葛繼蕓，周艷卿，邱彥，王建，周瑾，李盛建，趙亮，曹青青*（.上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 0048；.上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院藥劑科，上海 0908；.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 000）

狼毒大戟又名貓眼睛，為大戟科大戟屬植物狼毒大戟（

Euphorbia fischeriana

Steud.）的干燥塊根，為多年生草本植物，主要生長于丘陵坡地以及林緣地帶。在我國主要分布于內(nèi)蒙古、東北及河北等地區(qū)，藥源充足，資源豐富?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載狼毒有泄水逐飲，破積殺蟲的功效，主治水腫腹脹，痰食蟲積，心腹疼痛，結(jié)核，疥癬等，但其味苦、辛，性平，有大毒，現(xiàn)代藥理學研究表明狼毒大戟具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗結(jié)核、免疫調(diào)節(jié)等作用，但由于大毒制約了其臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)。

近年來，國內(nèi)外諸多學者對狼毒大戟做了大量研究，狼毒大戟的臨床應(yīng)用也逐漸被人們重視。狼毒大戟主要以根入藥，故諸多研究主要基于狼毒大戟總提取物或提取部位探索活性，對于具體活性成分尚不明確。狼毒大戟的化學成分主要有二萜類、倍半萜類、苯乙酮類及黃酮類等，而對于單體化合物的活性成分研究報道不夠深入。為了擴大與利用狼毒大戟的臨床應(yīng)用與新藥開發(fā)，其單體化合物的研究顯得尤為重要。因此，本文采用色譜分離制備技術(shù)，對狼毒大戟的化學成分進行提取、分離、鑒別，同時采用MTT 法研究其單體化合物對肝癌細胞與乳腺癌細胞的毒性作用，旨在進一步探索狼毒大戟單體化合物的藥理作用，為臨床安全有效的應(yīng)用和藥材的進一步開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀、Agilent 6220飛行時間質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Bruker AVANCE Ⅲ 600 高分辨核磁共振波譜儀（德國布魯克科技有限公司）；SMART-N 超純水機（香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；CO培養(yǎng)箱（美國Thermo）；TS-100 搖床（海門其林貝爾）；Multiskan MK3 酶標儀（美國Thermo）；XDS-200倒置顯微鏡（上海蔡康光學）；全自動手持式細胞計數(shù)器Scepter 2.0（美國Millipore）；18 XW-80A型旋渦混合器（海門其林貝爾）；SB3200-T 超聲發(fā)生器（上?？茖?，50 kHz，120 W）；AE240 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒）。

1.2 試藥

所用試劑均為分析純（江蘇強盛功能化學股份有限公司），水為自制超純水。玻璃色譜柱（江蘇南通三晶玻璃儀器有限公司）；反相C硅膠（日本大曹株式會社）；柱色譜用硅膠、硅膠GF254 薄層板（山東煙臺江友化工有限公司）。

乳腺癌細胞株MDA-MB-231、Sum149、MCF-7、ZR-75-1、SKBr3、BT474、肝癌細胞株HepG2（南京科佰生物科技有限公司）；紫杉醇（北京譜析，純度：98%）；澳洲胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、PBS 溶液、0.5%胰蛋白酶（美國Gibco 公司）。

中藥狼毒大戟飲片購自安徽（產(chǎn)地西藏）；經(jīng)海軍軍醫(yī)大學藥學院生藥教研室的韓婷副教授鑒定為大戟科大戟屬植物狼毒大戟

Euphorbia fischeriana

Steud.的干燥根。標本存放于上海詩丹德生物技術(shù)公司留樣庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取和分離

取狼毒大戟藥材30 kg 粉碎后，用80%的乙醇于65℃下回流提取兩次，合并兩次提取液減壓回收至無乙醇殘留，得粗提液16 L。取粗提液2 L，加水使其混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，每次加入萃取溶劑2 L。合并各萃取層溶液，減壓回收溶劑，得石油醚浸膏80 g，乙酸乙酯浸膏90 g，正丁醇浸膏300 g。

