張麗英，郭彩會(huì)，宋浩靜，劉亞麗（.河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 05005；.石家莊四藥有限公司，石家莊 0500）

氟康唑作為氟代三唑類(lèi)抗真菌藥物，主要是通過(guò)抑制真菌細(xì)胞膜合成受阻，進(jìn)而影響真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。因氟康唑具有抗真菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，口服吸收良好，在體內(nèi)分布廣，毒性低等特點(diǎn)，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)參考《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，研究氟康唑片的人體生物等效性。

1 材料與研究對(duì)象

1.1 試藥和儀器

氟康唑片受試制劑（T）（規(guī)格：150 mg /片，石家莊四藥有限公司，批號(hào)：FZ16120901）；氟康唑片參比制劑（R）（規(guī)格：150 mg /片，Pharmaceuticals LLC，批號(hào)：H79933）。氟康唑片化學(xué)對(duì)照品（純度：99.7%，批號(hào)：100314-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氟康唑片-d4（內(nèi)標(biāo)）（純度：98.7%，批號(hào)：1132-051A1，加拿大TLC Pharmaceutical Standards 公司）。空白基質(zhì)（人血漿和人全血，肝素鈉抗凝）均來(lái)自中國(guó)健康志愿者，由河北省人民醫(yī)院Ⅰ期臨床研究室提供。甲醇（HPLC 級(jí)）、乙腈（HPLC 級(jí)）、甲酸（LC/MS級(jí)）（賽默飛世爾科技有限公司），甲酸（色譜級(jí)，Aladdin）。

1.2 受試者選擇與入組完成情況

本試驗(yàn)方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[（2017）藥倫審第（02）號(hào)]。所有受試者均在充分了解本試驗(yàn)的目的、方法及風(fēng)險(xiǎn)后，自愿簽署知情同意書(shū)，年齡要求18 ～45 歲，單一性別受試者人數(shù)不少于總?cè)藬?shù)的 1/3，體質(zhì)量指數(shù)在19.0 ～26.0 kg·m；無(wú)濫用藥物史、藥物依賴(lài)史；近3 個(gè)月內(nèi)未參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)且未獻(xiàn)血；近2 周內(nèi)未服用任何藥物；統(tǒng)一進(jìn)行查體和實(shí)驗(yàn)室檢查，經(jīng)篩選合格并隨機(jī)納入空腹試驗(yàn)的受試者24 例，餐后試驗(yàn)的受試者因篩選困難，合格21 例，雖未滿(mǎn)足方案，但病例數(shù)符合相關(guān)法規(guī)要求。45 例受試者均按要求完成試驗(yàn)，空腹組與餐后組健康受試者的一般資料見(jiàn)表1。

表1 空腹組與高脂餐后組健康受試者的一般資料
Tab 1 General information of healthy subjects in the fasting group and the postprandial group

一般資料空腹組（n ＝24）餐后組（n ＝21）性別[n（%）]男15（62.5）12（57.1）女9（37.5）9（42.9）年齡/歲 30.2±6.09 29.0±7.76身高/cm168.50±9.103166.48±6.783體質(zhì)量/kg 64.29±8.523 62.33±8.558 BMI/（kg·m－2） 22.59±1.853 22.42±1.956

