許煜晨，丁文文 ，賽那，劉晶，尹東閣，劉曼婷，彭胡麟玥，王開(kāi)心，楊玉暢，胡盼祥，倪健*，曲昌海*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 0488；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 000）

五味子為木蘭科植物五味子[

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”，臨床主要用于收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心，歸肺、心、腎經(jīng)。木脂素類(lèi)成分是五味子發(fā)揮多種功效的有效成分，具有心肌再灌注損傷的保護(hù)作用，可用于治療心肌梗死，可通過(guò)減少自由基的產(chǎn)生及抗氧化作用從而減少癲癇發(fā)作次數(shù)，通過(guò)減輕腦組織神經(jīng)元變性和脫失防治阿爾茨海默病，通過(guò)上調(diào)miR-101-5p的表達(dá)來(lái)減輕肝纖維化，縮短小鼠的睡眠潛伏期，且具有明顯的抗炎、抗焦慮作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子醇甲等木脂素類(lèi)成分對(duì)于高滲和炎癥引起的角膜上皮細(xì)胞損傷具有良好的保護(hù)作用，具有成為干眼癥有效治療藥物的潛力。但是，木脂素多為親脂性成分，在水中溶解性非常低，不利于滴眼給藥。而微乳作為一種新型給藥系統(tǒng)，在口服、黏膜、透皮、注射給藥及中藥制劑中均有廣泛應(yīng)用，能有效提高脂溶性藥物的溶解度和生物利用度，在干眼癥等眼表疾病的藥物遞送中也發(fā)揮著重要作用。因此，本文擬采用回流提取-大孔樹(shù)脂吸附工藝對(duì)五味子總木脂素進(jìn)行富集，并建立測(cè)定木脂素類(lèi)成分的HPLC 方法，以8 種成分的總含量為指標(biāo)對(duì)提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行總木脂素微乳的處方工藝研究，以期制備得到一種載藥量高、粒徑均勻的五味子木脂素微乳制劑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；FW-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；DHG-9023 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京天林恒泰科技有限公司）；FD-1A-80 ＋型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MS105DU 型萬(wàn)分之一天平[METTLER TOLEDO 儀器（上海）有限公司]；VM-504 型渦旋混合器（群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JY92-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZEN-3600 型馬爾文激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）；TDL-40B 型低速臺(tái)式大型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

五味子醇甲（批號(hào)：Y30N10H104712）、戈米辛D（批號(hào)：M05J9S65019）、五味子醇乙（批號(hào)：P4N10F103016）、當(dāng)歸酰戈米辛H（批號(hào)：P17J9F65870）、五味子酯乙（批號(hào)：P07M6S1）、五味子酚（批號(hào)：PJ0607SA13）、五味子甲素（批號(hào)：R12O8F45508）、五味子乙素（批號(hào)：Y26F11Y17148）（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司），乙腈、甲醇為色譜級(jí)（Fisher 公司），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），大豆油（上海源葉生物科技有限公司），吐溫-80（天津百倫斯生物技術(shù)有限公司），AB-8 大孔樹(shù)脂（東鴻化工有限公司），五味子飲片（安徽桐花堂中藥飲片科技有限公司），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為木蘭科植物五味子[

Schisandra chinensis

（

Turcz

.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)。

2 五味子提取物中8 種成分的測(cè)定

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent zorbax SB-C（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（C），梯度洗脫（0 ～17 min，50%A；17 ～30 min，50%→25%A；30 ～40 min，25%→40%A；40 ～45 min，40%→50%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL·min；柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素8 種對(duì)照品適量，精密稱定，置同一量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別約為0.23、0.02、0.06、0.04、0.05、0.01、0.02、0.03 mg·mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取五味子提取物凍干粉10 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。吸取適量過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑（甲醇）進(jìn)樣檢測(cè)。色譜圖見(jiàn)圖1，在樣品及對(duì)照品出峰處溶劑無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 混合對(duì)照品（A）、供試品（B）和空白溶劑（C）的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substance（A），test substance（B）and blank solvent（C）

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2、2.5、3、3.5、4 mL 混合對(duì)照品溶液，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。各成分在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 8 種木脂素成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity of 8 kinds of lignans

成分線性方程r線性范圍/（mg·mL －1）五味子醇甲y ＝1849.7x ＋150.54 0.9992 0.046 ～ 0.092戈米辛Dy ＝951.1x ＋3.23920.9993 0.004 ～ 0.008五味子醇乙y ＝1455.8x－10.742 0.9991 0.012 ～ 0.024當(dāng)歸酰戈米辛H y ＝1792.3x ＋6.6320.9992 0.008 ～ 0.016五味子酯乙y ＝1113.2x ＋14.605 0.9992 0.010 ～ 0.020五味子酚y ＝1379.4x－6.7640.9994 0.002 ～ 0.004五味子甲素y ＝1985.2x ＋42.636 0.9991 0.004 ～ 0.008五味子乙素y ＝1730.6x－21.432 0.9992 0.006 ～ 0.012

