莫清榮，任同偉，農(nóng)作榮，王 豪，黃 靜，陳 櫻，歐陽康，黃偉堅，韋祖樟

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

蓋他病毒(Getah virus，GETV)是披膜病毒科、甲病毒屬成員之一，為單股正鏈線形RNA病毒，呈典型的甲病毒結(jié)構(gòu)[1]。其主要是經(jīng)過吸血節(jié)肢動物(如蚊蟲等)對脊椎動物造成損害，主要感染的對象是豬和馬。感染母豬后導(dǎo)致母豬的繁殖系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，感染馬后導(dǎo)致馬匹出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、后肢腫脹以及皮疹等癥狀，同時對兩棲動物、鼠類以及爬行類和鳥類也具有感染性[2-3]。一年四季都有該病發(fā)生的報道，主要以7月～9月為高發(fā)期[4]。近年來，GETV迅速傳播，并多次在動物群體中引起疫情[5-9]。GETV顆粒為圓球形，直徑約為50 nm～70 nm，基因組長度約為11 kb～12 kb[10]，含有2個開放閱讀框(ORF)，首、末端分別為5′和3′非編碼區(qū)(UTR)，ORF1編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4)，ORF2編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白(Cap、6K、E3、E2、E1)[11]。在結(jié)構(gòu)蛋白中，衣殼蛋白Cap在病毒粒子的形成過程發(fā)揮著非常重要的作用[12]。E2蛋白是甲病毒重要囊膜蛋白的組成之一[13]，同時也是病毒的抗原識別位點和中和位點。

為制備Cap和E2蛋白的多克隆抗體，本研究將蓋他病毒Cap和E2蛋白基因連接至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，將純化好的重組蛋白皮下注入新西蘭大白兔，從而制備多克隆抗體，通過Western blot和間接免疫熒光(IFA)驗證多克隆抗體與病毒蛋白的反應(yīng)。本研究制備的多克隆抗體為GETV的血清學(xué)檢測方法提供了材料，也為GETV Cap和E2蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 從廣西大學(xué)實驗動物基地購入2只雌性新西蘭大白兔。

1.1.2 病毒、菌株、細(xì)胞與載體 GETV病毒GX201808由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室分離保存[10]；E.coliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞自CWBIO公司購入；豬腎細(xì)胞(PK-15)、乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、原核表達(dá)載體pET-32a(+)均由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 Ni瓊脂糖凝膠、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白Marker、RIPA細(xì)胞裂解液，康為世紀(jì)有限公司產(chǎn)品；HRP-山羊抗兔IgG，Abcam公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量，TaKaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶，NEB公司產(chǎn)品；IPTG，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、FITC Conjugate，全式金公司產(chǎn)品；PMSF(100 mmol/L)，碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 不同規(guī)格移液槍、低溫離心機，Eppendorf公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀和垂直電泳儀，Bio-RAD公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床細(xì)菌培養(yǎng)箱、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱和PCR儀，Thermo公司產(chǎn)品；超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 根據(jù)實驗室保存的GETV毒株 GX201808全基因組(GenBank登錄號：MT269657)設(shè)計Cap蛋白和E2蛋白的兩對特異性引物。Cap上游引物GETV -Cap-F：5′-CGGGATCCATGAATTACATCCCAACTCA-3′(下劃線為BamHⅠ的酶切位點)，下游引物GETV-Cap-R：5′-CCGGAATTCCCATTCTTCTGTTCCTT-3′(下劃線為EcoRⅠ的酶切位點)；E2上游引物GETV-E2-F：5′-CGGGATCCAG TGTGACGGAACACTT-3′(下劃線為內(nèi)酶切BamHⅠ位點)，下游引物GETV-E2-R：5′-CCGGAATTCGGCATGCGCTCGTGGCGCGCA-3′(下劃線為內(nèi)酶切EcoRⅠ位點)。在上海杰李生物有限公司進(jìn)行引物的合成過程，使用濃度均為10 pmol/μL。