2 方法

2.1 給藥方案與血樣采集

本研究采用單中心、單劑量、隨機(jī)、開(kāi)放、兩周期、自身交叉對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)價(jià)氟康唑片在空腹及高脂餐后兩種狀態(tài)下的生物等效性研究?？崭菇M24 例，高脂餐組21 例，分別將空腹組和高脂餐組的健康受試者隨機(jī)分為兩組，交叉給藥，每周期給藥一次，洗脫期為 14 d?？崭菇M受試者空腹過(guò)夜 10 h 以上，服用相應(yīng)受試制劑或參比制劑150 mg，用 240 mL 水送服，于給藥前1 h 內(nèi)（0 h）和給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、6、12、24、36、48、72、96、120 h 采集靜脈血，每次取血約4 mL 至EDTA-K抗凝真空采血管中。高脂餐組受試者空腹過(guò)夜10 h 以上，于第2日早上在服藥前 30 min 開(kāi)始高脂（提供食物中約50%的熱量）高熱量餐（約800 ～1000 kcal）（高脂餐成分見(jiàn)表2，30 min 內(nèi)結(jié)束進(jìn)餐），在進(jìn)餐后30 min 時(shí)開(kāi)始服用相應(yīng)受試制劑或參比制劑，用水240 mL 送服，于高脂餐后服藥前（0 h）和給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、6、12、24、36、48、72、96、120 h 采集靜脈血，每次取血約4 mL 至EDTA-K抗凝的真空采血管中?？崭菇M和高脂餐組所采集的血樣在1 h 內(nèi)4℃、1700 g離心10 min，所有離心后血漿樣品分成兩份，在－60℃冰箱中保存，以供藥動(dòng)學(xué)分析。

表2 高脂餐成分表
Tab 2 Ingredient list of high fat meal

總熱量/kcal伊利純牛奶250 mL32 85.550167.5雨潤(rùn)臺(tái)式烤腸60 g 43.4 76.7 21.4141.5煮蛋約110 g 45.5 88.8 7.9142.2味出道牛角面包115 g 34.0283.6209.8527.4總計(jì)154.9534.6289.1978.6種類(lèi)總量蛋白質(zhì)/kcal脂肪/kcal碳水化合物/kcal

2.2 測(cè)定方法與血樣處理

2.2.1 色譜條件 色譜柱：GL Sciences InertSustain C（3 μm，2.1 mm×50 mm）；柱溫：40 ℃；閥R：初始值1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-100% 乙腈（B）；梯度洗脫（0 ～1.3 min，15.0%→50.0%B；1.3 ～1.6 min，50.0%→95.0%B；1.6 ～2.5 min，95.0%B；2.5 ～2.6 min，95.0%→15.0%B；2.6 ～3.5 min，15.0%B）；流速：0.4 mL·min；進(jìn)樣體積：3.0 μL；分析時(shí)間：3.5 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電離化模式：ESI；接口溫度：300 ℃；DL 溫度：250 ℃； 霧化氣流量：3.00 L·min；加熱氣流量：10.00 L·min；加熱塊溫度：400℃；干燥氣流量：10.00 L·min；分析模式：正離子模式（MRM）。氟康唑的離子對(duì)：307.10/220.10，駐留時(shí)間：100.0 ms，碰撞能量（CE）：－17.0 V；內(nèi)標(biāo)氟康唑-d4 的離子對(duì)：311.10/223.10，駐留時(shí)間：100.0 ms，碰撞能量（CE）：－18.0 V。

2.2.3 血漿樣品處理 樣品室溫下融化后，渦旋混勻，吸取30.0 μL 樣品（校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品或測(cè)試樣品）至96 孔板中，對(duì)于雙空白樣品或QC樣品，加入30.0 μL 空白基質(zhì)；加入30.0μL 內(nèi)標(biāo)溶液，對(duì)于雙空白樣品加入30.0 μL 50%ACN 溶液；加入180.0 μL 的100%乙腈，渦旋約10 min，在約4 ℃條件下2600 g 離心10 min；轉(zhuǎn)移30.0 μL 上清液至已加入270.0 μL 30%乙腈溶液的96 孔板中，渦旋5 min，待進(jìn)樣。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用WinNonlin 7.0 軟件對(duì)氟康唑的參比制劑和受試制劑的血藥濃度進(jìn)行非房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算分析，其他分析及作圖采用SAS 9.4軟件完成。采用BES，將主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