2.4.3 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素峰面積的

RSD

值分別為0.21%、0.43%、0.41%、1.5%、0.16%、0.31%、0.85%、1.3%，方法精密度良好。2.4.4 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素峰面積的

RSD

值分別為0.59%、0.70%、0.69%、0.54%、1.4%、2.3%、0.97%、0.71%，說(shuō)明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.4.5 重復(fù)性考察 取五味子提取物凍干粉，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素平均含量的

RSD

值分別為0.080%、0.63%、0.46%、0.20%、0.49%、1.4%、0.10%、0.37%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。2.4.6 加樣回收率考察 精密稱取五味子提取物凍干粉10 mg，共9 份，置25 mL 具塞錐形瓶中，分別加入混合對(duì)照品溶液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，使低、中、高濃度組中對(duì)照品加入量與凍干粉末量之比在0.8∶1、1∶1、1∶1.2 左右，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素平均回收率分別為96.7%～101.3%、97.5%～100.8%、96.6% ～103.1%、95.7% ～100.1%、97.1% ～102.5%、98.3% ～100.1%、98.9% ～102.9%、99.4%～102.0%，其

RSD

值分別為2.5%～2.6%、1.6% ～1.7%、3.6% ～3.9%、2.3% ～2.4%、2.7%～2.9%、0.99%～1.0%、0.010%～0.020%、0.010%～0.020%，方法準(zhǔn)確性良好。

3 五味子總木脂素的富集和微乳制備研究

在前期研究的基礎(chǔ)上，采用“95%乙醇回流提取-回收乙醇并濃縮-70%乙醇醇沉除雜-回收乙醇并濃縮-粗提液-AB-8 大孔樹(shù)脂柱洗脫-回收乙醇并濃縮-凍干”的提取純化工藝路線，對(duì)五味子中木脂素類(lèi)成分進(jìn)行富集。

3.1 五味子總木脂素的富集

3.1.1 提取和醇沉工藝 稱取五味子飲片適量，60℃鼓風(fēng)干燥3 h 后，粉碎成粗粉，備用。稱取上述五味子粗粉約50 g，置圓底燒瓶中，加入8倍量95%乙醇，回流提取2 次，每次1 h；合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至一定體積。向濃縮液中加入適量95%乙醇，調(diào)節(jié)醇濃度至70%，攪拌均勻并靜置24 h 后，抽濾；上清液減壓回收乙醇，并繼續(xù)濃縮至一定體積得到粗提液，備用。

3.1.2 大孔樹(shù)脂柱洗脫工藝 AB-8 大孔樹(shù)脂適量，裝柱，徑高比1∶8，對(duì)AB-8 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附率與靜態(tài)解吸率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其靜態(tài)吸附率為90.34%，靜態(tài)解吸率為67.64%，可知AB-8大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率較高，解吸性能中等，可通過(guò)增加洗脫溶劑的體積來(lái)增大解吸率。過(guò)柱洗脫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用去離子水與低濃度乙醇梯度洗脫的方式，可有效除去提取液中極性較大的成分，而不流失有效成分。當(dāng)用100 mL 的95%乙醇洗脫時(shí)，有效成分基本被完全洗脫，洗脫曲線如圖2 所示。因此確定本品的洗脫工藝如下：取粗提液適量，上樣，靜置使吸附完全；依次用去離子水50 mL、10%～50%乙醇各20 mL 洗脫，洗脫液棄去；取95%乙醇洗脫至100 mL，收集洗脫液，減壓濃縮至無(wú)醇味后轉(zhuǎn)移至西林瓶中，冷凍干燥72 h，即得五味子總木脂素凍干粉。

圖2 五味子總木脂素提取液洗脫曲線Fig 2 Elution curve of total lignans of Schisandrae Chinensis Fructus

3.1.3 各環(huán)節(jié)樣品及轉(zhuǎn)移率的測(cè)定 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別測(cè)定五味子飲片、95%醇提液、70%醇沉液、粗提液及凍干粉中8 種木脂素成分含量，計(jì)算各環(huán)節(jié)樣品中8 種成分的總含量以及轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。結(jié)果顯示，每一個(gè)提取環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)移率均較高，由飲片到凍干粉總體轉(zhuǎn)移率為66.1%。

表2 五味子總木脂素富集各環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)移率
Tab 2 Transfer rate of total lignans of Schisandrae Chinensis Fructus in each step