取乙酸乙酯浸膏采用正相硅膠柱色譜分離，采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)從50∶1 逐漸過渡到1∶1 梯度洗脫，收集其中薄層點相似的流分，得到流分Fr1 ～Fr6；從Fr2 通過反相C硅膠柱（丙酮∶乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脫）分離得到化合物3（20 mg），7（33 mg），8（78 mg）；采用反相C硅膠柱從Fr3（氯仿-甲醇梯度洗脫）分離得到化合物1（21 mg），2（30 mg），4（38 mg）；從Fr4應(yīng)用反相C硅膠柱（氯仿-甲醇梯度洗脫）分離得到化合物6（34 mg）；從Fr5 應(yīng)用反相C硅膠柱（氯仿-甲醇梯度洗脫）分離得到化合物5（28 mg）；從Fr6 也通過反相C硅膠柱（氯仿-甲醇梯度洗脫）分離得到化合物9（26 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

對狼毒大戟中分離得到的9 個化合物進行MS、H-NMR 譜與C-NMR 譜的波譜數(shù)據(jù)采集，解析波譜數(shù)據(jù)并與參考文獻對比，推測化合物的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 9 個單體化合物的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of 9 compounds

化合物1：白色針晶，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為331.19 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：4.03（1H，s，11-H），3.67（1H，s，14-H），2.28（1H，s，9-H），2.08（3H，s，17-CH），0.93（3H，s，20-CH），0.85（3H，s，19-CH），0.82（3H，s，18-CH）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：169.6（C-16），148.6（C-13），130.3（C-15），85.2（C-12），66.1（C-8），60.9（C-11），55.4（C-14），53.5（C-5），48.0（C-9），41.3（C-1），39.2（C-10），39.2（C-3），35.6（C-7），33.5（C-4），33.5（C-18），21.9（C-19），20.8（C-6），18.4（C-2），15.4（C-20），8.7（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為巖大戟內(nèi)酯B?；衔?：黃色針晶，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為391.10 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：13.19（1H，s，4-OH），9.15（1H，s，6-OH），8.82（1H，s，6'-OH），6.02（1H，s，5-H），3.95（3H，s，2-OCH），3.84（3H，s，4'-OCH），3.74（2H，s，CH），2.66（3H，s，3'-COCH），2.63（3H，s，3-COCH），2.06（3H，s，5'-CH3）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：203.8，32.5（3-COCH），202.3，30.5（3'-COCH），163.0（C-6），162.7（C-4'），162.6（C-4），162.5（C-2'），160.6（C-6'），155.8（C-2），110.8（C-1'），110.7（C-5'），107.6（C-3'），105.2（C-1），105.2（C-3），92.4（C-5），64.7（4'-OCH），55.7（2-OCH），16.2（CH），8.7（5-CH）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為ebracteolatain A?；衔?：淺黃色針晶，CHO，ESI-MS的質(zhì)核比（

m/z

）為377.08 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：12.81（1H，s，4-OH），9.11（1H，s，6-OH），8.67（1H，s，6'-OH），6.32（1H，s，5'-OH），6.02（1H，s，5-OH），3.97（3H，s，2-OCH），3.84（3H，s，4'-OCH），3.71（2H，s，CH），2.61（3H，s，3-OCH），2.67（3H，s，3'-OCH）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：205.3，33.9（3-COCH），203.5，31.8（3'-COCH），166.1（C-2'），164.6（C-6），164.3（C-4），164.1（C-6'），163.9（C-4'），159.7（C-2），109.8（C-1'），106.6（C-3），104.0（C-1），104.0（C-3'），93.8（C-5'），93.8（C-5），66.1（2-COCH），57.1（4'-COCH），17.4（CH），該化合物5 號位上無甲基取代，其他位置的化學位移與ebracteolatain A 基本一致。HMBC 譜圖顯示，H-2 OCH（