C

、

AUC

、

AUC

經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行方差分析和90%置信區(qū)間分析，將

t

進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)兩制劑的生物等效性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法的方法學(xué)驗(yàn)證由蘇州國(guó)辰科技股份有限公司生物分析部完成。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氟康唑的測(cè)定。氟康唑在10.0 ～5000 ng·mL與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果見(jiàn)表3。血漿樣品中氟康唑的提取回收率為95.0%～99.9%，內(nèi)標(biāo)氟康唑-d4 的回收率為 91.7%。氟康唑在 25 000 ng·mL濃度范圍內(nèi)，稀釋因子為 1∶10 時(shí)具有良好的稀釋可靠性。血漿樣本分別在－20℃和－80℃條件下儲(chǔ)存28 d、90 d 的穩(wěn)定性良好，血漿樣本在－60℃條件下經(jīng)過(guò)5 次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性良好；血漿樣本在處理前室溫條件下放置25 h 以及提取后在自動(dòng)進(jìn)樣器（溫度設(shè)置：4℃）放置94 h 穩(wěn)定性良好；全血樣本于冰浴條件下放置2 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好；溶血基質(zhì)效應(yīng)、高脂基質(zhì)效應(yīng)、殘留均不影響血漿中氟康唑的準(zhǔn)確定量。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本方法可用于臨床試驗(yàn)血漿樣品的分析。

表3 血漿中氟康唑的精密度和準(zhǔn)確度
Tab 3 Precision and accuracy of fluconazole in human plasma

質(zhì)量濃度/（ng·mL－1）批內(nèi)批間測(cè)定值/（ng·mL－1）RSD/%測(cè)定值/（ng·mL－1）RSD/%10.0 9.54±0.232.4 9.77±0.414.2 30.0 29.1±0.72.4 29.2±0.62.1 375375±30.80 368±113.0 20002110±733.52050±763.7 37503720±350.90 3620±1103.0

3.2 血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

空腹組和餐后組受試者口服受試制劑和參比制劑后，氟康唑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 空腹和高脂餐受試者口服受試制劑和參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(mean±SD)
Tab 4 Main pharmacokinetics parameters of fasting and high-fat diet subjects after the oral administration of the test and reference
preparations (mean±SD)

參數(shù)空腹組高脂餐組試驗(yàn)制劑（n ＝24）參比制劑（n ＝24）試驗(yàn)制劑（n ＝21）參比制劑（n ＝21）Cmax/（ng·mL－1）4287.08±1016.764052.92±723.383275.71±377.083373.33±439.46 AUC0 ～t /（×105 ng·h·mL－1）1.30±0.19 1.33±0.19 1.26±0.17 1.28±0.20 AUC0 ～∞/（×105 ng·h·mL－1）1.38±0.19 1.41±0.21 1.33±0.19 1.35±0.22 tmax/h0.50（0.25，2.5）1.00（0.25，3.00）3.00（1.5，6.00）3.00（1.0，6.0）t1/2/h28.8±3.529.5±4.227.9±4.827.7±3.9

圖1 健康受試者空腹（A）和餐后（B）單次口服150 mg 氟康唑片的平均血藥濃度-時(shí)間圖Fig 1 Mean plasma concentration-time diagram of a single oral dose of 150 mg fluconazole tablets in healthy subjects on a fasting stomach（A）and after a meal（B）

3.3 生物等效性分析

在空腹?fàn)顟B(tài)下口服氟康唑受試制劑和參比制劑的

C

、

AUC

及

AUC

的幾何均值的比值分別為104.64%、98.01%和97.64%，90%

CI

分別為97.04%～112.85%、96.57%～99.48%和 96.18%～99.12%，個(gè)體內(nèi)變異分別為15.32%、3.00%和3.04%。在餐后狀態(tài)下口服氟康唑受試藥物和參比藥物的

C

、

AUC

及

AUC

的幾何均值的比值分別為97.42%、98.65%和98.88%，90%

CI

分別為94.28% ～100.67%、95.90% ～101.48%和95.69%～102.17%，個(gè)體內(nèi)變異分別為 6.14%、5.30%和6.14%。與參比制劑比較，受試制劑