總體轉(zhuǎn)移率/%飲片49.82 g 13.54 mg·g－182.7－95%醇提液 1000 mL 0.6197 mg·mL－191.991.9 70%醇沉液 250 mL 2.2978 mg·mL－192.785.2粗提液 60 mL 9.3024 mg·mL－197.282.7凍干粉末 200 mg 445.74 mg·g－179.966.1提取工藝樣品量總木脂素含量每步轉(zhuǎn)移率/%

表3 五味子飲片及凍干粉中8 種木脂素成分含量
Tab 3 Contents of 8 lignans in decoction pieces and freeze-dried powder of Schisandrae Chinensis Fructus

化合物飲片/（mg·g－1） 凍干粉末/（mg·g－1）五味子醇甲 5.55245.20戈米辛D 0.37 14.16五味子醇乙 1.59 55.93當(dāng)歸酰戈米辛H 1.02 35.25五味子酯乙 1.26 37.98五味子酚 0.23 5.76五味子甲素 0.97 21.34五味子乙素 2.55 30.12五味子總木脂素13.54445.74

3.1.4 紫外分光光度法測(cè)定總木脂素含量 精密吸取配制的五味子乙素對(duì)照品0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分別置20 mL 比色管中，75 ℃水浴揮去甲醇，依次加入10%變色酸水溶液0.5 mL，濃硫酸3 mL，蒸餾水1.5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱30 min，溶液呈紫紅色，取出放置室溫，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，于570 nm 處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為

y

＝17.96

x

＋0.4246（

r

＝0.9991）。吸取樣品溶液0.5 mL，同法操作，測(cè)得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得到供試品質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL，樣品總木脂素的含量為60.85%，8 種木脂素類(lèi)成分總含量為44.57%，占總木脂素提取物的73.25%。

3.2 五味子總木脂素微乳的制備和評(píng)價(jià)

采用富集后的五味子總木脂素凍干粉，以大豆油為油相，吐溫-80 為表面活性劑，制備五味子總木脂素微乳。對(duì)油水比、表面活性劑用量等因素進(jìn)行考察，篩選出較優(yōu)的微乳處方；并通過(guò)測(cè)定粒徑、載藥量、離心穩(wěn)定性、pH 值等對(duì)所制得的微乳進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.2.1 油水比考察 稱取大豆油與吐溫-80 適量，置離心管中，渦旋1 min 混勻，分別加入0.9、1.9、2.9、3.9、4.9、5.9、6.9、7.9、8.9、9.9 g 純化水，渦旋1 min 混勻，得到初乳；初乳經(jīng)探針超聲乳化（150 W，3 min），得到終乳。觀察各管的外觀形態(tài)，并測(cè)定粒徑，結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)水相加入量為5.9 g，即油水比為1∶59 時(shí)，所得乳劑的粒徑發(fā)生突變，繼續(xù)增大水相比例，粒徑變化不大；因此選擇油水比為1∶59，進(jìn)行后續(xù)表面活性劑用量的考察。

表4 油水相比例考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Tab 4 Experimental results of oil-water phase ratio

序號(hào)大豆油/g 吐溫-80/g 水相/g 外觀形態(tài)平均粒徑/nm 10.100.680.90 半固體－20.100.681.90 淺黃色液體2203.3±83.80 30.100.682.90 淺黃色液體 916.6±79.50 40.100.683.90 白色液體 906.1±149.40 50.100.684.90 白色液體752.3±8.20 60.100.685.90 透明液體 478.3±33.50 70.100.686.90 乳白色液體437.1±9.60 80.100.687.90 乳白色液體 449.2±30.80 90.100.688.90 乳白色液體409.4±8.70 100.100.689.90 乳白色液體 439.9±15.50

3.2.2 表面活性劑用量篩選 稱取大豆油適量，置離心管中，分別加入0.06、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10 g 吐溫-80，渦旋1 min 使混勻，向各管中分別加入純化水5.90 g，渦旋1 min 混勻，得到初乳；初乳經(jīng)探針超聲乳化（150 W，3 min），得到終乳，結(jié)果見(jiàn)表5。當(dāng)吐溫-80 的用量為0.06、0.10、0.20 g 時(shí)，微乳粒徑均在300 nm 以下；但放置過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，表面活性劑含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致微乳分層，穩(wěn)定性不佳。綜合考慮，選擇表面活性劑吐溫-80 的用量為0.20 g。

表5 表面活性劑用量考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Tab 5 Experimental results of surfactant dosage investigation

