Wnt/β-catenin通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞膜上的β-catenin可以與鈣粘蛋白E結(jié)合起到連接細(xì)胞的作用，也可以在Wnt通路中以下游因子的身份入核并在細(xì)胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[9]。通常情況下β-catenin位于降解形態(tài)時(shí)會(huì)讓細(xì)胞中保留較少的β-catenin。在獲得有關(guān)信號(hào)干預(yù)后β-catenin在細(xì)胞中無法被分解，如此將集中進(jìn)入細(xì)胞核中，干擾下游基因的轉(zhuǎn)錄?；罨腨AP1一般集中在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，但最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)YAP1也可通過促進(jìn)β-catenin降解、抑制Wnt信號(hào)通路的方式起到抑制腫瘤的作用[10]。

YAP1在多種腫瘤中表達(dá)增多影響腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后。MURAMATSU等[10]發(fā)現(xiàn)，在人類食管鱗癌染色體中YAP1基因能夠繁殖，形成高表達(dá)，增進(jìn)食管鱗癌的演化。LIU等[11]研究表明，YAP1在子宮頸鱗癌的細(xì)胞質(zhì)中為高表達(dá)，而在細(xì)胞核中正好相反；在子宮頸腺癌中YAP1呈現(xiàn)出細(xì)胞核高表達(dá)。因此，判定YAP1細(xì)胞定位與細(xì)胞功能密切相關(guān)。另有相關(guān)研究表明，胃癌中YAP1細(xì)胞核表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后影響因素[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中 YAP1作為促癌基因加速了腫瘤的進(jìn)展，但在乳腺癌中YAP1表達(dá)缺失，作為抑癌基因發(fā)揮作用[13-14]。BARRY等[15]和WANG等[16]研究表明，結(jié)腸癌患者中YAP1和β-catenin出現(xiàn)雙核陽性者生存期更短，提示YAP1在人結(jié)直腸癌中具有抑癌基因和促癌基因的雙重作用。ORR等[17]發(fā)現(xiàn)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中YAP1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常腦組織，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級(jí))中YAP1細(xì)胞核陽性率大于10%，且與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[18]。以往研究發(fā)現(xiàn)，YAP缺乏相關(guān)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不能單獨(dú)發(fā)揮作用，但YAP能通過與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，如TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Tead)結(jié)合而發(fā)揮作用[19]。Wnt通路失活的狀態(tài)下YAP與β-catenin的N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并一起移動(dòng)至細(xì)胞核中，YAP和β-catenin各自與Tead和 T細(xì)胞因子相互作用形成YAP-Tead-β-catenin-T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄；當(dāng)Wnt被激活時(shí)YAP和β-catenin從復(fù)合物中脫離出來，YAP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活Hippo通路，上游因子磷酸化YAP，參與Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)并阻礙β-catenin的核定位，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄活性。β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用依賴于Wnt蛋白的表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均可表達(dá)。而YAP1在腫瘤細(xì)胞中磷酸化前后也呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞定位。因此，YAP1在多種腫瘤形成中具有組織細(xì)胞特異性且作用并不明確，在不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中發(fā)揮抑癌還是促癌作用也不清楚。不同激活方式、涉及的下游通路決定了二者表達(dá)及相互作用時(shí)的多種定位組合；腫瘤類型也影響了YAP1和β-catenin的相互關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，YAP1主要定位于星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于正常腦組織。高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)明顯高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)。在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中YAP1細(xì)胞核陽性率明顯提高，相關(guān)生存分析也顯示了與文獻(xiàn)報(bào)道的高度一致性。此外，相關(guān)分析顯示，星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)，這意味著YAP1和β-catenin在星形細(xì)胞瘤的繁殖活動(dòng)中的確具有協(xié)同效果。進(jìn)一步與臨床參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，YAP1和β-catenin在星形細(xì)胞瘤的表達(dá)主要與腫瘤大小、級(jí)別相關(guān)，同時(shí)，YAP1和β-catenin的協(xié)同作用使患者壽命大為縮短。與前期多種相關(guān)研究結(jié)果較為吻合，為深入分析星形細(xì)胞瘤的發(fā)病原因奠定了理論基礎(chǔ)。但本研究也觀察到，YAP1主要在星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；β-catenin則主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中表達(dá)較少，越高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中β-catenin更傾向于集中在細(xì)胞膜上。二者在星形細(xì)胞瘤中呈現(xiàn)復(fù)雜的細(xì)胞定位。盡管如此，二者細(xì)胞定位的組合未影響其在腫瘤中的表達(dá)差異及相關(guān)性。涉及大腸癌的一篇文獻(xiàn)提到，Hippo下調(diào)和β-catenin上調(diào)是由于磷酸化后的YAP和存在于細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin結(jié)合后影響β-catenin的入核[20]。這就很好地解釋本研究在星形細(xì)胞瘤中觀察到的YAP1和β-catenin的細(xì)胞定位情況。

綜上所述，YAP1和β-catenin在人星形細(xì)胞瘤中有表達(dá)差異且呈正相關(guān)，不受二者細(xì)胞定位的影響，YAP1和β-catenin的協(xié)同表達(dá)影響患者預(yù)后，二者可作為調(diào)節(jié)星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)記。此外，鑒于本研究樣本數(shù)及研究方法的局限性，只初步探討了星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin在轉(zhuǎn)錄水平上的相互作用。而作為較易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤，星形細(xì)胞瘤的進(jìn)展很大程度上取決于血管增殖，新生血管的大量增加加速了腫瘤浸潤、生長并破壞周圍腦組織。Hippo信號(hào)通路能調(diào)節(jié)VEGF，β-catenin也可介入基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，這都是涉及血管形成的相關(guān)調(diào)控機(jī)制[21]。Hippo/YAP1和Wnt/β-catenin通路在星形細(xì)胞瘤血管增殖中發(fā)揮作用的具體過程及與其他信號(hào)通路的交互作用將是今后研究的重點(diǎn)。下一步計(jì)劃擴(kuò)充病例數(shù)，在分子水平上進(jìn)一步增加血管增殖方面的檢測(cè)，進(jìn)一步探尋干擾星形細(xì)胞瘤惡化進(jìn)展的結(jié)合點(diǎn)。