1.2.2 RNA的提取和目的基因的擴增 用傳統(tǒng)法抽提提取GETV的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該產(chǎn)物為模板，擴增出Cap、E2基因。使用的反轉(zhuǎn)錄體系如下：5×MLV buffer 2.5 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 0.25 μL，dNTP mix 1 μL，Reverse primer 0.5 μL，酶抑制劑 RRI 0.25 μL，RNA模板8 μL。在42℃條件下反轉(zhuǎn)錄1 h。PCR擴增的模板為經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，反應(yīng)體系如下：cDNA模板 4 μL，dNTP 8 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，LATaq酶 0.5 μL，LA buffer 5 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min(35 cycles)；72℃ 7 min。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳正確后，使用DNA膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行回收。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a(+)載體和目的片段回收液同時使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用反應(yīng)液回收試劑盒對已經(jīng)酶切的產(chǎn)物進(jìn)行回收，在T4 DNA Ligase的作用下，16℃環(huán)境中連接8 h以上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有Amp+的LA平板，篩選出陽性菌落。對陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ和EcoRⅠ酶切正確后送至廣州華大公司進(jìn)行基因測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET-32a-Cap、pET-32a-E2分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，涂板，挑取平板上的單個菌落至4 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h～16 h。翌日，經(jīng)菌液PCR判定正確后以原始菌液：LB培養(yǎng)基為1∶100的比例將菌液體積擴大培養(yǎng)至200 mL中，置于37℃搖床中，200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 h～5 h，當(dāng)菌液的OD600nm值約達(dá)到0.6時向其中加入IPTG，使其在菌液中終濃度為0.5 mmol/L。在16℃、200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中進(jìn)行過夜誘導(dǎo)。4℃條件下，誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，使用8 mL PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行重懸后超聲，使全部菌體破碎完全，再經(jīng)4℃、8 000 r/min離心10 min后分離沉淀與上清。經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、染色后分析誘導(dǎo)的重組蛋白可溶性情況，以同樣條件下誘導(dǎo)的pET-32a(+)空載蛋白做陰性對照。

1.2.5 pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白的純化 將重組質(zhì)粒菌液以原始菌液與LB培養(yǎng)基比例為1∶100擴大培養(yǎng)至500 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4 h～5 h，加入IPTG后使得終濃度達(dá)到0.5 mmol/L，在16℃條件下進(jìn)行菌液誘導(dǎo)12 h～16 h。誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后用PBS重懸菌體沉淀，進(jìn)行超聲波完全破碎，8 000 r/min離心15 min后分別收集上清、沉淀。采用鎳柱純化蛋白說明書的操作，分別收集流穿峰和洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析純化后的效果。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定純化后的蛋白濃度。

1.2.6 多克隆抗體的制備 計算每只新西蘭大白兔以1 mg純化重組蛋白的劑量與完全弗氏佐劑等體積劑量完全乳化混勻，采取多點皮下注射的方式對試驗動物初次免疫，初次免疫后每隔10 d進(jìn)行增強免疫，后續(xù)免疫采取純化蛋白與不完全弗氏佐劑等體積劑量完全的乳化，直至第4次免疫后5 d采血，采集血清備用。同時采集陰性對照組的血清。

1.2.7 IFA鑒定多克隆抗體 將0.01 MOI的GETV病毒液接種至BHK-21細(xì)胞中，并設(shè)立陰性細(xì)胞對照孔，待陽性病變出現(xiàn)至30%左右時加入冰甲醇于4℃固定30 min，10 g/L BSA室溫封閉30 min后，以1∶100稀釋的Cap、E2多克隆抗體為一抗，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，用PBS清洗5次,每次振蕩清洗的時間為5 min，以1∶300稀釋的Goat anti-rabbit IgG(H+L)為二抗，37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，用PBS清洗5次，每次振蕩清洗時間為5 min。最后，將其置于熒光倒置顯微鏡下，觀察IFA的情況。