δ

3.91）與C-2（

δ

159.7）相關(guān)，H-4'（

δ

3.84）與C-4（

δ

163.9）相關(guān)，H-5（

δ

6.02）與C-6（

δ

164.6）相關(guān)，H-5'（

δ

6.32）與C-6'（

δ

164.1）相關(guān)，H-6' OH（

δ

8.67）與C-5'（

δ

95.8）相關(guān)，進一步確認該化合物與ebracteolatain A 結(jié)構(gòu)相似。推測該化合物為3，3'-二乙?；?2，4'-二甲氧基-2'，4，6，6'-四羥基-二苯基甲烷。通過SciFinder 檢索未發(fā)現(xiàn)與該化合物結(jié)構(gòu)一致的文獻報道，故確認該化合物為新發(fā)現(xiàn)的化合物，且在狼毒大戟中首次報道。化合物4：無色細針晶，CHO，ESIMS 的質(zhì)核比（

m/z

）為409.38 [M-COOCH]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.18（1H，t，

J

＝3.6 Hz，H-12），4.45（1H，dd，

J

＝7.8 Hz，H-3），2.03（3H，s，CHCO），1.13（3H，s，CH-27），0.97（6H，s，CH-25，26），0.96（6H，s，CH-29，30），0.87（6H，s，CH-23，24），0.81（3H，s，CH-28）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：171.2（C-32），145.5（C-13），121.9（C-12），81.2（C-3），55.5（C-5），47.8（C-9），47.5（C-18），47.0（C-19），41.9（C-14），40.1（C-8），38.5（C-21），37.9（C-1），37.4（C-4），37.1（C-22），34.9（C-10），33.6（C-21），32.8（C-7），32.7（C-17），31.3（C-20），28.6（C-23），28.3（C-15），27.2（C-28），26.4（C-16），26.2（C-27），23.9（C-30），23.8（C-2），23.8（C-11），21.5（C-31），18.5（C-6），17.0（C-26），16.9（C-24），15.8（C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為

β

-香樹酯醇乙酸酯?；衔?：無色針晶，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為197.07 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，DMSO）

δ

：14.22（1H，s，2-OH），10.53（1H，s，4-OH），6.07（1H，s，H-5），3.78（3H，s，6-OCH），2.53（3H，s，1-COCH），1.88（3H，s，3-CH）；C-NMR（150 MHz，DMSO）

δ

：204.1，34.6（1-COCH），165.9（C-4），164.6（C-6），162.7（C-2），106.1（C-3），104.5（C-1），92.3（C-5），57.4（6-OCH），9.2（3-CH）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為狼毒乙素?；衔?：無色針晶，H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.35（1H，dd，

J

＝3.0，2.4 Hz，H-5），3.52（1H，tt，

J

＝10.8，4.2 Hz，H-3），1.00（3H，s，H-19），0.92（3H，d，

J

＝6.6 Hz，H-21），0.84（3H，t，

J

＝7.8 Hz，H-29），0.83（3H，d，

J

＝6.0 Hz，H-26），0.81（3H，d，

J

＝6.6 Hz，H-27），0.68（3H，s，H-18）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：140.8（C-5），121.7（C-6），71.8（C-3），56.8（C-14），56.1（C-17），45.9（C-24），42.3（C-4，13），39.8（C-12），37.3（C-1），36.5（C-10），36.2（C-20），33.7（C-22），31.9（C-7，8），31.7（C-2），29.2（C-25），28.3（C-23），26.1（C-16），24.3（C-15），23.1（C-28），21.1（C-11），19.8（C-26），19.4（C-19），19.1（C-27），18.8（C-21），12.0（C-29），11.9（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為

β

-谷甾醇?；衔?：黃色油狀，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為285.20 [M-H]。H-NMR（600 MHz）

δ

：6.71（1H，s，H-1），5.87（dd，

J

＝10.8，17.4 Hz，H-15），4.89（1H，dd，

J

＝1.2，10.8 Hz，H-16），4.98（1H，dd，

J

＝1.2，17.4 Hz，H-16），2.69 ～2.59（2H，m，H-6），2.11（3H，s，H-19），1.98 ～1.95（2H，m，H-11），1.77 ～1.72（1H，s，H-8），1.67 ～1.54（2H，s，H-7），1.46 ～1.42（1H，m，H-14），1.21 ～1.18（1H，m，H-14），1.02（3H，s，H-17），1.00（3H，s，H-20）；C-NMR（150 MHZ，CDCl）