C

、

AUC

及

AUC

的90%置信區(qū)間均落在參比制劑的80.00%～125.00%，說(shuō)明兩種制劑具有生物等效性。

3.4 安全性評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)空腹組共有24 例受試者納入安全性評(píng)價(jià)，服用受試制劑后，有6 例受試者發(fā)生7 例次不良事件，分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高、心悸、惡心、上呼吸道感染、血脂升高、血小板升高、發(fā)熱，其中除前3 例不良事件研究者判斷與研究藥物可能無(wú)關(guān)外，其余均與研究藥物肯定無(wú)關(guān)。上呼吸道感染這一不良事件嚴(yán)重程度為Ⅱ級(jí)，其余均為Ⅰ級(jí)。因受試者的上呼吸道感染發(fā)生在洗脫期，口服感冒清熱軟膠囊后緩解，經(jīng)研究者分析，此藥物不影響氟康唑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，同意繼續(xù)進(jìn)入第二周期試驗(yàn)。服用參比制劑后，有3例受試者發(fā)生3 例次不良事件，分別為轉(zhuǎn)氨酶升高、尿上皮細(xì)胞升高、上呼吸道感染，其中轉(zhuǎn)氨酶升高與研究藥物可能有關(guān)，其余2 例與研究藥物肯定無(wú)關(guān)，嚴(yán)重程度均為Ⅰ級(jí)。

高脂餐后組共有21 例受試者納入安全性評(píng)價(jià)，服用受試制劑后，有4 例受試者發(fā)生4 例次不良事件，分別為尿潛血陽(yáng)性、智齒冠周炎、針刺傷、發(fā)熱，其中除尿潛血陽(yáng)性與研究藥物可能無(wú)關(guān)外，其余3 例均與研究藥物肯定無(wú)關(guān)。服用參比制劑后，有2 例受試者發(fā)生2 例次不良事件，1 例不良事件為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，判斷與研究藥物可能有關(guān)，另1 例為尿白細(xì)胞高，與研究藥物可能無(wú)關(guān)。受試制劑和參比制劑階段所有不良事件的嚴(yán)重程度均為Ⅰ級(jí)。

空腹組與餐后組均未發(fā)生嚴(yán)重不良事件和導(dǎo)致退出試驗(yàn)的不良事件。以上表明在空腹和餐后狀態(tài)下健康受試者單次口服150 mg 氟康唑受試制劑與參比制劑在體內(nèi)具有相似的安全性和耐受性。

4 討論

氟康唑是目前臨床上常用的抗真菌藥，本研究得出其血漿消除半衰期為30 h 左右，大約120 ～150 h 達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，所以目前臨床上每日給藥一次是科學(xué)合理的，但對(duì)于肝腎功能不全的患者，藥物的半衰期會(huì)明顯延長(zhǎng)，血藥濃度升高，易發(fā)生蓄積中毒，建議臨床上應(yīng)根據(jù)患者具體情況，通過(guò)監(jiān)測(cè)氟康唑的穩(wěn)態(tài)血藥濃度來(lái)調(diào)整用藥劑量。

氟康唑不良反應(yīng)主要有頭痛、頭暈、皮疹、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、肝腎功能異常、血液學(xué)指標(biāo)改變等，本研究中受試者出現(xiàn)的不良反應(yīng)有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高、心悸、惡心、尿潛血陽(yáng)性、轉(zhuǎn)氨酶升高，與說(shuō)明書(shū)中基本一致。臨床用藥后易產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)和中樞系統(tǒng)不良反應(yīng)，有時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷或血液系統(tǒng)疾病，故對(duì)于該藥可能會(huì)出現(xiàn)消化道系統(tǒng)的不良反應(yīng)的人群應(yīng)餐后服用，這樣可借助食物的作用避免藥物對(duì)消化道的刺激，對(duì)于接受氟康唑治療的患者建議定期檢查肝功能。

本研究氟康唑片血藥濃度的測(cè)定方法可靠，血漿樣本中的雜質(zhì)對(duì)氟康唑的測(cè)定無(wú)干擾，受試制劑和參比制劑

C

、

AUC

及

AUC

的幾何均值的比值90% 置信區(qū)間均落在參比制劑80.00%～125.00% 內(nèi)，表明本試驗(yàn)兩種制劑具有生物等效性。其研究結(jié)果的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，健康受試者在試驗(yàn)期間發(fā)生的不良事件也基本一致，為患者安全用藥提供了質(zhì)量保證。