序號(hào)大豆油/g 吐溫-80/g 水相/g外觀形態(tài)平均粒徑/nm 10.100.065.90 乳白色（輕微分層）200.4±2.50 20.100.105.90 乳白色（輕微分層）218.5±2.90 30.100.205.90 乳白色（不分層） 276.5±12.40 40.100.305.90 乳白色610.4±107.30 50.100.405.90 乳白色433.5±42.00 60.100.505.90 乳白色569.8±34.60 70.100.605.90 乳白色 1707±130.00 80.100.705.90 淡黃色588.2±29.10 90.100.805.90 淡黃色501.5±28.90 100.100.905.90 淡黃色406.6±21.30 110.101.005.90 淡黃色298.9±27.50 120.101.105.90 淡黃色130.9±40.30

3.2.3 五味子總木脂素微乳的制備 采用優(yōu)選的微乳處方工藝，進(jìn)行五味子總木脂素微乳的制備。處方如下：五味子總木脂素凍干粉0.04 g、大豆油0.1 g、吐溫-80 0.2 g、純化水5.9 g。按處方量稱取五味子總木脂素凍干粉、大豆油和吐溫-80，超聲溶解，渦旋混勻，加入處方量純化水，渦旋1 min 混勻，得到初乳；初乳經(jīng)探針超聲乳化（150 W，3 min），即得。

3.2.4 微乳的體外評(píng)價(jià) 采用納米粒徑儀測(cè)定五味子總木脂素微乳的粒徑，采用透射電鏡對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察，采用離心法測(cè)定其離心穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，五味子總木脂素微乳的pH 值為6.15；平均粒徑為（248.3±9.0）nm，粒徑分布圖見(jiàn)圖3；微乳外觀呈均勻的球形，形態(tài)良好，透射電鏡圖見(jiàn)圖4；經(jīng)4000 r·min離心15 min，所制得的微乳不產(chǎn)生分層，離心穩(wěn)定性良好。

圖3 五味子總木脂素微乳粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of Schisandrae Chinensis Fructus total lignans microemulsion

圖4 五味子總木脂素微乳透射電鏡圖Fig 4 Transmission electron microscopy of Schisandrae Chinensis Fructus total lignans microemulsion

3.2.5 含量測(cè)定 取微乳1.0 mL，置10 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲10 min 使破乳，甲醇定容至刻度。取該溶液，0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算本品中各成分含量。平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表6，微乳中8 種木脂素成分總含量為2.44 mg·mL。

表6 五味子總木脂素微乳中8種木脂素類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果(＝3)
Tab 6 Determination results of 8 kinds of lignans in total lignans microemulsion of Schisandrae Chinensis Fructus ( ＝3)

化合物含量平均值/（mg·mL－1）五味子醇甲1.35±0.005戈米辛D0.07±0.005五味子醇乙0.31±0.008當(dāng)歸酰戈米辛H0.19±0.005五味子酯乙0.20±0.005五味子酚0.03±0.005五味子甲素0.11±0.008五味子乙素0.18±0.008

4 討論

4.1 提取過(guò)程

本文采用了回流提取法對(duì)五味子中的木脂素類(lèi)成分進(jìn)行提取。在此過(guò)程中，提取后增加70%乙醇醇沉操作，可有效除去提取液中五味子油等高脂溶性成分，而不影響五味子木脂素類(lèi)成分的保留。

4.2 微乳油相及表面活性劑的選擇

制成五味子總木脂素微乳的過(guò)程中，選用大豆油作為油相、吐溫-80 作為表面活性劑、不加助表面活性劑。五味子總木脂素在各種單純油相中均難溶，有文獻(xiàn)記載大豆油可用作油相。黃芬等制備了以大豆油為油相的穩(wěn)定的食品級(jí)大豆油

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微乳。所以選擇實(shí)驗(yàn)室較常用的大豆油作為油相，且眼用制劑的要求低于靜脈注射，大豆油廣泛用于靜脈注射，較安全。眼用制劑一般選用無(wú)毒的非離子型表面活性劑，在親水基為聚氧乙烯基的非離子型表面活性劑中，以聚山梨酯類(lèi)溶血作用較小，聚山梨酯中吐溫-80 最安全，因此選用。已有文獻(xiàn)記載吐溫-80 可用于眼用微乳制劑，如張晶等選擇卵磷脂∶吐溫-80（3∶10）作為混合表面活性劑，制得的環(huán)孢素A眼用微乳理化性質(zhì)良好，符合眼用制劑要求。助表面活性劑一般為短鏈醇類(lèi)，常見(jiàn)的助表面活性劑有乙醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油等，有機(jī)溶劑大多有刺激性，因此本實(shí)驗(yàn)為了減小對(duì)眼部的刺激，制備的微乳不加助表面活性劑。

5 結(jié)論

本文經(jīng)提取、純化及微乳處方研究，制備得到含量約為2.44 mg·mL的五味子總木脂素微乳，平均粒徑約為248.3 nm。下一步擬將之用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，考察五味子總木脂素對(duì)于干眼癥所引起的角膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。