δ

：151.3（C-15），140.9（C-2），140.6（C-10），140.0（C-3），127.3（C-5），122.7（C-4），109.0（C-16），109.0（C-1），39.8（C-14），36.6（C-9），36.5（C-8），36.5（C-13），34.3（C-11），33.1（C-12），27.0（C-6），25.8（C-7），22.9（C-17），21.5（C-20），11.5（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為euphebracteolatins A?；衔飁uphebracteolatins A 主要存在于月腺大戟中，首次在狼毒大戟中發(fā)現(xiàn)?；衔?：無色針晶，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為289.21 [M-H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.89（1H，d，

J

＝1.2 Hz，H-3），5.80（1H，dd，

J

＝5.4，10.8 Hz，H-15），4.95（1H，d，

J

＝1.2 Hz，H-5），4.92（1H，dd，

J

＝1.2，3.6 Hz，H-16），4.90（1H，dd，

J

＝0.6，10.8 Hz，H-16），1.21（3H，s，H-18），1.20（3H，s，H-20），1.02（3H，s，H-17），0.69（3H，s，H-19）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：183.9（C-2），173.3（C-4），150.0（C-15），117.3（C-3），109.5（C-16），89.9（C-5），43.3（C-7），41.0（C-14），39.6（C-10），39.4（C-8），39.4（C-9），39.1（C-6），36.0（C-13），31.7（C-12），30.0（C-20），28.5（C-11），22.6（C-17），18.9（C-19），18.8（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為fischeria A?；衔?：白色針晶，CHO，ESI-MS 的質(zhì)核比（

m/z

）為315.19 [M-H]。HNMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.47（1H，d，

J

＝5.4 Hz，H-11），3.71（1H，s，H-14），2.64（1H，d，

J

＝5.4 Hz，H-9），2.06（3H，s，H-17），0.95（3H，s，H-18），0.86（3H，s，H-19），0.73（3H，s，H-20）；CNMR（150 MHz，CDCl）

δ

：170.6（C-16），147.5（C-12），145.1（C-13），125.2（C-15），104.1（C-11），61.2（C-8），54.5（C-14），53.6（C-5），51.9（C-9），41.6（C-1），41.5（C-10），39.2（C-3），34.2（C-7），33.6（C-4），33.5（C-18），21.9（C-19），20.9（C-6），18.5（C-2），15.0（C-20），8.7（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，推測化合物為巖大戟內(nèi)酯A。

2.3 細胞毒活性實驗

采用MTT 法對狼毒大戟中提取得到的9 個單體化合物進行細胞毒活性評價，選取6 種類型乳腺癌細胞株（Her 2 陽性型SKBr 3 及BT 474、LuminalA 型MCF-7、LuminalB 型ZR-75-1、三陰性乳腺癌MDA-MB-231 及Sum149）及1 種肝癌細胞株HepG2。以紫杉醇為陽性對照藥。將上述7 種腫瘤細胞密度調(diào)整為5×10個·mL，接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL 細胞懸液，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察細胞貼壁且生長良好后，設(shè)置陽性對照組，空白對照組和各個不同濃度藥物的實驗組。配制1 ～9 化合物的母液濃度為5 mmol·L，紫杉醇母液濃度為3.5 mmol·L，將各化合物和紫杉醇母液稀釋得到8 個梯度濃度的樣品溶液（20、15、12.5、10、7.5、5、2、1 mol·L，分別作用于7 種腫瘤細胞，空白對照組中加等量培養(yǎng)基，每個劑量樣本設(shè)置6 個平行孔。分別置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，之后每孔加入MTT液（5 g·L）20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光，低速震蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀（波長492 nm）測定吸光度（

OD

）值，計算不同濃度的化合物對乳腺癌細胞的抑制率。細胞抑制率（%）＝[1－（加藥組

OD

值－調(diào)零孔

OD

值）/（對照組

OD

值－調(diào)零孔

OD

值）]×100%。由此計算陽性藥紫杉醇及化合物1 ～9 對不同腫瘤細胞的抑制率，并確定72 h 半數(shù)抑制濃度，結(jié)果如表1、2，圖2所示。

表1 9 個化合物對HepG2 和MCF-7 細胞生長的影響
Tab 1 Effect of 9 compounds on the growth of HepG2 and MCF-7 cells

注：“－”表示給藥濃度＞100 μmol·L。
Note：“－” indicates that the administration concentration is more than 100 μmol·L.