1.2.8 多克隆抗體效價的測定 對經(jīng)過4次免疫后的新西蘭大白兔心臟采血，疫后血清與陰性血清均經(jīng)ELISA測定其效價。首先，將GETV Cap/E2蛋白使用包被液包被于ELISA板，包被濃度為5 μg/(mL·孔)，每孔加入體積為100 μL，置于4℃包被過夜，PBST清洗5次。向各孔中加入300 μL封閉液后在37℃培養(yǎng)箱2 h，棄液，用PBST清洗5次。以免疫后血清和陰性血清作為一抗均從1∶500倍比稀釋至1∶64 000，每孔加入體積均為100 μL，孵育時間1 h，孵育條件為37℃培養(yǎng)箱。孵育結(jié)束后棄液，PBST洗5次。以HRP-山羊抗兔IgG為二抗按照1∶10 000稀釋，反應(yīng)45 min后，用PBST清洗5次。每孔加入100 μL的TMB顯色液，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育10 min后終止反應(yīng)，終止液加入體積為50 μL/孔。在450 nm波長下測定各孔中吸光值。當(dāng)四免后的兔血清OD450 nm值/陰性對照血清的OD450 nm值≥2.1即判定為陽性，其出現(xiàn)陽性最大的稀釋度作為該多克隆抗體的有效效價。

1.2.9 Western blot鑒定多克隆抗體 將GETV接種于PK-15細(xì)胞,待出現(xiàn)明顯病變后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次。按照PMSF與RIPA比例為1∶100的比例配制細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解PK-15細(xì)胞15 min，4℃條件下13 000 r/min離心10 min。將處理好的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PBST清洗PVDF膜5次。在37℃條件下，使用50 g/L的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，PBST充分振蕩洗滌5次。按照1∶1 000的比例使用10 g/L BSA 稀釋一抗兔血清，37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行2 h的孵育，PBST清洗5次。按照1∶10 000的比例用10 g/L脫脂奶粉稀釋HRP-山羊抗兔IgG二抗，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行1 h的孵育，PBST清洗5次。加入DAB工作液與PVDF膜充分接觸，在暗室條件下顯色3 min～5 min，立即通過Western blot蛋白印跡成像儀觀察并分析蛋白條帶，最后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以GETV病毒RNA為模板對Cap及E2基因進(jìn)行擴增，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，擴增出的Cap基因大小為804 bp,E2基因大小為1 266 bp(圖1A)。將經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的pET-32a(+)載體與雙酶切的目的片段進(jìn)行T4連接后，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，可見兩條帶(圖1B)。經(jīng)測序后鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pET-32a-Cap、pET-32a-E2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；A.1.Cap基因；2.E2基因；B.3.重組質(zhì)粒pET-32a-Cap雙酶切；4.重組質(zhì)粒pET-32a-E2雙酶切

2.2 重組質(zhì)粒的表達(dá)

IPTG誘導(dǎo)下重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中成功表達(dá)，誘導(dǎo)的pET-32a-Cap在48 ku處出現(xiàn)條帶，pET-32a-E2在64 ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，pET-32a在18 ku處表達(dá)了His標(biāo)簽大小(圖2)。

2.3 重組蛋白可溶性分析及純化

對2個重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，對破碎菌體后離心收集的上清樣品以及沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,pET-32a-Cap和pET-32a-E2均在上清表達(dá)，蛋白大小與預(yù)期相符，純化后得到較為單一的條帶。重組菌表達(dá)的上清目的蛋白經(jīng)鎳柱純化后得到的洗脫液按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度，pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白質(zhì)量濃度分別為1.03 mg/mL和0.8 mg/mL(圖3)。

2.4 IFA鑒定多克隆抗體的特異性

以GETV病毒液1∶100接毒至BHK-21細(xì)胞，四免后兔血清為一抗，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)為二抗，在熒光顯微鏡下觀察到感染的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，證明2種多克隆抗體均能夠識別GETV病毒產(chǎn)生的蛋白，且未感染病毒的細(xì)胞未見熒光(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的pET-32a空載；2.誘導(dǎo)的pET-32a空載；3.未誘導(dǎo)的pET-32a-Cap；4.誘導(dǎo)的pET-32a-Cap；5.未誘導(dǎo)的pET-32a-E2；6.誘導(dǎo)的pET-32a-E2

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1/2.誘導(dǎo)的pET-32a-Cap上清/沉淀；3.純化后的pET-32a-Cap蛋白；4/5.誘導(dǎo)的pET-32a-E2上清/沉淀；6.純化后的pET-32a-E2蛋白

Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombination proteins

A.Cap多克隆抗體對GETV感染細(xì)胞中Cap蛋白表達(dá)的IFA分析；B.GETV感染的BHK-21細(xì)胞中的白光；C.E2多克隆抗體對GETV感染細(xì)胞E2蛋白表達(dá)的IFA分析；D.GETV感染的BHK-21細(xì)胞中的白光；E/F.模擬感染BHK-21細(xì)胞中的熒光或白光對照

2.5 多克隆抗體的效價測定

新西蘭大白兔經(jīng)4次免疫后采集心臟血清，ELISA檢測免疫后的血清和陰性對照血清的效價，按照免疫后血清OD450 nm值/陰性對照血清OD450 nm值≥2.1判為陽性，出現(xiàn)陽性達(dá)到的最大稀釋梯度即該抗體的有效效價。結(jié)果顯示，所檢測的免疫后血清的效價均達(dá)到了1∶64 000，說明注射至新西蘭大白兔體內(nèi)的免疫抗原Cap、E2蛋白均取得了良好的免疫效果。

2.6 多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析

將純化后的多克隆抗體Cap和E2經(jīng)過純化，Western blot分析其特異性，表明制備并純化的多克隆抗體Cap和E2均能與GETV感染的PK-15細(xì)胞的細(xì)胞裂解物結(jié)合，并在Western blot蛋白印跡成像儀下觀察發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的條帶，出現(xiàn)在PDVF膜上的條帶大小與預(yù)期的蛋白條帶大小相一致，而未感染GETV的PK-15細(xì)胞沒有出現(xiàn)條帶，陰性對照成立(圖5)。

3 討論

甲病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)對病毒粒子的形成十分重要，與病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性密切相關(guān)，而且衣殼蛋白的構(gòu)象也決定了病毒包膜的裝配以及與包膜蛋白的相互作用[15]。E2蛋白是甲病毒重要囊膜蛋白的組成之一[13]，是主要的免疫保護(hù)性蛋白。近年來，對蓋他病毒流行病學(xué)、診斷制劑和致病機制的研究還不多，本試驗制備的蓋他病毒結(jié)構(gòu)蛋白多克隆抗體對蓋他病毒的研究具有實際意義。

A：1.Cap多克隆抗體對GETV感染的細(xì)胞裂解物的Western blot驗證；2.未感染GETV的細(xì)胞裂解物；B：1.E2多克隆抗體對GETV感染的細(xì)胞裂解物的Western blot驗證；2.未感染GETV的細(xì)胞裂解物

本研究用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，其自身攜帶的His標(biāo)簽?zāi)芘c鎳柱結(jié)合，有利于后續(xù)蛋白的純化。誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度、誘導(dǎo)時間以及溫度都會影響重組蛋白的表達(dá)[14]。誘導(dǎo)溫度對重組蛋白的表達(dá)影響較大，37℃～39℃為大腸埃希氏菌的最適生長溫度，但在此溫度下更容易使重組蛋白表達(dá)為包涵體。16℃低溫的條件使重組蛋白的表達(dá)變慢，但會增大重組蛋白表達(dá)為可溶性蛋白的可能性，本試驗選用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)過夜，重組pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白在上清中表達(dá)量較多。免疫動物前采用的完全弗氏佐劑與抗原蛋白1∶1混合充分形成乳液狀，目的是佐劑能夠使抗原在體內(nèi)留存時間更長，增加了抗原與宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞相遇的幾率，能夠誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)及局部炎癥反應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞增值。第1次免疫采用完全弗氏佐劑，其后采用不完全弗氏佐劑。

本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Cap和pET-32a-E2，并對重組蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了較高濃度和純度的重組蛋白。以在大腸埃希氏菌中高效表達(dá)的蓋他病毒蛋白為免疫抗原，通過多點皮下注射新西蘭大白兔制備了抗蓋他病毒多克隆抗體。IFA和Western blot結(jié)果顯示，所制備的抗蓋他病毒多克隆抗體能夠與蓋他病毒特異性結(jié)合。制備的重組蛋白及多克隆抗體對蓋他病毒檢測制劑和病毒蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。