化合物IC50/（μmol·L－1）HepG2MCF-7 1－－2 61.83±0.1165.73±0.74 3 54.55±0.07616.71±0.121 4－－5－－6－－25.55±0.02919.62±0.117 8－－7 9－－紫杉醇＜1＜1

圖2 不同濃度的化合物2 和化合物3 對乳腺癌細胞株的抑制率Fig 2 Inhibition rate of compound 2 and compound 3 with different concentrations on the breast cancer cells

3 討論

為了進一步探索狼毒大戟的化學成分和藥理活性，本研究以中藥材狼毒大戟飲片作為研究對象，應(yīng)用多種色譜技術(shù)，從其乙醇總提物的乙酸乙酯萃取部位分離得到9 個單體化合物。通過化合物的理化性質(zhì)、質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻報道，分析鑒定了各單體化合物的化學結(jié)構(gòu)。單體化合物涉及的結(jié)構(gòu)類型有二萜類、三萜類、苯乙酮類、甾醇類，本研究已在SciFinder 中檢索，確認化合物3 是新發(fā)現(xiàn)的化合物，化合物7 為首次從狼毒大戟中分離得到。

諸多學者對狼毒大戟的抗腫瘤活性進行了研究，結(jié)果表明其提取物及單體化合物對肝癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞等具有顯著的抑制作用。本研究主要探索其狼毒大戟單體化合物對肝癌細胞和乳腺癌細胞的細胞毒活性。結(jié)果表明9 個單體化合物對肝癌細胞株HepG2 均無顯著細胞毒活性?；衔? 對乳腺癌細胞株的細胞毒活性作用均顯著，對乳腺癌細胞株BT474 的細胞毒活性效果最強，且其抑制效果呈濃度依賴性?；衔? 對乳腺癌細胞株Sum149、ZR-75-1 細胞毒活性明顯，對乳腺癌細胞株Sum149 的細胞毒活性較乳腺癌細胞株ZR-75-1 強?；衔? 對乳腺癌MCF-7 細胞有一定抑制作用。其他化合物對乳腺癌細胞株未表現(xiàn)出顯著抑制活性。

化合物3 的抗乳腺癌細胞毒活性與化合物2相比發(fā)生明顯變化，其對乳腺癌細胞株ZR-75-1細胞毒活性較化合物2 弱，而對Sum149 細胞的細胞毒活性較化合物2 強，且對其他乳腺癌細胞株均無明顯的細胞毒活性?；衔? 結(jié)構(gòu)較化合物2 在5'位上少了一個甲基，從化合物構(gòu)效關(guān)系上來看，化合物2 結(jié)構(gòu)中5'位上甲基對化合物的活性具有顯著影響。明確化合物的構(gòu)效關(guān)系有利于進一步探索化合物對腫瘤細胞毒性的作用機制。

綜上，盡管相關(guān)學者對狼毒大戟進行了大量研究，但針對其化學成分及活性的研究仍然是目前開發(fā)應(yīng)用的熱點。本研究進一步分析狼毒大戟的化學成分，篩選其單體化合物對肝癌細胞和乳腺癌細胞株的細胞毒活性，并初步探討其活性化合物的構(gòu)效關(guān)系，為深入開發(fā)狼毒大戟的中藥資源和臨床應(yīng)用提供參考。

表2 3 個化合物對乳腺癌細胞生長的影響
Tab 2 Effect of 3 compounds on the growth of the breast cancer cells

注：“20（30%）”表示給藥濃度20 μmol·L 時抑制率為30%。
Note：“20（30%）” indicates that the inhibition rate is 30% when the administration concentration is 20 μmol·L.

化合物IC50/（μmol·L－1）MDA-MB-231Sum149MCF-7ZR-75-1SKBr3BT474 2 5.41±0.265.47±0.17 5.73±0.74 3.49±0.5410.10±1.662.63±0.59 3 12.55±0.395.23±0.4416.71±0.1210.13±1.8013.69±2.67＞20（40%）5＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）紫杉醇1.72±0.092＜1＜11.89±0.110＜1＜1